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문제 정의
- 산성화에 관여하리라 예상되어지는 K+의 역할에 관하여 밝혀진 바에 따르면 외부 배지의 산성화를 위하여 K+의 방출이 일어나게 되며 이 원인은 H+ 이온에 대한 투과성의 증가에 따른 이차적인 효과에 기인한 것으로 보고 되고 있다. 그러나 이러한 실험들이 외부 pH가 알카리 상황에서 이루어진 것이 아닌 산성 환경에서 이루어진 점이 본 연구에서 밝혀진 결과의 설명에 대하여 문제점을 제기하게 된다. 현재 예상하는 바로는 알카리 환경에서는 외부로의 H+ 이온의 유출이 최소화 되리라고 예상하고 있으며 만약 이 가설이 맞는 경우라면 H+ 이온의 유출이 적어진 관계로 K+의 유출 역시 적어진다고 예상할 수 있다.
- 현재 이들의 기능을 전통적인 유전자 분석법을 사용하여 알아본 결과 세포내 pH 조절에 관여하고 있다는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 SHC1 유전자의 기능을 알아보기 위하여 null mutant를 제작하여 어떤 기작이나 경로를 통하여 효모 세포내 pH 조절이 이루어지고 있는가를 살펴보았다.
- 반면, 야생형 효모의 경우에는 4시간 정도 후에는 YPD 배지의 정상 pH를 회복하였다. 본 연구에서는 이런 차이점의 원인을 규명하기 위하여 효모에서 생산되어지는산성 대사물 중 어떤 화합물에 의해서 산성화 정도의 차이가 발생하는지를 찾아보기 위해서 초산의 발생량을 측정하여 보였다. 외부 배지의 산성화 효율의 차이를 규명해내기 위하여 SHC1 완전 돌연변이체와 야생형 효모의 알칼리 외부 환경에서의 초산생산량을 측정키트를 사용하여 알아보았다.
가설 설정
- 일예로 DNA 복제와 단백질 합성과정 전체가 수소이온농도에 아주 민감하기 때문에 이들 복제 합성 기구들을 제대로 가동하기 위해서 안정적인 pH 조절이 필수적이다(12, 17). 두 번째로는, 세포내 효소의 반응속도는 pH에 의존한다. 해당작용에 관여하는 phosphofructokinase는 해당과정의 rate-liniting을 결정하는 주효소인데 생리적인 범위내의 아주 작은 수소농도 변화에도 활성도가 민감하게 반응한다(4).
제안 방법
- 1X108 효모를 비대사성 염기인 NaOH를 이용하여 pH 9.0으로 적정 후 5, 000Xg에서 5 분 동안 원심 분리후 상층액을 이용하여 제조사의 방법에 따라 초산분비량을 측정하였다(BO- EHRINGER MANNHEIM, Germany). Acetyl-CoA synthase, citrate synthase, malate dehydrogenase 등의 효소를 이용하여 340 nm에서의 흡광도를 측정하여 다음과 같은 공식에 의하여 초산양을 측정 하였다(C=[V X MW/EXd X V X 1000]X4A[g/l]).
- 0으로 적정 후 5, 000Xg에서 5 분 동안 원심 분리후 상층액을 이용하여 제조사의 방법에 따라 초산분비량을 측정하였다(BO- EHRINGER MANNHEIM, Germany). Acetyl-CoA synthase, citrate synthase, malate dehydrogenase 등의 효소를 이용하여 340 nm에서의 흡광도를 측정하여 다음과 같은 공식에 의하여 초산양을 측정 하였다(C=[V X MW/EXd X V X 1000]X4A[g/l]).
- SNARF-1-AM 첨가 후 5 시간 내에 사용하였다. C.SNARF-1- AM를 첨 가한 세포를(1-2X107 cells/ml, 2 ml 총부피 ) excitation 534 nm, emission 580nm에서 형광세기의 변화를 조사하여 각각의 효모 내부 pH 변화를 관찰하였다(7).
