선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- MTT 테스트는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 함유된 일련의 dehydrogenase에 의해 MTT가 formazan으로 전환되는 양을 분광학적으로 측정하는 방법이다.(1) 본 연구에서는 실험에 적합한 한약 처방의 전처리 농도를 결정하기에 앞서 Caco-2 세포에 대한 한약 처방의 안전성을 평가하기 위해 MTT 테스트를 실시하였다. Cac(广2 세포를 24-well plate에 3.
- confluent 한 상태에서 세포를 계속 배양하는 경우 세포와 세포 사이를 통한 이온의 이동 (para- cellular transport)이 감소함을 의미한다. 따라서 본 연구의 칼슘 net transport 실험은 paracellular transport를 최소화하기 위해 monolayer의 TEER 수치가 1000 ilcm2 이상인 16일째에 실시하였다.
- 본 논문에서는 자혈양근탕 (滋血養筋湯, JH) 및 양 혈장 근건 보환 (養血壯筋健步丸, YH) 처방제가 장내 칼슘흡수에 미치는 영향을 살펴보고자 인체 소장 상피 세포주 모델인 Caco-2 세포를 이용하여 칼슘 uptake와 net transport# 각기 평가하였으며. 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 본 연구에서는 소장내의 칼슘이 상피세포 융모막을 통해 세포내로 이동된 후 basolateral membrane을 통해 혈액 으로 빠져나오는 전과정을 대변하는 칼슘 net transport에 미치는 한약처방제의 영향을 평가하였다. Transwell membrane Hlter에서 16일간 배양한 Caco-2 세포에 양혈장 근건보환 및 자혈양근탕 처방제를 5, 50, 그리고 100 pg/ ml 농도로 6시간 동안 전처리한 후 칼슘 net transport를 측정하였다.
- 따라서 양혈 (養血) 및 양근 (養筋) 작용을 하는 한약은 골대 사와 관련이 있을 것으로 판단되었다. 본 연구에서는 이와 같이 골대 사와 관련이 있는 자혈양근탕 및 양 혈장 근건 보환 처방제가 장내 칼슘 흡수에 미치는 영향을 살펴보고자 인체 소장상피세포주인 Caco-2 세포를 이용하여 칼슘 uptake와 net transport에 미치는 효과를 각기 평가하였다.
제안 방법
- 인체대장암세포주인 Caco-2 세포는 분화가 되면 소장상 피세 포의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있다. Caco-2 세 포를 6-well plate에 3.5 x 10, 개씩 분주하고, 24일까지 배양하면서 소장 상피 융모막의 지표 효소인 alkaline phosphatase2^ y-glutamyl transferase, 그리고 sucrase 활성을 측정하였다. Alkaline phosphatase 활성은 4, 8, 16, 그리고 24일 후 각기 17.
- Caco-2 세포의 분화단계에 따른 칼슘 uptake의 활성을 비교하기 위해 Caccr2세포를 분주하여 4, 8, 16, 그리고 24일간 배양 시 킨 후 칼슘 uptake를 측정한 결과. 각각 1.
- 본 연구에서는 소장내의 칼슘이 상피세포 융모막을 통해 세포내로 이동된 후 basolateral membrane을 통해 혈액 으로 빠져나오는 전과정을 대변하는 칼슘 net transport에 미치는 한약처방제의 영향을 평가하였다. Transwell membrane Hlter에서 16일간 배양한 Caco-2 세포에 양혈장 근건보환 및 자혈양근탕 처방제를 5, 50, 그리고 100 pg/ ml 농도로 6시간 동안 전처리한 후 칼슘 net transport를 측정하였다. 양혈장근건보환 처방제로 전처리한 경우 대조 세포 (8.
- Transwell membrane filter에서 자라는 Caco~2 세포의 monolayer* 대상으로 tight-junction의 permeability를 평가하고자 ep就helial voltohmmeter (World Precision Instrumentse}, EVOM)를 사용하여 TEER (transepi- thelial electrical resistance)를 분주 후 18일까지 측정하였다.
- Upper chamber에 첨가된 칼슘이 세포를 통과해 lower 산 i amber로 빠져나온 속도를 측정하여 칼슘의 net transport를 측정하였으며, upper chamber] 사용된 배지의 조성은 다음과 같았다: 20 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5 mM KC1, 0.5 mM MgSO4, 3.5 mM 이ucose, 4 mM glutamine, 499 pM cold CaCl2 및 1 μM의 eCaCL. 한편, lower 사lumber에 사용된 용액의 조성은 다음과 같았다: 20 mM HEPES (pH 7.
