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문제 정의
- 본 연구에서는 바이러스를 검출하는 전통적인 방법인 세포 배양법과 분자생물학적 방법인 PCR 방법, 그리고 새롭게 시도되고 있는 ICC-PCR 방법으로 물 중의 폴리오 바이러스를 검출하는데 있어서의 민감도를 비교하고자 하였다. 또한 먹는 물에서는 감염성 바이러스의 존재 여부가 중요하므로 감염성 바이러스를 검출하기 위해서는 어떤 방법이 효과적인지 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 먹는 물에 존재하는 바이러스를 효과적으로 검사하는 방법을 알아보고자 하여 가장 많이 사용되는 세포배양법과 PCR 방법 그리고 최근에 사용되기 시작한 ICC-PCR 방법을 이용하여 poliovirus에 대한 검출 민감도를 비교하였고 감염성이 있는 바이러스만을 빠른 시간에 검출하는 방법을 알아보고자 하였다. 이 실험의 목적이 검출방법의 민감도를 비교하는 것이므로 인위적으로 바이러스의 수를 계산하여 실험하였다.
- 그 중에서도 가장 크게 논란이 되는 부분은 바이러스를 검출하는 방법인데, 그 이유는 아직까지 국제적으로 통일된 검사 방법이 존재하지 않으므로 사용하는 방법에 의해 그리고 실험한 사람에 따라서 그 결과와 해석이 달라질 수 있기 때문이다. 본 연구에서는 바이러스를 검출하는 전통적인 방법인 세포 배양법과 분자생물학적 방법인 PCR 방법, 그리고 새롭게 시도되고 있는 ICC-PCR 방법으로 물 중의 폴리오 바이러스를 검출하는데 있어서의 민감도를 비교하고자 하였다. 또한 먹는 물에서는 감염성 바이러스의 존재 여부가 중요하므로 감염성 바이러스를 검출하기 위해서는 어떤 방법이 효과적인지 알아보고자 하였다.
- 불활성화시키기 위해서 우선 바이러스를 5, 000PFU/ml. 희석하였는데 그 이유는 불활성화되지 않은 바이러스의 경우에는 RT-PCR 방법뿐만 아니라 세포배양법에 의한 결과도 빠른 시간에 알 수 있도록 하기 위해서이다. 불활성화시키는 방법은 바이러스의 외막을 파괴하기 위하여 열처리를 하였는데 60℃와 (15) 100℃에서 불활성화시켰으며, 핵산을(본 논문에서는 RNA) 파괴하기 위해서 UV를 사용하였다(13).
제안 방법
- lanes 4, 5). PCR 방법은 primer에 따라서 그 민감도가 달라지는데 VP1 primer 외에 5' noncoding region의 primer도 사용하였는데 민감도가 떨어지고 비특이적인 band가 많아서(data not shown) 사용하기에 부적당하다고 판단하여 VP1 primer를 가지 고모든 실험을 수행하였다.
- PCRe 위에서 합성된 cDNA를 3 μl를 넣고 10X Buffer 5 μl (최종농도: 10 mM Tris-HCl, p.H 8.3, 50 mM KC1 and 2mM MgCl2), 0.3 μM의 primer pair (forward와 reverse), 0.2 mM의 각각의 dNTP, 2.5 U Taq polymerase (Takara, Shija, Japan)를 넣은 후에 최종부피를 50 μl로 맞춘 후 Primus96 Plus thermocycler (MWG Biotech, Ebersberg, Germany)를 사용하여 다음의 조건으로 PCR을 반복 수행했다. 우선 95°에서 3 분 동안 denaturation 시 킨 후에 95℃ 30 초, 56℃ 45 초, 72℃ 1 분의 조건으로 35 cycle을 반복 수행한 후 72℃에서 7 분간 최종 반응시켰다.
- 바이러스를 불활성화시키는 방법으로는 UV 조사와 열처리를 이용하였다. UV는 바이러스의 RNA를 파괴시키기 위한 것으로 0.2, 0.6, 1, 2 J/cm2를 조사하였다. 열처리는 외막을 파괴하기 위한 것으로 60℃에서 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 분 또는 100℃에서 1, 3, 5, 10 분 동안 처리하였다.
- 6, 1, 2J/cm2를 조사하였다. 각 방법으로 불활성화시킨 바이러스의 일부를 세포에 감염시켜서 세포배양법과 ICC-PCR 방법으로 검출하였고, 일부는 직접 RT- PCR 방법으로 바이러스 검출을 시도하였다.
