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문제 정의
- 이러한 -사실은 각 균주의 항균 활성의 차이는 숙주의 염색체 DNA에 삽입된 defensin 유전자의 copy 수와 밀접한 상관이 있음을 시사한다. 따라서 본 연구실에서는 이들 균주들에 재조합되어 삽입된 defensin 유전자의 copy 수를 분석하고 이를 이용하여 항균 활성이 강력한 균주를 선별할 계획이다. 또한 Pichia에서 발현 분비된 defensin을 정제하여 아미노산 서열을 분석하고 이를 통하여 MFal의 prepro sequence를 이용하여 Rc/rig에서도 단백질 혹은 펩티드의 분비계가 S.
- 본 논문에서는 효과적인 항균 펩티드의 생산을 위한 생물계를 확립하기 위한 모델계로서 P- pastoris를 숙주로 사용하여 곤충유래 항균 펩티드인 defensin을 활성형으로 분비한 내용에 관해 보고하고자 한다.
- 생성된 항균 펩티드를 세포 외로 분비시키기 위해 효모의 MFrI preprosequence를 이용하고자 하였다. 제한효소 BamHI 인식 부위를 함유하는 5' primer (CGAAGGAT- CCAAACGATGAG)와 Xbal 인식 부위를 함유하는 3' primer (GCCTCTAGAGAGATACCCCTTC)를 사용하여 Pichia용 발현 넥타인 pPIC9K를 template로 사용하여 QIAGEN (Valencia, CA, U.
제안 방법
- 00004%biotin)에서 30℃ 에서 96시간 진탕배양하였다. 24시간 간격으로 배양액을 채취하여 600 run에서 흡광도를 재어서 세포 성장을 측정한 후 원심분리하여 상등액을 회수하여 항균활성을 측정하였다.
- 1에 나타내었다. 40개의 아미노산으로 구성된 defensin 뿐만 아니라 defensin의 아미노말단에 MFqI의 prepro sequence 카르복시말단에서 유래한 아미노산 Leu- Asp-Lys-Arg 4개를 추가하였다 [21]. 본래 Leu의 codon인 TTG를 CTA로 바꾸어 아미노산 서열은 변하지 않고 Xbal 인식 부위를 새로이 만들어 MFα1의 prepro sequence과 연결을 용이하게 하였다.
- 40개의 아미노산으로 구성된 mature defensin을 coding하는 유전자를 하나의 올리고머로 화학 합성하는 것이 기술적으로 불가능하므로 올리고머 Fl, Rl, F2, R2, F3, 및 R3로 나누어 합성하였으며 defensin 유전자의 5’ 과 3’ 말단에 해당되는 올리고머 F1 와 R3의 5’ 과 3'말단에는 제한효소 인식부위 Xbal과 EcoRI이 각각 함유되게 합성하였다. 여섯 개의 올리고머로 나누어 합성한 difensin 유전자는 우선 중간 부위에 해당하는 올리고머 F2와 R2 가닥의 5’ 말단을 동시에 인산화시키고 모든 올리고머를 같은 농도로 섞고 65℃로 5분간 가열한 후 상온까지 서서히 냉각하였다.
- Defensin 유전자가전사되어 생성된 mRNA를 확인하기 위해 위의 균주에서 분리한 전체 RNA를 template로 사용하여 RT-PCR을 수행하고 hybridization으로 확인한 결과를 Fig. 5A와 5B에 각각 나타내었다. 그림 5A는 RT-PCR후 생성물을 아가로스겔 전기영동으로 확인한 것으로 lane 1은 100 bp ladder이고 lane 2는 양성대조군으로 MFol prepro sequence와 defensin 유전자를 함유한 360 bp DNA 단편이고 lane 3은 음성 대조군인 pPIC9K 형질 전환체이다.
- 2% 아가로스겔에서 전기영동한 후 양전하를 띤 nylon membrane으로 진공이동하고[11], 자외선 조사를 통해 고정하였다. Defensin 유전자를 함유한 120 bp DNA 단편을 PCR로써 증폭하고 정제한 후 Amersham Bioscience (Piscataway, NJ, U.S.A.)사의 Alkphos direct labeling and detection kit를 사용하여 labeling 하고. probe로 사용하여 hybridization을 수행하였다.
- 대장균에서 플라스미드 DNA의 분리는 QIAGEN사의 QIAprep miniprep kit를 사용하여 수행하였다. Southern hybridization을 위해서 Pichia 균주에서 QIAGEN Genomic- tip G/20을 사용하여 전체 게놈 DNA를 분리하였으며 RT- PCR을 수행하기 위한 전체 RNA의 분리는 동일 회사의 RNeasy mini kit를 사용하였다.