- 이는 pH 적정에 사용된 화합물의 조성보다는 수소 이온 농도에 전적으로 의존적으로 돌연변이주의 성장이 저해된다는 것을 보여 주었다. LacZ 삽입 돌연변이와 마찬가지로 SHC1 완전 소실 돌연변이체에서 외부 pH에 의한 효모의 성장률을 비교하여 보았다(Fig. 1). 각각의 세포주 별로 pH 9.
- URA3 유전자를 지닌 Shuttle vector pRS315를 주형으로 사용하여 증폭한 후 URA3 유전자 양 말단에 SHC1 유전자의 Open Reading Frame (ORF) 바로 바깥쪽에 해당하는 40개의 염기가 부착되도록 다시 증폭한 후 효모에 형질전환시키고 선별하였다. SHCI 완전 소실 돌연변이체를 만들기 위한 Primer의 서열은 다음과 같다.
- 1). 각각의 세포주 별로 pH 9.5 (최종 농도 50 mM CAPSO)로 적정한 YPD 액체 배지에 접종한 후 2 시간의 간격을 두고 배양하며 세포계산법을 이용하여 성장률을 측정하였다. 세포수의 측정 결과 야생형, 그리고 아K1 완전 소실 돌연변이주에서 성장률의 차이가 나타남을 알 수 있었다.
- 알칼리가 처리된 YPD 배지에서 같은 농도로 3CPC에서 배양 후 10ml 씩 각각의 시간차를 두어 분주하여 l, 900Xg에서 5 분간 원심분리하였다. 동량의 차가운 세척용액(20 mM MgCl2, isoosmotic sorbitol)을 이용하여 재현탁한 후 원심 분리를 2 번 반복하였다. 세포 침전물을 1 ml의 세척용액으로 현탁한 후 원심 분리하고 0.
- SHC1 유전자의 소실의 확인은 마찬가지로 PCR 기법을 사용하였다 (data not shown). 또한 외부 알칼리 pH를 변화시키기 위하여 pH 8.5 50 mM HEPES, pH 9.5 50 mM CAPS, 그리고 pH 10.5 50 mM CAPSO 등의 다양한 완충용액을 사용하여 보았으며, NaOH를 사용한 실험과 유사한 결과를 보여 주었다. 이는 pH 적정에 사용된 화합물의 조성보다는 수소 이온 농도에 전적으로 의존적으로 돌연변이주의 성장이 저해된다는 것을 보여 주었다.
- 를 선별하는 방법을 사용하여 알카리 조건에서 발현이 증가하는 변이주들을 골라내고 그 유전자를 확인하였다(3, 8). 찾아진 두 종류의 유전자 중 SHC1 으로 명명된 새로운 유전지는 1539개의 염기로 이루어져 있으며 예상되는 분자량은 56.
- 5% yeast extract, 1% NaCl을 2% agar를 이용하여 고-형화)를 성장을 위하여 사용하였다. 사용된 항생제는 kanamycin (KM), chloram phenicol (CM), streptomycin (SM), ampicillin (AP), spectinomycin (SP)로서 각각 최종 40, 30, 100, 100, 20 ng/ml 농도로 사용하였다.
- 형질전환 후 돌연변이체는 uracil 결핍배지에서 선별하였다. 선별 후 각각의 집락을 배양하여 게놈 DNA를 추출 후 SHC1 유전자의 Promoter 부분부터의 증폭이 가능한 다음과 같은 Primer를 이용한 PCR을 다음과 같은 방법에 의하여 진행하였다(PSCY1 아미노 말단 5'-TTC TTG CAA TTG TCT GTT AAC AAA TGC TGA TTC AC-3', 카르복실 말단 S-ATT GGC TAA TTC CTG TGA ATT GTA TAC GGA CT-3'). 증폭된 PCR 산물은 SHCI 유전자를 코딩하고 있던 부분이 상동재조합 과정에 의하여 URA3 유전자로 대치 되어있으므로, Apa I 제한효소 처리후 Ethidium Bromide를 이용한 염색과정을 거쳐 완전소실 돌연 변이주를 최종 확인하였다.
