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문제 정의
- 다른 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-1β의 TJ에 대한 역할은 잘 알려져 있는데 반해, 장에서 높은 농도로 발견되며 국소적 염증반응을 일으키는 주요한 염증성 사이토카인 inter- leukin-1alpha (IL-1α)의 TJ에 대한 역할은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 IL-1α와 CCM이 소장의 TJ에 미치는 영향을 밝히고자 Caco-2 세포를 이용하여 TJ의 integrity와 para- cellular permeability를 측정하였다.
제안 방법
- Ⅱ.-1α 처리가 Caco-2 단층 세포의 TJ의 integrity에 미치는 영향을 검증하기 위하여 epithelial voltohmmeter (Millicell ERS system, Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 transepithelial electrical resistance (TEER)값을 측정하였다. Caco-2 세포를 collagen-coated polycarbonate membrane transwell inserts (0.
- Ⅱ.-1α 처리가 Caco-2 단층 세포의 물질 투과성 미치는 영향을 관찰하기 위하여 21일 동안 collagen-coated polycarbonate membrane transwell inserts (0.4 μm pore size, 12 mm mem- brane diameter)에 배양한 Caco-2 세포를 이용하여 실험하였다. DMSO (0.
- Ⅱ.-1α이 TJ를 통한 물질 이동에 미치는 영향 즉 TJ의 투과성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 FITC-dextran의 flux를 측정하였다. FITC-dextrane paracellular transport 경로를 통해 세포 단층의 상부에서 하부로 이동함으로 투과성이 높을수록 TJ이 느슨한 것으로 판단할 수 있다.
- CCM 전처리가 IL-1α이 TJ 손상을 억제하는지의 여부를 조사하기 위하여 20 μM의 CCM을 Caco-2 세포 단충 하부에 30 분간 전처리한 후 100 ng/ml의 IL-1α를 처리하여 TEER의 변화를 측정하였다. IL-1α 처리에 의한 TEER값의 감소는 CCM 전처리를 통해 억제되어 대조군의 TEER 값과 유사한 것으로 확인된 바 CCM의 IL-1α 활성에 대한 저해능을 확인할 수 있었다(Fig.
- Caco-2 세포 단층의 상층부에 IL-1α (100 ng/ml)를 24시간 처리하였을 때 TJ의 integrity의 변화를 확인하기 위하여 trans- epithelial electrical resistance (TEER)를 측정하였다. Caco-2 세포단층의 전기적 저항을 측정한 TEER 측정치는 TJ의 in- tegrity를 알아보는 지표이며 TEER 값이 클수록 integrity가 우수함을 나타낸다.
- -1α 처리가 Caco-2 세포의 증식(proliferation)에 미치는 영향을 측정하기 위하여 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl- 2, 5-di- phenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다[15]. Caco-2 세포를 대략 5×104cells/well의 농도로 24-well plate에 seeding한 후 21일 배양 후 IL-1α를 농도별(0, 1, 10, 50, 100 ng/ml)로 첨가하여 24시간 배양한 후 MTT 용액(5 mg/ml)을첨가하였다. 이 plate를 37oC에서 1시간 배양한 후 배지를 제거하고, DMSO를 첨가하여 formazan 결정을 용해시켜 micro- plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- IL-1α처리 24시간 후 배지를 모두 제거하고 transwell 상층부에 FITC-dextran (100 μg/ ml)을 넣고 배양시켜 세포막을 통과한 FITC-dextran (size of 4000 Da)의 형광도를 하층부 배지에서 측정하였다. FITC-dex- tran의 형광도는 excitation wavelength 485 nm와 emission wavelength 535 nm 조건으로 맞춘 fluorescence plate reader (Molecular Devices, Chicago, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. Caco-2 단층 세포의 물질 투과성(paracellular perme- ability)은 아래의 식을 통해 계산하여 “% of control”로 나타내었다.
- 1% DMSO나 20 μM CCM를 30분 동안 transwell 하층부(basolateral compartment)에 처리한 후 제거하고 100 ng/ml의 IL-1α를 transwell 상층부(apical com- partment)에 첨가하여 24시간 배양하였다. IL-1α와 CCM 처리에 따른 Caco-2 단층 세포의 전기 저항치(transepithelial elec- trical resistance, TEER)로 TJ integrity를 확인하였다.
