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문제 정의
- 가공단계 및 소비단계 소고기에서 병원성 미생물의 오염도 검사를 실시하여 시민 보건위생을 위한 예방대책의 자료로 활용하고자 연구를 수행하였다.
- 따라서 본 연구는 소고기의 도축 및 운반, 가공, 판매과정의 위생적인 관리에 필요한 기초자료를 얻기 위해 E coli O157:H7, salmonella spp, L monocytogenes, S aureus, Campylobacter jejuni를 대상으로 하여 도축단계, 운반. 가공단계 및 소비단계 소고기에서 병원성 미생물의 오염도 검사를 실시하여 시민 보건위생을 위한 예방대책의 자료로 활용하고자 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 도축장의 위생 수준 및 소고기의 유통 단계별 병원성 미생물의 오염 수준을 측정하기 위하여 광주지역 소재 도축장의 일반세균수와 대장균수를 모니터링 하였고 유통되는 소고기에 대하여 유통단계별로 병원성 미생물의 오염 수준를 검사하였다. 대상으로 삼은 병원성 세균은 E coli O157:H7, salmonella spp, L monocytogenes, S aureus, C jejuni 였으며, 다음과 같은 실험결과를 얻었다.
제안 방법
- PCR mixtuie는 premix(Bioneer)을 사용하였으며, template 2㎕ 와 primer 2㎕로 혼합하여, PCR 조건을 95℃ 4 분 승온하고, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분에서 30 cycle 증폭한 후 72 ℃ 10분 더 반응하고, 4℃에서 정치하였다. 2% agarose gel에서 전기영동한 후 증폭 여부를 검사하였다.
- catalase, coagulase 및 당분해시험를 실시하였다. S aureus의 최종 확인을 위해 Vitek system(bioMeriux) 과 VIDAS(bioMeriux)에서 스크리닝하였다.
- 실시하였다. Salmonella spp의 최종 확인을 위하여 Vitek system(BioMeriux)과 VIDAS (bioMeriux)를 이용하여 스크리닝하였다.
- 용혈능을 검사하였다. catalase, coagulase 및 당분해시험를 실시하였다. S aureus의 최종 확인을 위해 Vitek system(bioMeriux) 과 VIDAS(bioMeriux)에서 스크리닝하였다.
- 광주지역에서 유통되는 소고기 145건에 대하여 유통단계별 병원성 미생물의 오염수준을 도축단계, 운반 . 가공단계 및 소비단계로 구분하여 검사한 결과, 주요 병원성 미생물의 검출률은 소비단계에서 23.
- 광주지역에서 유통되는 소고기 145건에 대하여 유통단계별로 병원성 미생물 오염정도를 조사하고 도축단계의 식육에 대하여 일반세균수와 대장균수를 모니터링하였다.
- 동정 및 최종 확인 시험 : MacConkey agar 에서 lactose 분해 집락 및 EMB agar에서 녹색의 금속광택을 보이는 집락에 대해 E coli 0157항혈청을 이용한 응집반응을 실시하고⑸, 응집이 일어나는 균에 대해서는 triple sugar Iron, IMVIC시험을 실시하고 Vitek system (bioMeriux)과 VIDAS(bioMeriux)를 사용하여 최종 확인하였다.
- 동정 및 확인 시험 : L monocytogenese] 동정을 위해서 표준균주 staphylococcus aureus (ATCC 25922)를 이용한 CAMP(Christie, Atkin & Munch-Peterson) 시험을 비롯한, 당분해 시험 등 여러가지 생화학적 검사를 실시하였다16) 최종 확인을 위하여 Vitek system (bioMeriux) 과 VIDAS(bioMeriux)를 이용하였다.
- 동정 및 확인 시험 : 분리된 집락을 영양한천 배지에 옮겨 37℃ 에서 18~24시간 배양한 후, 5% 면양 혈액이 함유된 tryptic soy agar에 접종하여 용혈능을 검사하였다. catalase, coagulase 및 당분해시험를 실시하였다.