- eGlutamyl transferase 활성은 Pillion 등⑼의 방법에 준해 시료 200 μ1에 11.1 mM glycylglycine과 2.8 mM L-y-glutamyl p-nitroanilide을 기질로 첨가하여 371X게 서 20분간 반응시킨 후 4P의 2N 아세트산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 생성된 p-nitroanilide의 양은 spe~ ctrophotometer를 이용하여 410 nm 에서 흡광도를 측정하여 구하였으며, 효소활성은 pmol .
- 인체대 장암세포주인 Caco-2 세포는 175 cm2 culture flask에서 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 unit/ml penicillin, 100 pg/ml streptomycin, 그리고 1% MEM non-essential amino acid를 함유한 DMEM (Dulbecco's modified Eeele's medium, Gibco) 배지를 사용하여 배양시켰다. 개별 실험을 위해 세 포주를 분주할 경우 confluent 한 상태의 세포를 0.25% trypsin과 0.3% ethylenediaminetetra acetic acid (E- DTA)가 함유된 phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)을 사용하여 분산시키고, 6-well plate의 각 well (35 mm dish)에 3.5 x 僧개의 세포를 넣고 배양하기 시작하였다. 세포배양은 5% CO2 가스가 존재하는 37"0 배양기에서 진행되었다.
- 3). 본 실험에 이용된 up- fake medium의 칼슘 농도는 0.5 mM이었으며, uptake medium에서 세포를 30분간 배양시킨 후 칼슘 uptake 활성을 측정하였다. 이와 같은 본 연구의 결과는 Caco-2 세 포의 칼슘 uptake 활성이 세포 분화가 진행됨에 따라 증가함을 보고한 Chirayath 등 23, 의 결과와 일치하는 것이다.
- 본 실험에 이용된 한약처방제가 Cac(广2 세포의 생존율에 미치는 영향을 평가하기 위해 자혈양근탕 (JH) 또는 양 혈장 근건 보환 (YH) 처방제를 본 실험에서 이용된 농도 중 가장 높은 100 肋nl로 세포에 24시간 전처리한 후 MTT 테스트를 실시하였다. 그 결과, 전처리한 세포의 생존율이 한약 처방제로 전처리하지 않은 대조 세포의 102 ± 9.
- 본 연구에서는 자혈양근탕 (滋血養筋湯, JH) 과 양혈장근 건보 환 (養血壯筋健步丸, YH) 의 두 가지 한약 처방제를 사용하였다. 자혈양근탕 (滋血養筋湯)은 숙지황 (熟地黃) 6 g.
- 소장상피세 포는 분화가 진행되면서 미소융모막을 형성하 게 되므로 융모막에서 다량 발현되는 alkaline phospha- tase와 y-glutamyl transferase, 그리고 sucrase 활성을 측정하여 소장 상피세포가 분화되는 정도의 지표로 사용하였다. 6-well plate에서 confluent 한 상태를 지나 일 정기 간 배양시킨 세포로부터 배양액을 제丁'한 다음 PBS로 세 포를 2회 세척하고, 다시 PBS 1 ml을 넣은 후 cell scrap- er를 이용하여 세포를 수거하였다.
- 한약처방의 농도에 따른 칼슘 uptake 활성 변화를 평가 하고자 6-well plate에서 16일간 배양한 Caco-2 세포를 0, 5, 50. 100 pg/ml 농도의 양혈장근건보환 처방제로 6시간 동안 전처리하였다.
대상 데이터
- 5 x 僧개의 세포를 넣고 배양하기 시작하였다. 세포배양은 5% CO2 가스가 존재하는 37"0 배양기에서 진행되었다.
- 인체대 장암세포주인 Caco-2 세포는 175 cm2 culture flask에서 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 unit/ml penicillin, 100 pg/ml streptomycin, 그리고 1% MEM non-essential amino acid를 함유한 DMEM (Dulbecco's modified Eeele's medium, Gibco) 배지를 사용하여 배양시켰다. 개별 실험을 위해 세 포주를 분주할 경우 confluent 한 상태의 세포를 0.