- -1α를 apical compartment에 첨가하였다. IL-1α처리 24시간 후 배지를 모두 제거하고 transwell 상층부에 FITC-dextran (100 μg/ ml)을 넣고 배양시켜 세포막을 통과한 FITC-dextran (size of 4000 Da)의 형광도를 하층부 배지에서 측정하였다. FITC-dex- tran의 형광도는 excitation wavelength 485 nm와 emission wavelength 535 nm 조건으로 맞춘 fluorescence plate reader (Molecular Devices, Chicago, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.
- TEER 분석과 동일한 실험 조건에서 준비된 Caco-2 세포에서 TriZol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 to- tal RNA를 추출한 후 정량한 RNA를 SuperScript II kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. Reverse transcription mixture는 Invitrogen사의 protocol에 따라 준비하여 25oC에서 5분간 반응한 다음 42oC에서 50 분간반응 후 70oC에서 15분간 처리하여 반응을 종료하였다.
- 이 때 18S rRNA를 housekeeping 유전자로 internal control로 사용하였다. 각 증폭 산물들을 2% agarose gel을 이용하여 전기영동 하여 ethidium bromide로 염색한 후 ultra violet 파장 하에서 확인하였다.
- 항염증 효능이 있다고 알려진 CCM이 IL-1α 처리로 인해 증가한 TJ 투과성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 20 μM의 CCM을 30분간 전처리한 후 위와 동일하게 IL-1α를 24시간 처리하였다. Fig.
대상 데이터
- Caco-2 세포를 대략 5~10×104 cells/ well의 농도로 12- 또는 24-well plate에 seeding하였으며 2~3 일에 한번씩 배양배지를 교환하면서 21일 동안 배양하였다. Caco-2 세포는 seeding한 후 4~5일 후에 단층(monolayer) 세포를 형성하며 21~24일 배양 시 완전히 분화가 되며 분화가 완료된 세포를 실험에 사용하였다.
- 4 μm pore, Cat# 3401)는 Corning (Corning, NY, USA)의 제품을 사용하였다. Fluores- cein isothiocyannate-dextran (FITC-dextran, MW 4000 Da), curcumin (CCM), interleukin-1 alpha (IL-1α), dimethyl sulf- oxide (DMSO) 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- Human Caco-2 세포주는 American Type Culture Collec- tion에서 구입하였으며 1,000 IU/ml penicillin, 1,000 μg/ml streptomycin과 10 mM sodium pyruvate를 첨가한 10% FBS-DMEM 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 조건의 incubator 에서 계대배양하였다. Caco-2 세포를 대략 5~10×104 cells/ well의 농도로 12- 또는 24-well plate에 seeding하였으며 2~3 일에 한번씩 배양배지를 교환하면서 21일 동안 배양하였다.
- 25% trypsin-EDTA, penicillin-strepto- mycin, sodium pyruvate, fetal bovine serum (FBS) 등은 Thermo Scientific사(Waltham, MA, USA)의 제품을 사용하였다. Transwell permeable supports (0.4 μm pore, Cat# 3401)는 Corning (Corning, NY, USA)의 제품을 사용하였다. Fluores- cein isothiocyannate-dextran (FITC-dextran, MW 4000 Da), curcumin (CCM), interleukin-1 alpha (IL-1α), dimethyl sulf- oxide (DMSO) 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St.
- 세포배양 실험에 사용한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 0.25% trypsin-EDTA, penicillin-strepto- mycin, sodium pyruvate, fetal bovine serum (FBS) 등은 Thermo Scientific사(Waltham, MA, USA)의 제품을 사용하였다. Transwell permeable supports (0.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 통계 분석은 SAS 9.
- 모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 통계 분석은 SAS 9.4 프로그램을 이용하여 분산분석 후 Dunnette t-test를 실시하여 α=0.05의 수준에서 통계학적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Ⅱ.-1α 처리가 Caco-2 세포의 증식(proliferation)에 미치는 영향을 측정하기 위하여 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl- 2, 5-di- phenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다[15]. Caco-2 세포를 대략 5×104cells/well의 농도로 24-well plate에 seeding한 후 21일 배양 후 IL-1α를 농도별(0, 1, 10, 50, 100 ng/ml)로 첨가하여 24시간 배양한 후 MTT 용액(5 mg/ml)을첨가하였다.
- Reverse transcription mixture는 Invitrogen사의 protocol에 따라 준비하여 25oC에서 5분간 반응한 다음 42oC에서 50 분간반응 후 70oC에서 15분간 처리하여 반응을 종료하였다. Rev- erse transcription reaction으로 합성된 cDNA를 template로 사용하여 관심 유전자를 thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 각 PCR 단계는 denaturation (96oC에서 30초), annealing (60oC에서 30 초), extension (72oC에서 30초)의 조건으로 설정하여 이 단계를 18S RNA 유전자 증폭은 28 cycles을 TNF-α와 IL-6 유전자 증폭은 35 cycles을 반복하였다.