- 또한 defensin 유 전자가 전사되어 생성된 mRNA를 확인하기 위해 QIAGEN Omniscript RT-PCR kit를 사용하여 위의 5균주에서 분리한 전체 RNA 에서 RT-PCR을 실시하였다. agarose gel 전기영동 후 Southern hybridization을 하여 확인하였다.
- )사의 Alkphos direct labeling and detection kit를 사용하여 labeling 하고. probe로 사용하여 hybridization을 수행하였다. 또한 defensin 유 전자가 전사되어 생성된 mRNA를 확인하기 위해 QIAGEN Omniscript RT-PCR kit를 사용하여 위의 5균주에서 분리한 전체 RNA 에서 RT-PCR을 실시하였다.
- 곤충에서 유래한 항균 펩티드, defensin을 항균 활성이 있는 활성적인 형태로 분비하는 Pichia 균주를 개발하기 위한 일환으로서 MF al prerpo sequence와 defensin 합성 유전자를 Pichia 발 현 벡터에 재조합하여 형질전환하고 아미노산 histidine을 첨가하지 않은 최소 배지에서 형질전환체를 일차적으로 선별하였다. 선별한 형질전환체를 대상으로 항생제 G418에 대한 내성과 M.
- 대장균에서 플라스미드 DNA의 분리는 QIAGEN사의 QIAprep miniprep kit를 사용하여 수행하였다. Southern hybridization을 위해서 Pichia 균주에서 QIAGEN Genomic- tip G/20을 사용하여 전체 게놈 DNA를 분리하였으며 RT- PCR을 수행하기 위한 전체 RNA의 분리는 동일 회사의 RNeasy mini kit를 사용하였다.
- probe로 사용하여 hybridization을 수행하였다. 또한 defensin 유 전자가 전사되어 생성된 mRNA를 확인하기 위해 QIAGEN Omniscript RT-PCR kit를 사용하여 위의 5균주에서 분리한 전체 RNA 에서 RT-PCR을 실시하였다. agarose gel 전기영동 후 Southern hybridization을 하여 확인하였다.
- Southern hybridization을 통해 숙주의 염색체 DNA에 삽입한 defensin 유전자가 유지됨을 확인하였으며 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 수행하여 defensin mRNA를 증폭하고 Southern hybridization 을 실시한 결과 증폭된 밴드는 probe로 사용한 defensin 유전자에 의해 양성신호가 나타났다. 배양시간에 따른 4균주의 세포성장과 항균 활성을 비교하기 위해 BMMY 배지에서 96시간 배양하였다. 세포 성장은 모두 유사한 양상을 보였다.
- 곤충에서 유래한 항균 펩티드, defensin을 항균 활성이 있는 활성적인 형태로 분비하는 Pichia 균주를 개발하기 위한 일환으로서 MF al prerpo sequence와 defensin 합성 유전자를 Pichia 발 현 벡터에 재조합하여 형질전환하고 아미노산 histidine을 첨가하지 않은 최소 배지에서 형질전환체를 일차적으로 선별하였다. 선별한 형질전환체를 대상으로 항생제 G418에 대한 내성과 M. luteus를 시험균으로 사용하여 생육환저해를 통한 defensin의 세포 외 분비를 조사하여 4균주를 선택하고 분석하였다. Southern hybridization을 통해 숙주의 염색체 DNA에 삽입한 defensin 유전자가 유지됨을 확인하였으며 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 수행하여 defensin mRNA를 증폭하고 Southern hybridization 을 실시한 결과 증폭된 밴드는 probe로 사용한 defensin 유전자에 의해 양성신호가 나타났다.
- 세포 성장과 항균 활성을 비교하기 위해선별한 Pichia 형질 전환체 4균주를 100 ml의 BMMY 배지(2% Bacto- peptone, 1% Bacto-yeast extract, 0.5% 메탄올, 0.1 M potassium phosphate, pH 6.5, 1.34% YNB, 0.00004%biotin)에서 30℃ 에서 96시간 진탕배양하였다. 24시간 간격으로 배양액을 채취하여 600 run에서 흡광도를 재어서 세포 성장을 측정한 후 원심분리하여 상등액을 회수하여 항균활성을 측정하였다.