- 본 연구에서는 이런 차이점의 원인을 규명하기 위하여 효모에서 생산되어지는산성 대사물 중 어떤 화합물에 의해서 산성화 정도의 차이가 발생하는지를 찾아보기 위해서 초산의 발생량을 측정하여 보였다. 외부 배지의 산성화 효율의 차이를 규명해내기 위하여 SHC1 완전 돌연변이체와 야생형 효모의 알칼리 외부 환경에서의 초산생산량을 측정키트를 사용하여 알아보았다. 실험 결과 SHC1 돌연변이체의 경우 야생형에 비하여 초산의 분비량이 적음을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 따라서 알칼리 조건에서 효모는 K+ 이온의 외부로의 방출과 H+ 이온의 유입을 통하여 세포내 pH를 낮출 것으로 예측된다. 이 가설을 증명하기 위하여 야생형 효모와 SHC7 소실 돌연변이를 알칼리에 처리한 후 시간별로 세포내 K+ 이온과 Na+이온의 농도를 측정 하였다. Na+의 농도는 NaOH 첨가 후에 계속적인 증가를 보이며 SHC1 소실 돌연변이와 야생형 사이의 차이점을 보이지 않았으나 K+의 경우에는 NaOH 첨가에 의한 배지의 알카리화에 의해서 모두 감소하는 양상을 띄었으며, 감소량에서는 SHC1 소실 돌연변이의 경우에 20% 정도 많은 양이 감소함을 확인하였다(Fig 4).
- 실험에서 확인하였다(8). 이 결과를 토대로 본 연구에서는 SHC1 완전 소실 돌연변이를 PCR 기법으로 제조하였다. SHC1 유전자의 소실의 확인은 마찬가지로 PCR 기법을 사용하였다 (data not shown).
- 있다. 이 변화를 알아보기 위하여 야생형과 삽입형 돌연변이주를 pH 9.5에서 접종한 후 시간별로 외부 배지 pH의 변화 정도를 확인하였다(8). 시간이 지남에 따라 야생형 효모의 외부 pH의 산성화를 확인할 수 있었다.
- 의한 것으로 추측되었다. 이에 대한 확인을 위하여 pH의 차이에 의한 감수성을 보여 주는 형광물질인 C.SNARF를 사용하여 각각의 변이주 별로 pH의 변화에 따른 세포 내부의 pH를 측정하였다. 현재 세포 내부의 pH 측정을 위한 다양한 방법들 중 가장 간편하고 빠르게 세포 내부 pH의 변화를 측정 할 수 있는 방법 중의 하나로서 형광 염색물질을 사용하여 pH를 측정하는 방법이다.
- 5ml의 20mM MgCl?에 희석하였다. 이온의 주출은 9SC에서 15 분간 처리 후 원심 분리하고 표층액을 atomic absorption spectrometer를 이용하여 각각의 이온의 농도를 측정하였다(14).
- 선별 후 각각의 집락을 배양하여 게놈 DNA를 추출 후 SHC1 유전자의 Promoter 부분부터의 증폭이 가능한 다음과 같은 Primer를 이용한 PCR을 다음과 같은 방법에 의하여 진행하였다(PSCY1 아미노 말단 5'-TTC TTG CAA TTG TCT GTT AAC AAA TGC TGA TTC AC-3', 카르복실 말단 S-ATT GGC TAA TTC CTG TGA ATT GTA TAC GGA CT-3'). 증폭된 PCR 산물은 SHCI 유전자를 코딩하고 있던 부분이 상동재조합 과정에 의하여 URA3 유전자로 대치 되어있으므로, Apa I 제한효소 처리후 Ethidium Bromide를 이용한 염색과정을 거쳐 완전소실 돌연 변이주를 최종 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 효모들은 다음과 같다(YC1, MATa cry'/ MATa CRY ura3-52/ura3-52 leu2- /98/lett2- /98 HIS3/his3- ^200 TRPl/f/p-47 SHCl/shcl::lacZ; YC2MATa cry/MATa CRY ura3-52/ura3-52 leu2- ^98/leu2-A98 HIS3//his3-4200 TRP1/ trp-Sl SYCl/sycl"lacZ; YC3, MATa cryr CRY ura3-52 leu2- A98 HIS3 trp-^1 shcl\:lacZ). 효모 성장 배지와 기본 조작을 위한 기술들은 Sherman등에 의해서 언급된 참고 자료를 이용하였다 (18).