- 동정 및 확인시험 : 의심스러운 집락에 대해 TSI agar에 천자하여 37 ℃ 에서 18~24시간 배 양하고, 살모넬라균으로 추정되는 균에 대해서는 그람음성의 간균임을 확인하고, 이어 생화학적 검사를 실시하였다. Salmonella spp의 최종 확인을 위하여 Vitek system(BioMeriux)과 VIDAS (bioMeriux)를 이용하여 스크리닝하였다.
- 24시간 배양하였다. 배양액을 PALCAM (polymyxim acriflavin lici cefatazidime esculin mannitol, Difco) 선택배지에 획선 접종하고 37℃, 48시간 배양한 다음, 의심된 집락을 tryptic soy agar에 획선 접종하고 37℃, 24시간 순수 배양하여 용혈성, 운동성, 생화학적 특성 등을 실험하였다.
- 이어서 선택배지로서 용해된 bovine serum 5%와 cefoperazone(4㎖/l )이 추가로 함유된 Campylobacter jejuni-free agar (Difco)에 접종하여 혐기배양기인 Microphilic Bug Box(Ruskinn technology)에서 미 호기적 조건으로 42℃에서 48시간 선택적으로 1차 분리배양을 시도하였다. 2차 분리 배양은 Campylobacter jejuni-free agar(Difco)에서 42℃, 24~48시간 미호기적 조건으로 배양하였다.
- 증균 및 분리 배양 : 검사시료 10g을 90㎖의 buffered peptone water를 첨가하여 37 ℃ 에서 24시간 1차 증균 배양한 후 이 배양액을 2종류의 증균 배지, 즉 selenite cystine broth(Difco) 10㎖에 각각 l㎖를 첨가하고, 동시에 rappaport vassiliadis(Difco) broth 10㎖에 0.1㎖를 첨가하여 각각 37℃및 42℃에서 24시간동안 2차 증균 배양하였다. 각각의 증균 배양액을 xylose lysine desoxycholate(Difco) agar에 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하였다.
- 증균 및 분리 배양 : 검사시료 10g을 stomach bag 에 무균적으로 채취하여 90㎖의 10% NaCl을 첨가한 tryptic soy broth 에 접종하여 35~37℃ 에서 18시간 증균 배양하고, 배양액을 Baird-Parker배지 또는 난황첨가 만니톨 식염 한천배지에 획선 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
대상 데이터
- 유통업체의 운반.가공단계 소고기 36건, 대 . 소형 축산물 판매점과 단체 급식하는 초등학교의 소비단계 소고기 69건, 총 145건을 대상으로 무균적으로 시료를 채취하였다 또한 생고기와 냉장육을 구분하여 실험에 사용하였다.
- 균 분리를 위한 재료는 2000년 5월부터 2000년 10월까지 광주지역 소재 2개의 도축장에서 도축되는 도축단계의 소고기 40건, 축산물 가공공장과 유통업체의 운반.가공단계 소고기 36건, 대 .
- 오염 수준를 검사하였다. 대상으로 삼은 병원성 세균은 E coli O157:H7, salmonella spp, L monocytogenes, S aureus, C jejuni 였으며, 다음과 같은 실험결과를 얻었다.
- 가공단계 소고기 36건, 대 . 소형 축산물 판매점과 단체 급식하는 초등학교의 소비단계 소고기 69건, 총 145건을 대상으로 무균적으로 시료를 채취하였다 또한 생고기와 냉장육을 구분하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
- '축산물의 가공기준 및 성분규격'의 검사 방법에 준하여 실시하였다(3)
성능/효과
- 1. 도축단계 소고기의 일반세균수는 농림부 권장기준 l06cfu/cm2 미만에 못미치는 106cfu/cm2미만으로 나타났다. 또한 대장균 수가 농림부 권장기준 l02cfu/cm2 이하로 검출되었다.
- 2. 유통단계별 병원성 미생물의 오염도는 소비단계에서 232%, 도축단계 12.5%, 운반. 가공단계 5.