- 05PFU/ml의 바이러스를 감염시켰을 때는 일주일 동안 배양을 해도 CPE를 관찰할 수 없었다. 그래서 세포배양액을 얻어서 다시 세포에 감염시키고 처음과 같은 방법으로 관찰하였다. 두 번째 배양에서 0.
- 다음으로 RT-PCR 방법으로 검출실험을 수행하였다. 바이러스를 희석한 후에 같은 부피의 시료를 가지고 RNA를 추출하고 같은 양의 RNA에서 RT-PCR을 하였다.
- 접종액을 제거한 뒤 완충용액으로 두 차례 씻어 주고 37℃, 5% CO2 대기하의 배양기에서 배양하였다. 매일같이 현미경 하에서 세포가 동그랗게 되는 CPE를 관찰하여 그 결과를 기록하였다. 바이러스 감염 후 7 일이 되도록 CPE를 보이지 않을 때에는 세포를 계대배양하여 계속적으로 CPE를 관찰하였다.
- 05 PFU/ml까지 희석하여 세 가지 방법으로 검출을 했다. 먼저 세포배양법에 의해 바이러스를 감염시키고 2 일째와 4 일째에 배지를 새 것으로 교환해주면서 일주일 동안 관찰하였다. 그 결과 500PFU/ml의 바이러스를 감염시켰을 때는 이틀째부터 CPE가 보이기 시작해서(Fig.
- 매일같이 현미경 하에서 세포가 동그랗게 되는 CPE를 관찰하여 그 결과를 기록하였다. 바이러스 감염 후 7 일이 되도록 CPE를 보이지 않을 때에는 세포를 계대배양하여 계속적으로 CPE를 관찰하였다.
- 바이러스 검출에 사용하는 세 가지 방법이 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구분할 수 있는지 알아보기 위하여 불활성화시킨 바이러스를 가지고 검출방법을 비교하였다. 바이러스를 불활성화시키는 방법은 열처리와 UV를 이용하였다.
- 바이러스를 불활성화시키는 방법으로는 UV 조사와 열처리를 이용하였다. UV는 바이러스의 RNA를 파괴시키기 위한 것으로 0.
- 바이러스를 불활성화시키는 방법은 열처리와 UV를 이용하였다. 열처리는 60℃에서 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 분 또는 100℃에서 1, 3, 5, 10분 수행하였고, UV는 0.
- 바이러스를 얻기 위해 지름이 100 mm인 세포배양용 접시에 배양한 Vero 세포에 200μl의 바이러스를 접종하여 세포가 마르지 않고 바이러스가 골고루 흡착될 수 있도록 15 분 간격으로 가볍게 흔들어 주며 3WC에서 1시간 흡착시킨 후 유지 배지를 첨가하였다. 바이러스를 감염시키고 3~4 일 배양하여 세포를 수확한 후 400Xg에서 7 분간 원심분리하여 상층액은 따로 모으고 pellete 재현탁하였다.
- 바이러스를 희석한 후에 같은 부피의 시료를 가지고 RNA를 추출하고 같은 양의 RNA에서 RT-PCR을 하였다. 이 방법에서는 500 PFU/ml와 50PFU/ml의 바이러스를 포함하는 시료에서는 292 bp 의 PCR산물이 검출되었고(Fig 2A.
- 바이러스 접종액을 제거한 뒤 완충용액으로 두 차례 씻어 주고 37 ℃, 5% CO2 대기하의 배양기에서 배양하였다. 배양 24시간이경과한 뒤 세포를 수확하고 Viral RNA extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 세포의 전체 RNA를 추출하였다. 이렇게 얻은 RNA를 주형으로 RT-PCR 방법을 수행하였고, 그 방법은 앞서 기술한 바와 같다.
- 희석하였는데 그 이유는 불활성화되지 않은 바이러스의 경우에는 RT-PCR 방법뿐만 아니라 세포배양법에 의한 결과도 빠른 시간에 알 수 있도록 하기 위해서이다. 불활성화시키는 방법은 바이러스의 외막을 파괴하기 위하여 열처리를 하였는데 60℃와 (15) 100℃에서 불활성화시켰으며, 핵산을(본 논문에서는 RNA) 파괴하기 위해서 UV를 사용하였다(13). 불활성화시킨 바이러스를 세포에 감염시키고 CPE를 관찰한 결과 불활성화시키지 않은 바이러스는 하루만에 CPE가 보이는데 반해서 불활성화된 바이러스에서는 두 번째 배양이 끝나도록 CPE가 보이지 않는 것을 알 수 있었다.