- 효모 성장 배지와 기본 조작을 위한 기술들은 Sherman등에 의해서 언급된 참고 자료를 이용하였다 (18). Escherichia coli은 일반적인 LB 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl을 2% agar를 이용하여 고-형화)를 성장을 위하여 사용하였다. 사용된 항생제는 kanamycin (KM), chloram phenicol (CM), streptomycin (SM), ampicillin (AP), spectinomycin (SP)로서 각각 최종 40, 30, 100, 100, 20 ng/ml 농도로 사용하였다.
- 10ml 세척용액에 재현탁시킨 후 얼음에 보관하였다. 준비된 세포는 C.SNARF-1-AM 첨가 후 5 시간 내에 사용하였다. C.
- HIS3 trp-^1 shcl\:lacZ). 효모 성장 배지와 기본 조작을 위한 기술들은 Sherman등에 의해서 언급된 참고 자료를 이용하였다 (18). Escherichia coli은 일반적인 LB 배지(1% tryptone, 0.
이론/모형
- 이 결과를 토대로 본 연구에서는 SHC1 완전 소실 돌연변이를 PCR 기법으로 제조하였다. SHC1 유전자의 소실의 확인은 마찬가지로 PCR 기법을 사용하였다 (data not shown). 또한 외부 알칼리 pH를 변화시키기 위하여 pH 8.
- 돌연변이체 제조는 중합효소연쇄반응 PCR을 이용한 방법을 적용하였다. URA3 유전자를 지닌 Shuttle vector pRS315를 주형으로 사용하여 증폭한 후 URA3 유전자 양 말단에 SHC1 유전자의 Open Reading Frame (ORF) 바로 바깥쪽에 해당하는 40개의 염기가 부착되도록 다시 증폭한 후 효모에 형질전환시키고 선별하였다.
성능/효과
- 이 가설을 증명하기 위하여 야생형 효모와 SHC7 소실 돌연변이를 알칼리에 처리한 후 시간별로 세포내 K+ 이온과 Na+이온의 농도를 측정 하였다. Na+의 농도는 NaOH 첨가 후에 계속적인 증가를 보이며 SHC1 소실 돌연변이와 야생형 사이의 차이점을 보이지 않았으나 K+의 경우에는 NaOH 첨가에 의한 배지의 알카리화에 의해서 모두 감소하는 양상을 띄었으며, 감소량에서는 SHC1 소실 돌연변이의 경우에 20% 정도 많은 양이 감소함을 확인하였다(Fig 4). 산성화에 관여하리라 예상되어지는 K+의 역할에 관하여 밝혀진 바에 따르면 외부 배지의 산성화를 위하여 K+의 방출이 일어나게 되며 이 원인은 H+ 이온에 대한 투과성의 증가에 따른 이차적인 효과에 기인한 것으로 보고 되고 있다.
- 성장률을 측정한 결과 pH 8 까지는 큰 차이를 보이지 않았으나 pH가 높아질수록 성장률의 감소가 일어났으며, 이러한 성장률의 차이가 나타나는 원인을 세포 내부의 pH 완충 작용의 결여에 의한 것으로 추측되었다. 이에 대한 확인을 위하여 pH의 차이에 의한 감수성을 보여 주는 형광물질인 C.
- 포도당에 의한 극적인 효과와 비슷하게 Shcl 단백질은 직접적 혹은 간접적으로 H+-ATPase> 조절하여 외부 pH를 낮출 것이다. 세 번째로 박테리아, 조류, 효모와 같은 미생물들은 어떤 특별한 상황에서 건량의 10~20% 정도의 많은 양의 polyphosphate# 포함하고 있다(10, 15). Polyphosphate 의 역할로 추정되어 지는 한 가지는 세포 내부 pH의 완충 작용이다.