- 3. 생고기와 냉장육의 병원성 미생물은 검사한 결과 생고기에서 13.3%, 냉장육에서 16.5%로의 수준으로 검출되었다. 특히 생고기에서 L monocytogenese}- S aureus 가 각각 10.
- 4. 소비단계에서 축산물 판매점의 규모별로 병원성 미생물의 오염도를 비교한 결과 소형점이 28.6%로 대형점 16.7%보다 높게 나타났다. 또한 초등학교급식소를 대상으로 병원성 미생물의 오염수준을 조사한 결과 S aureus가 10건 중 2건이 검출되어 주의 요구되었다.
- 5. 분리된 S aureus의 혈액배지에서의 용혈상은 6용혈 11주, a 와 7용혈주가 각 1 주였으며, 분리된 8건의 L monocytogenes에 대하여 PCR을 실시한 결과 560 bp의 특징적인 밴드를 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 통해 나타난 바와 같이 유통단계별 시료를 대상으로 조사하는 것은 각종 환경의 변화에 따라 여러 단계를 거치면서 오염 수준이 달라질 수 있으므로 체계적이고, 정기적인 조사가 이루어져야 할 것으로 사료되었다.
- PCR 기법을 이용하여 소고기에서 검출된 L monocytogenes 8개의 분리주를 대상으로 DNA를 추출하여 확인한 결과 전기영동상에서 Fig 1과 같이 560 bp크기의 특징적인 양성 증폭 산물을 확인하였다.
- 5%, 운반 . 가공단계 5.6% 수준으로 검출되었고, 검출된 균으로는 S aureus가 9.0%로 가장 많이 검출되었고 L monocytogenes 5.5%, salmonella spp 1.4% 순으로 검출되었다. 중복 검출된 시료는 없었으며 E coll O157:H7과 C jejuni는검출되지 않았다(Table 2).
- 5%, 운반. 가공단계 5.6% 순으로 검출되었고, 검출된 균으로는 S aureus가 9.0%로 가장 많이 검출되었으며, L monocytogenes 5.5%, salmonella spp 1.4% 순으로 검출되었다. 중복 검출된 시료는 없었으며 소고기 에서의 E coli O157:H7와 C jejuni는 검출되지 않았다.
- 운반 . 가공단계 및 소비단계로 구분하여 검사한 결과, 주요 병원성 미생물의 검출률은 소비단계에서 23.2%, 도축단계 12.5%, 운반 . 가공단계 5.
- 광주광역시 도축장의 소고기의 일반세균수는 농림부 권장기준 (l06cfu/cnf 미만에 못미치는 104 cfu/g미만으로 나타났다. 또한 도축장 소고기의 대장균수가 농림부 권장기준(102cfu/cm2)이 하로 검출되었다(Table 1).
- 판매하는 과정에서 미생물의 증식을 초래할 수 있으며, 여러가지 요인에 쉽게 노출되어 부패되거나 병원성 미생물들에 오염되기가 쉽다. 국내 도축장 검사 권장기준 중 소고기에 대한 일반세균수는 5xl06cfu/ cm2미만으로, 대장균수는 102cfu/cm2미만으로 권장하고 있으며, 병원성미생물은 검출되어서는 안 된다고 규정하고 있다(3) 본 연구에서는 일반세균수가 104cfu/g미만으로서 도축장의 위생 상태가 양호하였으며, 대장균수도 권장기준치(102cfu/c 而 이하로 검출되어 대체적으로 양호한 편이었다.
- 또한 법상의 일반규칙을 보면 병원성 미생물인 E coli O157H7, salmonella spp, staphylococcus aureus, vibrio parahemolyticus, Clostridium spp, listeria monocytogenes 등이 검출되어서는 아니되며, 식육 및 유제품에서는 결핵균, 탄저균 및 부루셀라균이검출되어서는 아니된다(3).
- 7%보다 높게 나타났다. 또한 초등학교급식소를 대상으로 병원성 미생물의 오염수준을 조사한 결과 S aureus가 10건 중 2건이 검출되어 주의 요구되었다.