- 숙주의 염색체 DNA에 삽입한 defensin 유전자를 확인하기 위해선별한 4균주와 음성대조군인 pPIC9K 형질 전환체에서 분리한 전체 게놈 DNA를 BamHI과 EcoRI으로 절단한 후 defensin 유전자를 probe로 사용하여 Southern hybridization을 실시한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 플라스미드 pPIC9K로 형질전환된 숙주에서는 밴드가 나타나지않았으나(lane 4) pPIDE 형질전환체 에서는 MFqI prepro sequence와 defensin 유전자에 해당하는 360 bp 크기의 밴드가 투명 환 크기의 양상과 비슷하게 관찰되었다(lane 5-8).
- 시험관에서 재구성한 defensin 합성 유전자를 프라스미드 pUC19에 클로닝하고 염기서열을 분석하여 정확한 클론을 골랐으며 이것의 염기서열과 상응하는 아미노산 서열 을 Fig. 1에 나타내었다. 40개의 아미노산으로 구성된 defensin 뿐만 아니라 defensin의 아미노말단에 MFqI의 prepro sequence 카르복시말단에서 유래한 아미노산 Leu- Asp-Lys-Arg 4개를 추가하였다 [21].
- 아미노산 histidine이 없는 YNBD 한천배지(0.67% Bacto- yeast nitrogen base without amino acids, 2.0% dextrose,2.0% agar)에서 일차 선별한 효모 형질전환체를 0.1 M phosphate 완충용액 (pH 7.0)을 함유하고 histidine이 없고 항생제 G4L8 5 mg/ml을 함유한 YNBM (0.67% Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, 0.5% methanol, 2.0% agar, 100 mM potassium phosphate, pH 7.0) 한천배지에 tooth-picking하고 하룻밤 배양한 후 시험균인 M. luteus IAM1056 1%의 배양액을 함유한 NB agar (1.25% Bacto- heart infusion, 0.5% Bacto-nutrient broth, 0.25% Bacto- yeast extract, 0.8% agar) 10 ml을 붓고 30℃ 에서 24시간 배양한 후 시험균의 생육이 저해되어 균체주위에 생기는 투명환의 생성여부를 조사하여 활성형의 defensin이 분비 되는 형질전환체를 선별하였다 [13].
- pastoris GS115의 염색체 DNA의 HIS4 유전자에 삽입하기 위해 형질전환을 하였다. 아미노산 histidine이 없는 최소 배지에서 형질전환체를 일차로 선별한 후 이것을 0.5 mg/ml의 G418을 함유하고 탄소원으로 05% 메탄올을 함유한 YNBM 아가배지에서 배양한 후 M. luteus의 생육 저지를 통한 defensin의 분비를 확인한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 플라스미드 pPIC9K로 형질전환된 숙주는 균체주위에 투명환이 관찰되지 않았으나 pPIDE로 형질전환된 숙주의 균체주위에는 활성형 defensin의 분비로 인해 시험균인 M.
- 에 클로닝하여 염기서열 분석을 통해 정확한 서열을 가진 클론을 선택하였다. 위와 같이 얻어진difensin 항균 펩티드 유전자와 MFal의 prepro sequence 를 메탄올 유도성 alcohol oxidase promoter (A0X1)를 함유한 Pichia integration plasmid 인 pPIC9K (9.3 kb) 의 BmHI과 EcoRI 부위에 연결하고 E. coli DH5a 에 형질전환한 후 12클론에서 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 아가로스 전기영동분석 시벡터 (9.
- 이상에서 기술한 바와 같이 저렴한 메탄올을 탄소원으로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 고농도 배양이 가능하여 재조합 단백질의 생산성이 높아 산업화가 용이한 P. pastoris 를 숙주로 사용하여 곤충유래 항균 펩티드인 활성형의 defensin을 분비하였다. 최근의 항생제 과다 사용은 항생제 내성균주의 출현과 항생제의 식용 가축물에 잔류되어 궁극적으로 인간에게 흡수, 축적되는 부작용을 초래할 가능성이 높다.
- 생성된 항균 펩티드를 세포 외로 분비시키기 위해 효모의 MFrI preprosequence를 이용하고자 하였다. 제한효소 BamHI 인식 부위를 함유하는 5' primer (CGAAGGAT- CCAAACGATGAG)와 Xbal 인식 부위를 함유하는 3' primer (GCCTCTAGAGAGATACCCCTTC)를 사용하여 Pichia용 발현 넥타인 pPIC9K를 template로 사용하여 QIAGEN (Valencia, CA, U.S.A.)사의 HotStart로써 PCR을 통해 MF al preprosequence 240 bp DNA 단편을 분리하였다.