데이터처리
- 모든 분석 수치는 mean ± SEM으로 제시하였고, 수집된 자료는 SAS (Statistical Analysis System) PC 프로그램을 이용하여 통계 분석하였다. 한약 처방이 칼슘 uptake 또는 net transport에 미치는 영향은 ANOVA test에 의해 평가하였고, 한약 처방의 효과가 p <0.
- 모든 분석 수치는 mean ± SEM으로 제시하였고, 수집된 자료는 SAS (Statistical Analysis System) PC 프로그램을 이용하여 통계 분석하였다. 한약 처방이 칼슘 uptake 또는 net transport에 미치는 영향은 ANOVA test에 의해 평가하였고, 한약 처방의 효과가 p <0.05 수준에서 유의하게 나타난 경우, 각 실험조건에 따른 평균값의 차이는 Duncan's multiple range test에 의해 p <〔0.05 또는 p <0.001 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Sucrase 활성은 Conklin 등20)의 방법에 준해 glucose- E kit (영동제약, #BC103-E)를 사용하여 sucrose로부터 생성된 glucose의 양을 410 nm에서 측정하여 정량하였다. 효소활성은 pmol - mg protein 1.
- 세포 균 질액의 alkaline phosphatase 활성은 Bessy 등負 의 방법을 기초로 한 상업적 kit (Sigma사, #104-LL)를 이용하여 측정하였다. 즉 phosphatase 촉매 하에 p-ni- trophenyl phosphate 기질로부터 생성된 prEtrophenol을 알칼리 환경에서 노란색 화합물로 전환시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
- 세포의 단백질 함량을 측정하기 위해 동일한 조건에서 배 양 시 킨 3개의 well에 1ml의 deionized water를 첨가한 후 cell scraper를 이용하여 세포를 수거하였다. 얼음 위에서 초음파분쇄기를 이용하여 수거된 세포의 막을 파괴시켰으 며, 파괴된 세포액의 단백질 함량은 bovine serum al- bumin을 표준용액으로 하여 Bradford211 방법에 의한 BioRad assay kit 055611A)를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- mg protein으로 나타나 시간이 경과함에 따라 증가하였다. y-Glutamyl transferase 활성은 각기 10.3 ± 0.41, 16.9 ± 0.50, 18.8 ± 0.32, 그리고 19.0 ± 0.42 pmol - mg protein ' . hi■로 증가하였고, sucrase 활성 역시 0.7 ± 0.05, 1.4 ± 0.05, 1.6 ± 0.05, 그리고 1.7 ± 0.01 pmol . mg protein 1. hr '로 증가하여 Caco-2 세포는 분주 후 24일까지 분화가 계속됨을 알 수 있었다 1(Table 1). Rousset9'은 인체 소장 상피 세포주 중 특히 HT-29와 Caco-2 세포주에서 성숙한 소장 상피세포로의 분화 특성이 관찰되었다고 보고하였다.
- 본 실험에 이용된 한약처방제가 Cac(广2 세포의 생존율에 미치는 영향을 평가하기 위해 자혈양근탕 (JH) 또는 양 혈장 근건 보환 (YH) 처방제를 본 실험에서 이용된 농도 중 가장 높은 100 肋nl로 세포에 24시간 전처리한 후 MTT 테스트를 실시하였다. 그 결과, 전처리한 세포의 생존율이 한약 처방제로 전처리하지 않은 대조 세포의 102 ± 9.1% 또는 107 ±8.4%로 나타나 본 실험에 이용된 한약 처방제가 세포 생존율 에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다.
- 100 pg/ml 농도의 양혈장근건보환 처방제로 6시간 동안 전처리하였다. 그 결과, 칼슘 uptake 활성이 각각 2.26 ±0.10, 2.52 ±0.12, 2.57 ± 0.07, 그리고 2.78 ±0.16 nmole - mg protein ' . 30 min 으로 나타나, 100 Pg/ml 농도에서 대조세포에 비해 23% 증가된 칼슘 uptake 활성을 나타냈다.
- 그리고 24일간 배양시킨 Caco-2 세포를 uptake medium에서 5, 30. 그리고 60분 동안 배양시킨 결과, 세포의 분화 정도와 무관하게 칼슘 uptake 활성이 시간이 경과함에 따라 지속적으로 증가하여 60분째에 최고치를 나타내었다 (Fig. 2).