- 병원성 미생물의 오염으로 최근 문제시 되고있는 초등학교 급식소를 대상으로 조사한 결과, listeria spp는 분리되었으나 L monocytogenese: 분리되지 않았고 S aureus는 20.0% 의 검출률을 보였다(Table 5).
- 손 이외의 피부에서는 10~20%에서 최대 40%까지 균이 검출되기도 하며, 또한 시판되는 각종 식품에서도 이 균이 높은 비율로 검출되는 것으로 알려져 있다19). 본 연구에서는 S aureus가 9.0% 수준으로 검출되었고, 특히 도축단계에서 12.5%로 가장 높게 나타났고, 소비단계에서 10.1% 운반가공단계에서 2.8% 수준으로 도축단계에서 가장 많이 검출된 점은 작업원들의 위생관념과 작업도구의 위생 상태에 문제가 많이 있음을 알 수 있었다9)특히 작업 시간에 잡담을 하거나 담배를 피우는 일체의행동도 자제되어야 할 것이며, 소고기의 병원성 미생물오염 방지를 위한 HACCP7} 중요함을 인식할 수 있었다. 강 등19)은 S aureuse} 톡성을 파악할 목적으로 coagulase type, hemolysin type 및 enterotoxin type과의 관계를 조사하여 coagudase 양성균 276주중 68.
- 생고기와 냉장육에서의 병원성미생물을 검사한 결과, 생고기에서는 13.3%의 수준을 나타내었고, 냉장육에서 16.5%의 높은 수준으로 검출되었다. 특히 생고기에서는 L monocytogenes 가 30건 중 3건이 분리되어 생고기에서만 10.
- 소비단계의 소고기 판매점의 규모별로 병원성 미생물을 분리한 결과 소형식육점에서 28.6%의 검출률을 보였고 대형에서는 16.7%의 검출률을 보였다. 특히 대형 축산물판매점에서 S aureus7\ 4건이 분리되어 16.
- 7%의 검출률을 보였다. 특히 대형 축산물판매점에서 S aureus7\ 4건이 분리되어 16.7%의 검출률을 보인 반면, 소형 판매업소에서는 L monocytogenes 7건(20.0%), salmonella spp 2건 (5.7%)의 검출률을 보였다(Table 4).
후속연구
- 또한 정부에서 추진 중인 도축장의 HACCP 추진이 초기부터 철저히 수행되어야 할 것으로 보며, 축산물작업장에서도 이에 발맞춰 성실한 준비와 시설개선 등 강도 높은 변신이 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이후에도 계속 발생되고 있으며 기타 호주, 캐나다, 영국을 비롯한 지구촌 여러 나라에서도 발생되고 있는 실정이다21). 본 연구에서는 E coli O157:H7이 검출되지 않았으나 앞서 언급한 사항들이 우리의 현실일 수 있으므로 지속적인 감시가 요구된다.
- 분리된 S aureus의 혈액배지에서의 용혈상은 6용혈 11주, a 와 7용혈주가 각 1 주였으며, 분리된 8건의 L monocytogenes에 대하여 PCR을 실시한 결과 560 bp의 특징적인 밴드를 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 통해 나타난 바와 같이 유통단계별 시료를 대상으로 조사하는 것은 각종 환경의 변화에 따라 여러 단계를 거치면서 오염 수준이 달라질 수 있으므로 체계적이고, 정기적인 조사가 이루어져야 할 것으로 사료되었다.
- 이상의 본 연구에서 나타난 바와 같이 유통단계별 시료를 대상으로 조사하는 것은 각종 환경의 변화에 따라 여러 단계를 거치면서 오염 수준이 달라질 수 있으므로 체계적이고, 정기적인 조사가 이루어져야 할 것으로 본다. 또한 정부에서 추진 중인 도축장의 HACCP 추진이 초기부터 철저히 수행되어야 할 것으로 보며, 축산물작업장에서도 이에 발맞춰 성실한 준비와 시설개선 등 강도 높은 변신이 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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