- 최종적으로 제작한 defensin 분비벡타를 숙주인 P. pastorise] 염색체 DNA에 삽입하기 위해 재조합 플라스미드 pPIDE를 제한 효소 Sall 을 처리하여 선형으로 만든 후Invitrogen의 Pichia EasyComp Transformation kit를 사용하여 형질전환을 실시하였다.
- coli DH5a 에 형질전환한 후 12클론에서 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 아가로스 전기영동분석 시벡터 (9.0 kb)와 MF al/defensin (360 bp)의 두 band가 보이는 클론을 일차적으로 선별하고 pPIDE라 명명하였으며 이것을 제작하는 과정을 도식적으로 Fig. 2에 나타내었다.
- 플라스미드 pPIDE를 HIS4 유전자 내에 있는 인식 부위 SalⅠ으로 절단한 후 숙주인 P. pastoris GS115의 염색체 DNA의 HIS4 유전자에 삽입하기 위해 형질전환을 하였다. 아미노산 histidine이 없는 최소 배지에서 형질전환체를 일차로 선별한 후 이것을 0.
- 숙주 세포의 염색체 DNA에 삽입된 defensin 유전자가 유지되는지를 확인하기 위해 Southern hybridization을 실시하였다. 형질전환체 4균주와 숙주세포에서 분리한 전체 게놈 DNA 10 ㎍을 제한 효소 BamHI과 EcoRI으로 절단하고 1.2% 아가로스겔에서 전기영동한 후 양전하를 띤 nylon membrane으로 진공이동하고[11], 자외선 조사를 통해 고정하였다. Defensin 유전자를 함유한 120 bp DNA 단편을 PCR로써 증폭하고 정제한 후 Amersham Bioscience (Piscataway, NJ, U.
- 효모세포에서 합성된 defensin을 세포 외로 분비시키는 데 필요한 분비신호 서열을 얻기 위해, pPIC9K로부터 PCR 을 통해 MFal의 prepro sequence 240 bp DNA 단편을 분리하고 pUC19에 클로닝하여 염기서열 분석을 통해 정확한 서열을 가진 클론을 선택하였다. 위와 같이 얻어진difensin 항균 펩티드 유전자와 MFal의 prepro sequence 를 메탄올 유도성 alcohol oxidase promoter (A0X1)를 함유한 Pichia integration plasmid 인 pPIC9K (9.
대상 데이터
- 항균 활성을 측정하기 위해 Micrococcusluteus IAM1056을 KCTC (Korean Collection for TypeCultuTes)에서 분양받아 시험균으로 사용하였다. Defensin 의 발현 및 분비를 위해 alcohol oxidase 1 유전자(A0X7)의 promoter와 mating factor al (MFal) prepro sequence를 함유하고 있는 플라스미드 pPIC9K를 Invitrogen에서 구입하였다.
- ) 에서 구입하여 사용하였다. 항균 활성을 측정하기 위해 Micrococcusluteus IAM1056을 KCTC (Korean Collection for TypeCultuTes)에서 분양받아 시험균으로 사용하였다. Defensin 의 발현 및 분비를 위해 alcohol oxidase 1 유전자(A0X7)의 promoter와 mating factor al (MFal) prepro sequence를 함유하고 있는 플라스미드 pPIC9K를 Invitrogen에서 구입하였다.
- 항균펩티드 defensin의 발현을 위한 숙주로 P. pastoris GS115 [ his4 ]를 Invitrogen (Carlsbad, CAZ USA.) 에서 구입하여 사용하였다. 항균 활성을 측정하기 위해 Micrococcusluteus IAM1056을 KCTC (Korean Collection for TypeCultuTes)에서 분양받아 시험균으로 사용하였다.
이론/모형
- 숙주 세포의 염색체 DNA에 삽입된 defensin 유전자가 유지되는지를 확인하기 위해 Southern hybridization을 실시하였다. 형질전환체 4균주와 숙주세포에서 분리한 전체 게놈 DNA 10 ㎍을 제한 효소 BamHI과 EcoRI으로 절단하고 1.
성능/효과
- luteus를 시험균으로 사용하여 생육환저해를 통한 defensin의 세포 외 분비를 조사하여 4균주를 선택하고 분석하였다. Southern hybridization을 통해 숙주의 염색체 DNA에 삽입한 defensin 유전자가 유지됨을 확인하였으며 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 수행하여 defensin mRNA를 증폭하고 Southern hybridization 을 실시한 결과 증폭된 밴드는 probe로 사용한 defensin 유전자에 의해 양성신호가 나타났다. 배양시간에 따른 4균주의 세포성장과 항균 활성을 비교하기 위해 BMMY 배지에서 96시간 배양하였다.
