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문제 정의
- 본 연구에서는 백합화분의 형질전환과 기내배양을 통한 항궤양 백신으로의 개발이 기대되는 H. pyloriS] UreB 단백 질의생성을 확인함으로써 화분을 일회성의 단백질 생산공장으로의 이용 가능성을 제시하였다. 현재까지 개발된 생물공장의 개념은 모두 형잘전환된 세포나 생물체를 지속적으로 유지하면서 세심한 관리 및 조절을 통한 이들의 증식과 생장에 따라 그로부터 재조합단백질을 생산하는 것이었다.
- 따라서 본 연구에서는 원예산업적으로 그 재배 규모가 크면서 또한 많은 양의 화분을 생산하는 백합식물을 선택하여 그 화분의 기내배양과 vacuum infiltration과 Agrobacterium을 이용한 형질전환 및 화분관신장을 통하여 항궤양 식용백신용 단백질로 잘 알려져 있는 Helicobacter py/ori의 urease단백질의 발현을 시도하였다. 이를 토대로 재조합 단백질을 초단기간내에 생산할 수 있는 가능성을 가늠하고자 하였다.
제안 방법
- H. pylori urease유전자 chistei를 포함하는 pH808 plasmid 를 이용한 PCR에 의하여 1.7 kb ureB DNA절편을 pT7BlueR vector0]] cloning 후 이를 GUS DNA를 제거한 pBI121 에 subcloning하여 pBI/UreB를 제조하였다(Figure 1). PCR cloning 을 위한 primer제조 시에는 pBI121 의 cloning위치인 Xbal (ureB start condon을 지닌 forward primer의 upstream 부위에 포함)과 Sad (ureB stop codon에 이어서 포함시킨 reverse primei를 제작)위치를 포함시켜 실행하였다.
- 7 kb ureB DNA절편을 pT7BlueR vector0]] cloning 후 이를 GUS DNA를 제거한 pBI121 에 subcloning하여 pBI/UreB를 제조하였다(Figure 1). PCR cloning 을 위한 primer제조 시에는 pBI121 의 cloning위치인 Xbal (ureB start condon을 지닌 forward primer의 upstream 부위에 포함)과 Sad (ureB stop codon에 이어서 포함시킨 reverse primei를 제작)위치를 포함시켜 실행하였다. pT/UreB의 경우 제한효소 및 부분적인 양방향 DNA sequencing에 의하여 ureB 염기서열을 확인하였고 pBI/UreB가 도입된 A.
- Vacuum infiltration을 수반한 Xgrobacw沮m 에 의한 형질 전환과정을 거쳐 발아배양시킨 화분은 액체질소를 이용하여 곱게 분말로 만든 후, CTAB추출방법(20)으로 genomic DNA를 분리하였으며 이에 대하여 1.7 kb ureB DNA의 제조를 위하여 사용한 primer를 이용하여 PCR을 수행하고 1.2% agarose gel상에서 확인하였다.
- pyZori의 ureB 유전자를 재조합한 pBI/UreB를 사용하였다. pBI/UreB의 제작을 위하여 forward primer (ATCCTAGAATGAAAAAGATTAGCA) 와 reverse primer (GAGCTCCTAGAAAATGCTAAAGAG)를 준비하고 H. pylori urease cluster를 지니는 pH808 plasmid(대구가톨릭대 이만형 교수)를 template로 사용하여 PCR을 수행하였다(30 cycle: 94°C, 30 sec; 54°C, 40 sec; 72°C, 2 min). 결과로서 얻은 1.
- 7 kb의 areB DNA 절편은 pT7BlueR(Novagene)에 접합하여 pT/UreB를 제조하였다. pT/UreB를 XZ, aI과 Sacl으로 절단하여 얻은 1.7 kb ureB DNA는 식물발현벡터인 pBI 121 (Clonetech) 을 XZwI과 SacI으로 절단하여 GUS 유전자를 제거한 위치에 대체 삽입하였다(pBI/UreB).
- PCR cloning 을 위한 primer제조 시에는 pBI121 의 cloning위치인 Xbal (ureB start condon을 지닌 forward primer의 upstream 부위에 포함)과 Sad (ureB stop codon에 이어서 포함시킨 reverse primei를 제작)위치를 포함시켜 실행하였다. pT/UreB의 경우 제한효소 및 부분적인 양방향 DNA sequencing에 의하여 ureB 염기서열을 확인하였고 pBI/UreB가 도입된 A. tume faciens A136에서도 그 재조합 plasmid를 다시 분리하여 제한효소 처리에 의한 확인을 실시하였다.
