본 연구에서는 1998년부터 2003년 하계까지 약배양 기법 및 콜히친 처리를 이용하여 개발한 '삼강벼/낙동벼' DH(doubled-haploid) 183계통의 주요 농업 형질을 조사$.$분석하였다. DH 집단의 주요 농업형질을 조사한바 초장, 간장, 수장, 삼절간장, 수수 및 출수일수는 양적형질의 특징인 넓은 범위의 변이폭, 연속적인 빈도 분포양상 및 양친을 초월하는 초월분리 현상을 보였다. SSR 마커를 이용한 유전자지도의 작성에는 양친에 다형성을 나타내는 136개의 마커를 사용하였다. 작성된 유전자 지도는 전체 길이가 1,909cM이었으며, 마커간 평균길이는 14 cM을 나타내었다.
본 연구에서는 1998년부터 2003년 하계까지 약배양 기법 및 콜히친 처리를 이용하여 개발한 '삼강벼/낙동벼' DH(doubled-haploid) 183계통의 주요 농업 형질을 조사$.$분석하였다. DH 집단의 주요 농업형질을 조사한바 초장, 간장, 수장, 삼절간장, 수수 및 출수일수는 양적형질의 특징인 넓은 범위의 변이폭, 연속적인 빈도 분포양상 및 양친을 초월하는 초월분리 현상을 보였다. SSR 마커를 이용한 유전자지도의 작성에는 양친에 다형성을 나타내는 136개의 마커를 사용하였다. 작성된 유전자 지도는 전체 길이가 1,909cM이었으며, 마커간 평균길이는 14 cM을 나타내었다.
A doubled-haploid (DH) population was developed through anther culture of F$_1$ plants obtained from a cross between a japonica cultivar, 'Nagdongbyeo', as male parent and a indica cultivar, 'Samgangbyeo', as female parent. Segregation modes for plant length, culm length, panicle length, ...
A doubled-haploid (DH) population was developed through anther culture of F$_1$ plants obtained from a cross between a japonica cultivar, 'Nagdongbyeo', as male parent and a indica cultivar, 'Samgangbyeo', as female parent. Segregation modes for plant length, culm length, panicle length, third internode length, and days to heading in the DH lines showed nearly normal distribution with wide range of variation. A molecular map with 136 simple sequence repeat (SSR) markers was constructed using the DH population. The total map distance was 1,909 cM and the average interval of marker distance was 14 cM.
A doubled-haploid (DH) population was developed through anther culture of F$_1$ plants obtained from a cross between a japonica cultivar, 'Nagdongbyeo', as male parent and a indica cultivar, 'Samgangbyeo', as female parent. Segregation modes for plant length, culm length, panicle length, third internode length, and days to heading in the DH lines showed nearly normal distribution with wide range of variation. A molecular map with 136 simple sequence repeat (SSR) markers was constructed using the DH population. The total map distance was 1,909 cM and the average interval of marker distance was 14 cM.
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문제 정의
본 연구에서는 분자유전학적 기법을 이용한 육종연구의 효율성 증가를 위해 벼의 분자 유전자 지도 작성을 위한DH 집단의 개발과 SSR (simple sequence repeat) 마커를이용한 유전자 지도 작성에 관한 몇 가지 실험을 수행하여 얻어진 결과를 보고하는 바이다.
분석하거나 5%의 denaturing polyacrylamide 젤로 전기영동 후 silver staining kit를 이용하여 관찰하였다., 삼강벼'와 '낙동벼'에 다형성을 보이는 marker 선발을 위하여SSR marker 598개의 DNA marker와 양친의 genomicDNA간의 관계를 분석하였다.
약으로부터 재분화된 식물체를 중분히 생장시킨 다음 순화처리 후 활착이 양호한 개체를 플라스틱 폿트에 재배하여 개체별로 채종하고 반수체의 경우는 콜히친 처리로 염색체를 배가시켰다. 1998년부터 2002년까지 양성된 '삼강벼/낙동 벼, 조합의 DH 집단을 2002년과 2003년 하계 포장에 각 계통별로 주당 1본씩, 30x15 cm의 재식 밀도로 이앙하고 출수기, 간장, 수장을 포함한 주요 특성을 계통별로 조사하였다.
1 mg/L), sorbitol (20 g/L) 및 gelrite (5 g/L)가 첨가된 Chu(1977) 배지에 배양하여 캘러스를 형성시켰다. 30〜40일동안 형성된 캘러스를 kinetin (2.0 mg/L), IAA (0.2 mg/L), sucrose (30 g/L) 및 gelrite (5 g/L)가 첨가된 Chu (1977)배지에 이식하여 50일 동안 식물체를 재분화시켰다. 약으로부터 재분화된 식물체를 중분히 생장시킨 다음 순화처리 후 활착이 양호한 개체를 플라스틱 폿트에 재배하여 개체별로 채종하고 반수체의 경우는 콜히친 처리로 염색체를 배가시켰다.
primer중 일부의 sequence를 사용하였다. PCR은 Gene Amp PCR system 9600을 사용하였으며, 증폭을 위한 시약의 조성은 genomic DNA 가 10 ~ 15 ng/㎕이고, dNTP 및 taq-polymerase는 각각 200 pM과 0.1 unit 농도였으며 각각의 primer는 SSR marker를 이용하였다 (McCouch et al 2002). PCR 증폭은 96℃에 5분간, 그 후의 변성은 96℃에서 30초, annealing은 55〜60 ℃ 에서 30초, 그리고 DNA 합성은 72℃에서 1분간으로 총 45 cycle을 실행하였고, 최종 DNA 합성은 72 ℃ 에서 7분간으로 하였다.