- 항균 활성도 세포 성장과 연관된 양상을 보여 48시간까지 급격히 증가하고 그 이후는 96시간까지 완만하게 증가하였으나(형질전환체 2, 4) 형질전환체 1과3은 72시간 배 양 시 항균활성이 최대를 나타내었다. 각 균주의 항균 활성은 Southern hybridization0]] 나타난 밴드의 진하기와 항생제 G418에 대한 내성 양상과 거의 일치하였다.
- 이중 투명환의 크기로 대표적인 4균주를 선별하고 1, 2, 3, 4라 명명하였다 (투명환의 크기 : 3>1>4>2).각 균주의 항생제 G-418 5 ing/ml에 대한 내성을 조사한 결과 투명 환 크기의 양상과 일치하였다.
- 2 kb DNA 단편이다. 따라서 Southern hybridization을 통해 defensin 유전자가 숙주 세포에서 유지됨을 확인하였다.
- 6에 나타내었다. 배양시간에 따른 4균주의 세포성장은 거의 동일한 양상을 나타내었으나 항균 활성은 각 균주별로 다른 양상을 보였다. 48시간 동안 세포 성장은 급격하게 증가하고 그 이후로는 세포 성장이 멈추는 정지기에 도달되었다.
- 따라서 항균 펩티드와 같이 잔류성의 위험이 없으며 내성균주의 출현 가능성이 낮은 안전한 새로운 유형의 천연 항생물질의 이용기술 개발이 요구된다. 본 연구에서 개발한 defensin을 분비하는 효모인 Pichia는 defensin유전자가 염색체 DNA에 삽입되어 있으므로 산업용 배지에서 대량 배양시 문제되는 플라스미드의 불안정성을 해결할 수 있는 장점이 있다. 배양학적 연구가 완료되면 이 균주는 항생제의 사용을 줄이거나 대체할 수 있는 사료 첨가제로서 또한 순수 정제한 defensine 구강청정제 및 식품보존제 등으로 유용하게 사용될 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 세포 성장은 48시간 동안 급격하게 증가한 후 그 이후로는 정지기에 도달되었다. 항균 활성도 48시간까지 급격히 증가하였으며 항균 활성이 가장 높은 형질전환 체 균 주3는 72시간 배양시 550 AU/ml을 나타내었다.
- 48시간 동안 세포 성장은 급격하게 증가하고 그 이후로는 세포 성장이 멈추는 정지기에 도달되었다. 항균 활성도 세포 성장과 연관된 양상을 보여 48시간까지 급격히 증가하고 그 이후는 96시간까지 완만하게 증가하였으나(형질전환체 2, 4) 형질전환체 1과3은 72시간 배 양 시 항균활성이 최대를 나타내었다. 각 균주의 항균 활성은 Southern hybridization0]] 나타난 밴드의 진하기와 항생제 G418에 대한 내성 양상과 거의 일치하였다.
후속연구
- 이러한 항생제의 부작용으로 인해 항생제의 과다 사용을 규제하고 있는 추세이다. 따라서 항균 펩티드와 같이 잔류성의 위험이 없으며 내성균주의 출현 가능성이 낮은 안전한 새로운 유형의 천연 항생물질의 이용기술 개발이 요구된다. 최근에 활발히 연구되고 있는 다양한 종류의 항균 펩티드는 항균 활성범위가 광범위하며 기존의 항생제들과는 다른 기작에 의해 항균 활성을 나타내므로, 내성을 유발할 가능성이 적다는 장점을 가지고 있다.
- 따라서 본 연구실에서는 이들 균주들에 재조합되어 삽입된 defensin 유전자의 copy 수를 분석하고 이를 이용하여 항균 활성이 강력한 균주를 선별할 계획이다. 또한 Pichia에서 발현 분비된 defensin을 정제하여 아미노산 서열을 분석하고 이를 통하여 MFal의 prepro sequence를 이용하여 Rc/rig에서도 단백질 혹은 펩티드의 분비계가 S. cereoisiae와 같이 작동하는지에 대한 논의를 추가로 시도할 예정이다.
- 본 연구에서 개발한 defensin을 분비하는 효모인 Pichia는 defensin유전자가 염색체 DNA에 삽입되어 있으므로 산업용 배지에서 대량 배양시 문제되는 플라스미드의 불안정성을 해결할 수 있는 장점이 있다. 배양학적 연구가 완료되면 이 균주는 항생제의 사용을 줄이거나 대체할 수 있는 사료 첨가제로서 또한 순수 정제한 defensine 구강청정제 및 식품보존제 등으로 유용하게 사용될 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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