- 세포배양법, PCR, ICC-PCR 방법들의 바이러스 검출 민감도를 비교하기 위하여 바이러스를 500PFU/ml부터 0.05 PFU/ml까지 희석하여 세 가지 방법으로 검출을 했다. 먼저 세포배양법에 의해 바이러스를 감염시키고 2 일째와 4 일째에 배지를 새 것으로 교환해주면서 일주일 동안 관찰하였다.
- RT-PCR에 사용한 RNA는 희석된 바이러스를 Viral RNA extraction kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 얻었다. 역전사 반응은 Sensiscript RT-kit (Qiagen GmbH)를 이용하였는데 그 조성은 주형 RNA 4μl 0.5 mM dNTP, 0.1 (AM VP1 primer pair (forward와 reverse), 20 U RNase inhibitor (Takara Shuzo Co., LTD, Otsu, Japan), 4 U Sensiscript RTase를 넣은 후 DEPC-treated water로 최종부피를 20 μl로 맞추었다. 이 혼합용액을 371에서 1시간 동안 반응시킨 후 93℃에서 5 분간 반응하여 RTase의 활성을 제거하고 얼음에서 10 분간 식힌 후에 PCR을 수행하였다.
- 바이러스를 불활성화시키는 방법은 열처리와 UV를 이용하였다. 열처리는 60℃에서 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 분 또는 100℃에서 1, 3, 5, 10분 수행하였고, UV는 0.2, 0.6, 1, 2J/cm2를 조사하였다. 각 방법으로 불활성화시킨 바이러스의 일부를 세포에 감염시켜서 세포배양법과 ICC-PCR 방법으로 검출하였고, 일부는 직접 RT- PCR 방법으로 바이러스 검출을 시도하였다.
- 6, 1, 2 J/cm2를 조사하였다. 열처리는 외막을 파괴하기 위한 것으로 60℃에서 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 분 또는 100℃에서 1, 3, 5, 10 분 동안 처리하였다.
- 위에서 얻은 바이러스를 10진 희석하여 10-4~10-6 의 바이러스 희석액을 직경 35 mm 세포배양용 접시에서 3 일정도 배양한 HeLa 세포 단층에 접종한 후 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 다음 바이러스를 제거하고 overay medium (2% FBS, 0.37% SBC, 0.25% gum agar, 100 U/m/ penicillin, 100 streptomycin, 1 Fungizone0] 함유된 DMEM)을 첨가하였다. 바이러스를 감염시키고 3일 후에 10% formalin (Yakuri Pure Chemicals, Osaka, Tokyo, Japan)으로 2 시간 동안 세포를 고정하였다.
- 이 실험의 목적이 검출방법의 민감도를 비교하는 것이므로 인위적으로 바이러스의 수를 계산하여 실험하였다.
- 이렇게 해서 세 가지 방법의 민감도를 결정한 후에는 감염성 바이러스만을 효과적으로 검출하는 방법을 알아보고자 하여 바이러스를 인위적으로 불활성화시킨 후에 앞의 실험을 반복 수행하였다. 불활성화시키기 위해서 우선 바이러스를 5, 000PFU/ml.
- 우선 95°에서 3 분 동안 denaturation 시 킨 후에 95℃ 30 초, 56℃ 45 초, 72℃ 1 분의 조건으로 35 cycle을 반복 수행한 후 72℃에서 7 분간 최종 반응시켰다. 증폭된 시료는 1% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide 염색을 하여 UV transilluminator로 확인하였다.
대상 데이터
- 검출에 사용한 바이러스는 폴리오 바이러스 type 1의 경구용 백신 주인 Sabin strain으로 배 용수 교수(한남대학교)로부터 분양받았다. 바이러스를 얻기 위해 지름이 100 mm인 세포배양용 접시에 배양한 Vero 세포에 200μl의 바이러스를 접종하여 세포가 마르지 않고 바이러스가 골고루 흡착될 수 있도록 15 분 간격으로 가볍게 흔들어 주며 3WC에서 1시간 흡착시킨 후 유지 배지를 첨가하였다.
- 바이러스 배양에는 African green monkey kidney (Vero) 세포를 사용하였다. 세포는 Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, Gaithersburg, USA) 에 5% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL)과 0.