성능/효과
- (A) IL-1α (100 ng/ml) led decrease in TEER but CCM pretreatment prevented IL-1 α action. (B) Gene expression of inflammatory cyto- kines were upregulated by IL-1α(100 ng/ml) treatment but CCM pretreatment prevented it. Data represent means ± SD(n=3).
- Ⅱ.-1α 처리에 의한 Caco-2 세포의 cell viability 다양한 농도(0, 1, 10, 50, 100 ng/ml)의 IL-1α를 24시간 처리한 후 세포생존율을 평가한 결과 1 ng/ml 이상의 농도에서는 대략 20%의 세포생존율이 저해함을 확인하였다(Fig. 1). 그러나 특이적으로 농도 의존적인 관계를 보이지 않았다.
- 17, 18]. Fig. 3B의 결과에 따르면 IL-1α 처리는 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-6의 유전자발현을 상승시켰으나 항염증 물질로 알려진 CCM 전처리는 IL-1α의 TNF-α와 IL-6 유전자 발현에 미치는 영향을 억제함을 확인하였다. Ⅱ.
- 측정하였다. IL-1α 처리에 의한 TEER값의 감소는 CCM 전처리를 통해 억제되어 대조군의 TEER 값과 유사한 것으로 확인된 바 CCM의 IL-1α 활성에 대한 저해능을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 이는 Fig.
- Caco-2 세포단층의 전기적 저항을 측정한 TEER 측정치는 TJ의 in- tegrity를 알아보는 지표이며 TEER 값이 클수록 integrity가 우수함을 나타낸다. TEER측정 실험에서 IL-1α의 처리에 의해 TEER값이 Caco-2 세포 단층에서 확인되는 기본 TEER값보다약 16% 이상 유의적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 3). 이 결과는 Fig.
- Rev- erse transcription reaction으로 합성된 cDNA를 template로 사용하여 관심 유전자를 thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 각 PCR 단계는 denaturation (96oC에서 30초), annealing (60oC에서 30 초), extension (72oC에서 30초)의 조건으로 설정하여 이 단계를 18S RNA 유전자 증폭은 28 cycles을 TNF-α와 IL-6 유전자 증폭은 35 cycles을 반복하였다. PCR에서 사용한 primer의 염기서열정보는 다음과 같다.
- 2A에 나타내었다. 대조군에서 시간이 경과함에 따라 FITC-dextran이 단층 상부에서 하부로 이동하였고 8시간 이후 유의적인 결과를 관찰할 수 있었다. 반면 IL-1α 처리군에서는 대조군에서 관찰되는 정상적인 TJ을 통한 FITC-dextran의 이동에 비해 빠르게 FITC- dextran이 이동함을 관찰하였고 처리 2시간 이후부터 유의적인 차이를 나타내었다(Fig.
- 본 연구는 염증성 사이토카인 IL-1α의 TJ에 대한 역할을 처음으로 밝히고 IL-1α에 의한 TJ integrity 감소가 CCM 전처리로 거의 완전히 예방될 수 있음을 밝혔다. 염증성 사이토카인의 TJ 손상이 TJ 구성단백질의 발현을 감소시킨다고 알려져있으므로 IL-1α가 TJ 구성단백질의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 그리고 작용 기작이 무엇인지를 밝히는 추가 연구가 필요하다고 사료된다.
- 3). 이 결과는 Fig. 2에서 관찰된 결과와 동일하며, IL-1α가 Caco-2 세포 단층의 TJ을 손상시킴을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과를 통하여 관찰된 IL-1α 처리에 의한 TJ의 손상 및 CCM 전처리를 통한 억제는 기존 연구에서 보고된 염증성사이토카인인 IL-6, IL-1β와 TNF-α에 의한 TJ integrity 감소와 유사하였다[1-4, 17, 18]. Fig.
후속연구
- 거의 완전히 예방될 수 있음을 밝혔다. 염증성 사이토카인의 TJ 손상이 TJ 구성단백질의 발현을 감소시킨다고 알려져있으므로 IL-1α가 TJ 구성단백질의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 그리고 작용 기작이 무엇인지를 밝히는 추가 연구가 필요하다고 사료된다.
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