- 5 (최종 농도 50 mM CAPSO)로 적정한 YPD 액체 배지에 접종한 후 2 시간의 간격을 두고 배양하며 세포계산법을 이용하여 성장률을 측정하였다. 세포수의 측정 결과 야생형, 그리고 아K1 완전 소실 돌연변이주에서 성장률의 차이가 나타남을 알 수 있었다. 이는 SHC1 유전자가 알카리 조건에서 세포의 성장에 관여한다는 것을 다시 한 번 확인하여 주었다.
- 5에서 접종한 후 시간별로 외부 배지 pH의 변화 정도를 확인하였다(8). 시간이 지남에 따라 야생형 효모의 외부 pH의 산성화를 확인할 수 있었다. 그렇지만 SHC1 유전자를 제거한 효모에서는 외부 pH의 산성화가 야생형에 비하여 현저하게 저해되고 있음을 알 수 있었다.
- 외부 배지의 산성화 효율의 차이를 규명해내기 위하여 SHC1 완전 돌연변이체와 야생형 효모의 알칼리 외부 환경에서의 초산생산량을 측정키트를 사용하여 알아보았다. 실험 결과 SHC1 돌연변이체의 경우 야생형에 비하여 초산의 분비량이 적음을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- 이를 뒷 받침 하는 또 하나의 결과로서 현재 실험에 사용되어지고 있는 효모의 경우에는 selection marker로서의 이용 가능성을 위하여 URA3, ADE2, HIS3 등의 여러 필수 유전자들의 점돌연변이화시킨 변이주들이 사용되어지고 있다. 실험에 사용되어진 SHC1 null mutant의 경우에는 야생형에 비하여 좀 더 붉은 색을 띠고 있음을 확인 하였다. ADE2 돌연변이주의 경우는 purine 합성 경로에서의 신호 전달 체계상에서 적색의 색소의 축적에 의해서 붉은색을 띄게 되는데 호흡율이 높을수록 더욱 진한 붉은색을 띄게 된다.
- 현재 세포 내부의 pH 측정을 위한 다양한 방법들 중 가장 간편하고 빠르게 세포 내부 pH의 변화를 측정 할 수 있는 방법 중의 하나로서 형광 염색물질을 사용하여 pH를 측정하는 방법이다. 알칼리 pH 완충효과가 야생형 효모에서는 제대로 유지되는데 반하여 SHC1 소실 돌연변이의 경우 야생형 대비 70% 정도의 완충 효과를 보였다. 외부 pH에 대한 효모 세포 내부의 pH 변화 및 중화 반응을 살펴보기 위한 실험에서 pH가 높아질수록 세포내부의 pH의 변화가 가장 적음을 알수 있었다 (Fig.
- 알칼리 pH 완충효과가 야생형 효모에서는 제대로 유지되는데 반하여 SHC1 소실 돌연변이의 경우 야생형 대비 70% 정도의 완충 효과를 보였다. 외부 pH에 대한 효모 세포 내부의 pH 변화 및 중화 반응을 살펴보기 위한 실험에서 pH가 높아질수록 세포내부의 pH의 변화가 가장 적음을 알수 있었다 (Fig. 3).
- 5 50 mM CAPSO 등의 다양한 완충용액을 사용하여 보았으며, NaOH를 사용한 실험과 유사한 결과를 보여 주었다. 이는 pH 적정에 사용된 화합물의 조성보다는 수소 이온 농도에 전적으로 의존적으로 돌연변이주의 성장이 저해된다는 것을 보여 주었다. LacZ 삽입 돌연변이와 마찬가지로 SHC1 완전 소실 돌연변이체에서 외부 pH에 의한 효모의 성장률을 비교하여 보았다(Fig.
- 두 번째 유전자는 SCY1 으로서 SHC1 유전자보다는 약간 큰 85 kDa로 마찬가지로 그 기능이 알려지지 않은 새로운 유전자이다. 현재 이들의 기능을 전통적인 유전자 분석법을 사용하여 알아본 결과 세포내 pH 조절에 관여하고 있다는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 SHC1 유전자의 기능을 알아보기 위하여 null mutant를 제작하여 어떤 기작이나 경로를 통하여 효모 세포내 pH 조절이 이루어지고 있는가를 살펴보았다.
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