- 사용하였다. 세포는 Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, Gaithersburg, USA) 에 5% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL)과 0.37%의 sodium bicarbonate (SBC: Sigma, St. Louis, USA), 그리고 100 V/ml 의 penicillin (Sigma)과 100μg/mL의 streptomycin (Sigma)을 넣어 배양하였으며, 세포 단층을 유지하기 위한 유지배지로는 2% FBS와 0.37% SBC가 함유된 DMEM을 사용하였다. 적절한 산성도를 유지시켜 주기 위해 37℃, 5% CO2 대기하의 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
- 정량법은 가장 널리 사용되고 비교적 정확한 plaque assay를 이용하였다. 위에서 얻은 바이러스를 10진 희석하여 10-4~10-6 의 바이러스 희석액을 직경 35 mm 세포배양용 접시에서 3 일정도 배양한 HeLa 세포 단층에 접종한 후 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 다음 바이러스를 제거하고 overay medium (2% FBS, 0.
성능/효과
- ID). 50PFU/mZ의 바이러스를 감염시켰을 때는 3 일째에 CPE가 보이기 시작했으며 5PFU/ml의 바이러스를 감염시켰을 때는 감염 4 일째에 CPE가 보였다. 그러나 0.
- 분자생물학적 방법으로 많이 사용되는 바이러스 검출법은 PCR (polymerase chain reaction) 방법이다. PCR 방법은 적은 양의 DNA나 RNA를 증폭시켜 결과를 보는 것이므로 시료가 적은 양이 있어도 검출이 가능하고, 바이러스의 종류도 확인할 수 있고 세포배양법에 비해 시간과 경비도 절약된다(2, 3, 7, 8). 그러나 감염성이 있는 바이러스와 없는 바이러스의 구분이 불가능하고, 시료에 PCR을 저해할 수 있는 불순물이 있으면 검출이 불가능하다 (3, 12, 13).
- 결론적으로 폴리오 바이러스를 사용하여 물에서 바이러스를 검출하는 방법을 비교해 본 결과 짧은 시간에 감염성 바이러스만 검출하는 방법으로는 ICC-PCR이 가장 좋은 것으로 생각한다.
- 것을 사용하였다. 그 결과 500 PFU/zmZ, 50 PFU/w/, 5 PFU/ml의 바이러스를 포함하는 시료에서는 뚜렷한 band가 관찰되었고(Fig. 2B. lanes 2, 3, 4), 0.5 PFU/ml의 바이러스를 포함하는 시료에서도 희미하지만 band를 관찰할 수 있었다(Fig. 2B. lane 5). 그러나 0.
- 5 PFU/ml인 경우에는 RT-PCR 방법으로는 검출되지 않은 반면 세포배양법과 ICC-PCR 방법으로는 검출되었다. 그러나 바이러스를 검출하는데 있어서의 시간이 차이가 나는데 세포배양법의 경우에는 두 번째 계대배양에서 결과를 알 수 있었고 이 때까지는 적어도 9 일 이상의 시간이 필요하지만, ICC-PCR 방법에서는 더 짧은 시간에 같은 결과를 얻을 수 있었다.
- 5 PFU/ml과 같이 바이러스의 수가 적을 때에는 CPE를 관찰할 때까지의 기간이 상당히 오래 걸리는 것을 알 수 있었다(19). 그리고 여러 번의 실험을 반복해 본 결과 때로는 CPE가 보이고 어떤 때에는 CPE가 보이지 않을 때도 있었는데 같은 실험에서 두 개 중에 하나는 보이고 나머지 하나는 안 보이는 경우도 있었고 또는 같은 종류의 실험에서는 두 개 모두 CPE가 보이는데 다른종류의 실험에서는 두 개 모두 안 보일 때도 있었다. 이것은 확률적으로 계산해 보았을 때 감염시키는 시료 안에 바이러스가 있을 수도 있고 없을 수도 있기 때문이다.
- 불활성화시키지 않은 감염성 바이러스를 감염시킨 경우에는 24 시간이 지나면 CPE가 보이기 시작하며 감염 후 3 일에서 4 일이 지나면 거의 모든 세포가 죽는데 비해 60℃, 100℃, UW로 불활성화시킨 바이러스를 감염시킨 세포에서는 두 번째 계대배양에서도 CPE가 보이지 않는 것을 관찰하였다. RT-PCR 방법으로 바이러스를 검출하고자하였을 때에는 불활성화 방법에 따라 결과가 다르게 나오는 것을 알 수 있었다.