- ureB mRNA발현을 측정하기 위하여 pT/UreB의 XZ, aI과 SacI처리에 의한 1.7 kb DNA를 준비하고 [a-32P]dCTP< 이용한 random primed DNA labelling kit (Roche Molecular Biochemicals)의 지침에 따라서 probe를 제작하였다. 신장 화분으로부터의 RNA는 액체질소를 이용하여 분말화한 화분을 guanidine isothiocyanate^ 포함하는 RNA extraction buffer를 이용하여 추출하였다(20).
- pylori urease cluster를 지니는 pH808 plasmid(대구가톨릭대 이만형 교수)를 template로 사용하여 PCR을 수행하였다(30 cycle: 94°C, 30 sec; 54°C, 40 sec; 72°C, 2 min). 결과로서 얻은 1.7 kb의 areB DNA 절편은 pT7BlueR(Novagene)에 접합하여 pT/UreB를 제조하였다. pT/UreB를 XZ, aI과 Sacl으로 절단하여 얻은 1.
- 화분의 저장은 꽃밥상태로 -70 °C 에 보관하였고 저장 기간이 길어짐으로써 발아율이 약간 감소하는 것을 관찰할 수 있었으나 일년 정도의 경과 시에도 70-80%의 발아율은 유지되었다. 기내에서의 배양을 위하여 화분을 7% sucrose가 첨가된 PGM에서 발아/신장을 시켰을 때 정상적으로 16-24 시간 내에 충분한 화분관신장이 이루어지는 것을 관찰하였다(Figure 2). 화분의 형질전환을 위하여 500 mg의 화분을 PGM에 조심스럽게 현탁시킨 후 27°C에서 1-2 시간을 배양시킨 후 현미경 하에서 발아부위가 형성될 시기에 이르러서 이를 Agrobacterium 배양액과 섞어 vacuum infiltration 과정을 거치는 형질전환에 사용하였다.
- 수 있다. 따라서 본 연구에서는 원예산업적으로 그 재배 규모가 크면서 또한 많은 양의 화분을 생산하는 백합식물을 선택하여 그 화분의 기내배양과 vacuum infiltration과 Agrobacterium을 이용한 형질전환 및 화분관신장을 통하여 항궤양 식용백신용 단백질로 잘 알려져 있는 Helicobacter py/ori의 urease단백질의 발현을 시도하였다. 이를 토대로 재조합 단백질을 초단기간내에 생산할 수 있는 가능성을 가늠하고자 하였다.
- 화분관 신장이 완성된 경우 이들은 배지에서 보통 서로 엉켜있음으로 수집하기가 용이하였는데 이들을 유전자도입 및 발현분석에 사용하였다. 유전자도입의 확인을 위하여 화분에서 유전체 DNA를 분리하고 이를 주형 DNA로 이용하여 PCR을 실시하였으며 1% agarose gel에서 그 산물을 확인하였다(Figure 3). pBI/UreB 를 형질전환시킨 화분의 DNA에서는 성공적으로 1.
- 추출단백질은 SDS-10%PAGE로 분리 후 Hybond-P membrane에 단백질을 옮겨 Western blotting 분석에 사용하였다 일차 항체는 토끼의 anti-//, pylori urease IgG, 2차 항체는 염소의 anti-rabbit IgG HRP-conjugate를 사용하여 ECL system으로 그 결과를 관찰하였다(Figure 5). E.
- 화분으로부터 추출한 단백질을 UreB 단백질분석에 이용하였다. 추출단백질은 SDS-10%PAGE로 분리 후 Hybond-P membrane에 단백질을 옮겨 Western blotting 분석에 사용하였다 일차 항체는 토끼의 anti-//, pylori urease IgG, 2차 항체는 염소의 anti-rabbit IgG HRP-conjugate를 사용하여 ECL system으로 그 결과를 관찰하였다(Figure 5).
- agar 배지에서 선발하였다. 화분으로의 유전자도입을 위하여 pBI/UreB로 형질전환시킨 Agrobacte血m을 1-2 시간 미리 배양한 백합화분과 섞어 vacuum infiltration을 실시하였다. 즉, km과 streptomycin(sm) 이 각각 50 mg/L가 첨가된 LB 액체배지에서 沥을 배양하고 배양액 1 mL을 원심분리 (13, 000 rpm, 2 min)하여 수집한 균체를 PGM 1 mW] 재현 탁한 후 백합화분의 배양액 (500 mg/50 mL)에 균일하게 섞었다.