- 넷째, YH 또는 JH 처방제가 Caco-2 세포에 의한 칼슘 net transport에 미치는 영향을 평가하기 위해 5, 50, 100 Pg/ml 농도의 한약처방제로 6시간 동안 Caco-2 세포에 전 처리한 결과, 두 가지 한약처방제 모두 칼슘 net tran- sport에 유의적인 변화를 초래하지 않았다.
- 둘째, Caco-2 세포에 한약처방제를 50 pg/ml 농도로 일 정시간 동안 전처리하여 칼슘 uptake 활성을 측정한 결과, YH 처방제는 24시간 전처리 시 (29.9% 증가), 그리고 JH 처방제는 6시간 전처리 시 (23.9% 증가) 한약처방으로 전처리하지 않은 대조세포에 비해 칼슘 uptake가 유의적 으로 증가하였다.
- mg protein 1 - 30 min '으로 나타났다. 따라서 두 가지 한약 처방제 모두 1시간 동안 전처리 시 대조 세포에 비해 칼슘 uptake를 감소시켰으나, 그 이상의 기간 동안 전처리 시에는 칼슘 up-take를 증가시켰고, 양 혈장 근 건보 환 처방제의의 경우 24시간 전처리 시, 그리고 자혈양근탕의 경우 6시간 전처리 시 가장 높은 칼슘 uptake 활성을 나타냈다 (Fig. 4).
- 15 昭/ml에 불과하다. 따라서 본 연구의 칼슘 uptake실험에 0.5 mM의 Ca 농도 (20 Fg/ml) 가 사용된 점을 감안한다는 한약처방에 의한 무기질농도 증가분은 무시할 수 있를 것으로 생각된다. 아울러 세포내의 칼슘농도는 식사내의 칼슘 함량과는 무관하게 10'M 범위에서 매우 낮게 유지됨을 감안할 때, 한약처방에 함유된 무기질성분에 의해 Caco-2세포의 칼슘 흡수율이 영향을 받을 가능성은 희박한 것으로 사료된다.
- Rousset9'은 인체 소장 상피 세포주 중 특히 HT-29와 Caco-2 세포주에서 성숙한 소장 상피세포로의 분화 특성이 관찰되었다고 보고하였다. 본 실험의 결과에서도 소장 상피 융모막의 지표 효소인 alkaline phosphatase, y-glutamyl transferase 및 sucrase 활성이 배양 시간이 경과함에 따라 계속 증가하여 소장 상피 세포의 분화 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 본 연구의 결과 두 가지 한약처방제 모두 Caco-2 세포에 전처리한 결과 대조세포에 비해 칼슘 uptake는 23~28% 유의적으로 증가시켰으나, 칼슘 net transport에는 유의적인 영향을 미치지 못하였는데, 이는 한약처방제 전처리에 의해 더 많은 양의 칼슘이 소장상피세포내로 이동되어 저장 되었을 가능성을 제시해 주는 것이다. 양혈 및 양근작용을 하므로서 골대사에 관여할 것으로 추측되는 자혈양근탕 및 양혈 장근건보환 처방제는 결과적으로 소장상피세포를 통한 칼슘 흡수에 유의적인 영향을 미치지 않았음을 본 연구에서 확인할 수 있었고, 앞으로 이들 한약처방지가 골대사에 미치는 효과는 용골세포와 조골세포를 중심으로 규명되어져야 할 것으로 생각된다.
- 셋째, 한약처방의 농도를 달리하면서 6시간 동안 전처리 한 후 칼슘 uptake 활성을 측정한 결과, 대조세포에 비해 YH 또는 JH 처방제는 100 pg/ml (23% 증가) 및 50 Pg/ ml 농도 (28.3% 증가에서 칼슘 uptake 활성을 각기 최대 로 증가시켰다.
- 이상의 in vitro 연구 결과는 양혈 및 양근작용에 관여하는 자혈 양근탕 및 양혈장근건보환처방제가 소장상피세포를 통한 칼슘 uptake 활성은 증가시킨 한편 칼슘 net transport 활성에 변화를 초래하지 않았고, 결과적으로 장내 칼슘 흡수에 유의적인 영향을 미치지 않았음을 제시하는 것이다.