- 불활성화시키는 방법은 바이러스의 외막을 파괴하기 위하여 열처리를 하였는데 60℃와 (15) 100℃에서 불활성화시켰으며, 핵산을(본 논문에서는 RNA) 파괴하기 위해서 UV를 사용하였다(13). 불활성화시킨 바이러스를 세포에 감염시키고 CPE를 관찰한 결과 불활성화시키지 않은 바이러스는 하루만에 CPE가 보이는데 반해서 불활성화된 바이러스에서는 두 번째 배양이 끝나도록 CPE가 보이지 않는 것을 알 수 있었다. RT-PCR 결과를 보면 열처리한 모든 시료에서 band가 나오는데 그 이유는 바이러스의 외막이 파괴되었을 뿐 RNA는 손상을 받지 않고 그대로 존재하기 때문이다.
- RT-PCR 방법으로 바이러스를 검출하고자하였을 때에는 불활성화 방법에 따라 결과가 다르게 나오는 것을 알 수 있었다. 열처리에 의해 불활성화한 바이러스를 포함하는 시료에서는 열처리 시간에 관계없이 바이러스를 검출할 수 있었지만(Fig. 3. A, B), UM 불활성화시킨 바이러스를 포함하는 시료에서는 band가 나타나지 않는 것을 볼 수 있었다(Fig. 3, C). ICC-PCR 방법으로 실험한 결과 불활성화시키지 않은 바이러스에서는 band가 나오고 열처리한 바이러스와UV로 처리한 바이러스에서는 모두 band가 나오지 않았다(Fig.
- 5PFU/ml에서도 희미한 band가 나오는 것을 알 수 있는데 그 이유는 바이러스가 세포 안에서 증식이 일어나기 때문이다. 이 결과로 보면 ICC-PCR 방법은 세포배양법과 비교하였을 때 동일한 민감성 결과를 얻으면서도 시간을 절약할 수 있으며, RT-PCR 방법과 비교하였을 때에는 더 적은 수의 바이러스도 검출할 수 있다는 것이다. 이상의 결과들을 종합해보면 세 가지 방법의 같은 시간대, 즉 바이러스 감염 후 이틀째의 민감도를 비교할 수 있는데 세포배양법보다 RT-PCR 방법이, 그리고 RT- PCR 방법보다 ICC-PCR 방법이 각각 10 배 더 민감하다는 것을 알 수 있었다(Fig.
- ICC-PCR 방법을 사용하였을 때에는 세포배양법에서와 마찬가지로 불활성화된 바이러스는 전혀 검출할 수 없는 것을 알 수 있었다. 이상에서 RT-PCRe 감염성이 없어도 RNA만 존재하면 검출하는데 비해서 세포배양법과 ICC-PCRe 감염성이 없는 바이러스는 검출하지 못흐}는 것을 알 수 있다. 하지만 같은 결과를 얻는데 걸리는 시간이 세포배양법은 2 주가 걸리는데 비하여 ICC-PCRe 수 일 내에 결과를 알 수 있으므로 감염성이 있는 바이러스만을 빠른 시간에 검출하는데는 ICC-PCR 방법이 좀 더 나은 방법이라고 할 수 있다.
- 이 결과로 보면 ICC-PCR 방법은 세포배양법과 비교하였을 때 동일한 민감성 결과를 얻으면서도 시간을 절약할 수 있으며, RT-PCR 방법과 비교하였을 때에는 더 적은 수의 바이러스도 검출할 수 있다는 것이다. 이상의 결과들을 종합해보면 세 가지 방법의 같은 시간대, 즉 바이러스 감염 후 이틀째의 민감도를 비교할 수 있는데 세포배양법보다 RT-PCR 방법이, 그리고 RT- PCR 방법보다 ICC-PCR 방법이 각각 10 배 더 민감하다는 것을 알 수 있었다(Fig. 1, Table 1).
- 이상에서 RT-PCRe 감염성이 없어도 RNA만 존재하면 검출하는데 비해서 세포배양법과 ICC-PCRe 감염성이 없는 바이러스는 검출하지 못흐}는 것을 알 수 있다. 하지만 같은 결과를 얻는데 걸리는 시간이 세포배양법은 2 주가 걸리는데 비하여 ICC-PCRe 수 일 내에 결과를 알 수 있으므로 감염성이 있는 바이러스만을 빠른 시간에 검출하는데는 ICC-PCR 방법이 좀 더 나은 방법이라고 할 수 있다.
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