대상 데이터
- 백합("血m longiflorum)^] 꽃에서 떼어낸 수술로부터 화분을 수집하였으며 사용할 때까지 -70°C에 보관하였다. 500 mg -1 g 의 백합화분을 50 mL의 화분발아배지 (pollen growth media, PGM: 1.
- 화분도입유전자로서 H. pyZori의 ureB 유전자를 재조합한 pBI/UreB를 사용하였다. pBI/UreB의 제작을 위하여 forward primer (ATCCTAGAATGAAAAAGATTAGCA) 와 reverse primer (GAGCTCCTAGAAAATGCTAAAGAG)를 준비하고 H.
이론/모형
- pBI/UreB를 도입한 화분에서의 ureB 유전자의 발현을 통한 mRNA의 생성은 northern blot에 의하여 확인하였다 (Figure 4). Vacuum infiltration과정을 모두 거친 비 형질전환 화분, A.
- 재조합 DNA는 fteeze-thaw방법에 의하여 Agrobacterium tumefaciens A136에 도입 후(19) kanamycin(km)을 포함하는 LB agar 배지에서 선발하였다. 화분으로의 유전자도입을 위하여 pBI/UreB로 형질전환시킨 Agrobacte血m을 1-2 시간 미리 배양한 백합화분과 섞어 vacuum infiltration을 실시하였다.
성능/효과
- 유전자도입의 확인을 위하여 화분에서 유전체 DNA를 분리하고 이를 주형 DNA로 이용하여 PCR을 실시하였으며 1% agarose gel에서 그 산물을 확인하였다(Figure 3). pBI/UreB 를 형질전환시킨 화분의 DNA에서는 성공적으로 1.7 kb의 DNA단편이 합성되는 것을 확인하였으며 비형질전환시킨 화분 또는 pBI121 형질전환화분에서는 결과가 나타나지 않았다 (Figure 3). 이로써 Agrobacterium을 통한 vacuum infiltration에 의하여 화분으로의 유전자도입이 확인되었는데 다만 화분의 특성상 화분관의 핵으로의 도입 또는 화분관내 정핵 세포핵으로의 도입인지는 규명하지는 않았다.
- tumefaciens A136/pBI121 을 도입한 화분에서의 total RNA를 분리하여 이를 30 #g 정도를 1% formaldehyde gel 에서 분리하여 Northern blot hybridization을 통한 분석을 실시하였는데 이들로부터의 ureB mRNA생성은 관찰되지 않았다. 그러나 pBI/UreB도입화분으로부터의 RNA에서는 1.7 kb ureB mRNA의 생성을 관찰할 수 있음으로써 CaMV35S promoter에 의한 유전자 발현이 신장화분 내에서 정상적으로 일어남을 확신할 수 있었다.
- tumefaciens A136/ pBIUreB도입 화분에만이 관찰될 수 있었다. 따라서 UreB단백질의 생성이 확인되었는데 다만 그 발현량에 있어서 densitometry 분석에 의할 경우 화분관의 전체 수용성 단백질의 0.01-0.05% 정도로 나타남으로써 발현증대방법이 강구되어야 할 것으로 본다. 한편, 식물체로부터의 조 추출 단백질을 이용한 western blotting과 비교 시, 신장화분의 단백질은 거의 비특이적 항원항체반응이 관찰되지 않았다.
- 근처 농원에서 수집한 개화시기의 백합은 절화상태로 조직배양실(26°C, 16 hr day-light)로 옮겨 개화를 촉진하였으며 이들의 꽃밥이 성숙하여 화분이 상당부분 노출되었을 때 꽃밥을 수집하고 stameless sieve에 통과시킴으로써 화분을 따로 모을 수 있었다. 화분의 저장은 꽃밥상태로 -70 °C 에 보관하였고 저장 기간이 길어짐으로써 발아율이 약간 감소하는 것을 관찰할 수 있었으나 일년 정도의 경과 시에도 70-80%의 발아율은 유지되었다. 기내에서의 배양을 위하여 화분을 7% sucrose가 첨가된 PGM에서 발아/신장을 시켰을 때 정상적으로 16-24 시간 내에 충분한 화분관신장이 이루어지는 것을 관찰하였다(Figure 2).
후속연구
- 그러나 자연 상태의 화분은 필요한 경우에서만 형질전환을 실시하고 1-2일 내에 모든 배양작업을 마침으로써 지속적인 관리가 전혀 필요치 않다. 본 연구에서는 백합화분을 이용하였으나 화분을 대량으로 생산할 수 있는 식물도 충분히 재조합단백질의 생산을 위한 일회성 공장으로의 사용이 가능할 것으로 예측하고 있다.
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