- 이상의 결과는 두 가지 한약처방제가 모두 소장상피세포 를 통한 칼슘 uptake를 증가시켰음을 제시하는 것이고, 칼 슘 uptake 증가 효과가 극대화되는 처방제의 농도 및 전처리 시간은 한약처방제의 종류에 따라 다소 다르게 나타남을 알 수 있다. 소장상피세포를 통한 칼슘 uptake에는 상피세 포 융모막에 존재하는 ca binding protein인 calmodu- lin이 관여하며 , 칼슘 uptake와 비타민 D와의 연관성에 관 하여는 아직까지 명확히 규명되고 있지 않다广 본 연구의 결과만으로 YH 또는 JH에 의해 Caco-2 세포의 칼슘 up- fake 가 증가한 이유를 명확히 추정하기는 어려우나, 이들 한약 처방이 calmodulin의 유전자 발현에 영향을 미쳤을 가능성을 제기할 수 있고, 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- Transwell membrane filter에서 monolayerS. 자란 Caco-2 세포의 tighteunction permeability를 측정하기 위해 TEER를 측정한 결과, 분주 후 4일부터 일차함수 관계로 증가하여 16일 이후에서는 1000 Qcm2 이상의 수치를 나타내었다 (Fig. 1). 이러한 결과는 Caco-2 세포를 분주 후 15일까지 배양하면서 TEER를 측정한 Fleet 와 Wood221의 보고와 일치하며.
- 첫째, Caco-2 세포를 분주 후 4, 8, 16, 그리고 24일간 배양하면서 칼슘 uptake 활성을 측정한 결과 분화가 진행될수록 uptake 활성이 증가하였다.
후속연구
- 이상의 결과는 두 가지 한약처방제가 모두 소장상피세포 를 통한 칼슘 uptake를 증가시켰음을 제시하는 것이고, 칼 슘 uptake 증가 효과가 극대화되는 처방제의 농도 및 전처리 시간은 한약처방제의 종류에 따라 다소 다르게 나타남을 알 수 있다. 소장상피세포를 통한 칼슘 uptake에는 상피세 포 융모막에 존재하는 ca binding protein인 calmodu- lin이 관여하며 , 칼슘 uptake와 비타민 D와의 연관성에 관 하여는 아직까지 명확히 규명되고 있지 않다广 본 연구의 결과만으로 YH 또는 JH에 의해 Caco-2 세포의 칼슘 up- fake 가 증가한 이유를 명확히 추정하기는 어려우나, 이들 한약 처방이 calmodulin의 유전자 발현에 영향을 미쳤을 가능성을 제기할 수 있고, 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 양혈 및 양근작용을 하므로서 골대사에 관여할 것으로 추측되는 자혈양근탕 및 양혈 장근건보환 처방제는 결과적으로 소장상피세포를 통한 칼슘 흡수에 유의적인 영향을 미치지 않았음을 본 연구에서 확인할 수 있었고, 앞으로 이들 한약처방지가 골대사에 미치는 효과는 용골세포와 조골세포를 중심으로 규명되어져야 할 것으로 생각된다. 아울러 다양한 한약처방제의 장기 또는 단기 복용이 장내 칼슘 흡수 및 체내 이용률에 미치는 효과를 평가하는 연구가 in vivo 실험을 통해 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과 두 가지 한약처방제 모두 Caco-2 세포에 전처리한 결과 대조세포에 비해 칼슘 uptake는 23~28% 유의적으로 증가시켰으나, 칼슘 net transport에는 유의적인 영향을 미치지 못하였는데, 이는 한약처방제 전처리에 의해 더 많은 양의 칼슘이 소장상피세포내로 이동되어 저장 되었을 가능성을 제시해 주는 것이다. 양혈 및 양근작용을 하므로서 골대사에 관여할 것으로 추측되는 자혈양근탕 및 양혈 장근건보환 처방제는 결과적으로 소장상피세포를 통한 칼슘 흡수에 유의적인 영향을 미치지 않았음을 본 연구에서 확인할 수 있었고, 앞으로 이들 한약처방지가 골대사에 미치는 효과는 용골세포와 조골세포를 중심으로 규명되어져야 할 것으로 생각된다. 아울러 다양한 한약처방제의 장기 또는 단기 복용이 장내 칼슘 흡수 및 체내 이용률에 미치는 효과를 평가하는 연구가 in vivo 실험을 통해 진행되어야 할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.