본 연구에서는 1998년부터 2003년 하계까지 약배양 기법 및 콜히친 처리를 이용하여 개발한 '삼강벼/낙동벼' DH (doubled-haploid) 183계통의 주요 농업 형질을 조사 - 분석하였다. DH 집단의 주요 농업형질을 조사한바 초장, 간장, 수장, 삼절간장, 수수 및 출수일수는 양적형질의 특징인 넓은 범위의 변이폭, 연속적인 빈도 분포양상 및 양친을 초월하는 초월분리 현상을 보였다.
0, 마커간 거리 한계는 10 cM을 기준으로 분석하였다. 분석 방법은 모, 부본을 따르는 SSR 마커를 분석하여, 삼강벼/낙동벼, 조합의 183개의 DH계통 중에서 무작위로 선발되어진 94개 DH계통의 DNA를 이용하여 map을 작성하였다. 우선 group 명령을 이용하여 각 염색체별로 나눈 뒤 three point와 order를 LOD>3.
합성된 DNA는 3%의 agarose gel로 전기영동 후 band의 분리여부를 비교 . 분석하거나 5%의 denaturing polyacrylamide 젤로 전기영동 후 silver staining kit를 이용하여 관찰하였다., 삼강벼'와 '낙동벼'에 다형성을 보이는 marker 선발을 위하여SSR marker 598개의 DNA marker와 양친의 genomicDNA간의 관계를 분석하였다.
선발된 SSR marker 136개를 이용하여 Mapmaker program 에 의한 연관관계를 분석하여 'Samgangbyeo/Nagdongbyeo' DH 집단의 유전자 지도를 작성하였다 (Figure 3). 작성되어진 유전자 지도의 총 길이는 1, 909 cM이고 마커간 평균길이는 14 cM이었다.
2 mg/L), sucrose (30 g/L) 및 gelrite (5 g/L)가 첨가된 Chu (1977)배지에 이식하여 50일 동안 식물체를 재분화시켰다. 약으로부터 재분화된 식물체를 중분히 생장시킨 다음 순화처리 후 활착이 양호한 개체를 플라스틱 폿트에 재배하여 개체별로 채종하고 반수체의 경우는 콜히친 처리로 염색체를 배가시켰다. 1998년부터 2002년까지 양성된 '삼강벼/낙동 벼, 조합의 DH 집단을 2002년과 2003년 하계 포장에 각 계통별로 주당 1본씩, 30x15 cm의 재식 밀도로 이앙하고 출수기, 간장, 수장을 포함한 주요 특성을 계통별로 조사하였다.
양친과 잡종세대 및 DH집단의 종자를 파종하고 25℃에서3주간 재배한 후 기존의 CTAB법 (Murray and Thompson 1980)을 변형하여 다음과 같이 DNA를 추출하였다. 각 식물체의 건전한 잎 1〜3 g을 막자사발에 넣고 액체질소로 급냉동시킨 상태에서 미세한 분말로 마쇄하고, 2xCTAB buffer 2 mL과 IxCTAB 1 mL를 넣어 혼합한 다음, 15 mL cap-tube에 옮겨서 55 ℃에 30〜60분 동안 반응시키면서 2~3회 가볍게 혼합한다.
분석 방법은 모, 부본을 따르는 SSR 마커를 분석하여, 삼강벼/낙동벼, 조합의 183개의 DH계통 중에서 무작위로 선발되어진 94개 DH계통의 DNA를 이용하여 map을 작성하였다. 우선 group 명령을 이용하여 각 염색체별로 나눈 뒤 three point와 order를 LOD>3.0 이상에서 분석하여 각 marker의 배열 순서를 결정하였다. LOD>3.
유전자 지도의 작성을 위한 DH 집단을 육성하고자 벼멸구에 저항성 품종인 '삼강벼'를 자방친으로 감수성 품종인 '낙동벼'를 화분친으로 인공교배하여 양성된 두 조합 H의 1핵성 소포자기의 약을 배양하였다. , 98/, 99 동계에서부터 2003년 하계까지 '삼강벼/낙동벼' 조합에서 54, 000 약 이상을 배양하였으나 조합이 원연교잡된 관계로 식물체 분화율은 저조한 경향이었다.
3). 이 중 포장시험이 가능할 정도로 종자량이 충분히 채종된 183계통에 대해서만 주요 포장 생육특성을 조사하였다.
0에서 구분되지 않은 marker는 LOD 값을 올려 1차적으로 작성된 map 상에 try 명령을 이용하여 최종 map상에 삽입 시켰다. 이러한 방법을 이용하여 각 염색체 별로 최적의 map 을 작성하였다.
대상 데이터
DH 집단의 주요 농업형질을 조사한바 초장, 간장, 수장, 삼절간장, 수수 및 출수일수는 양적형질의 특징인 넓은 범위의 변이폭, 연속적인 빈도 분포양상 및 양친을 초월하는 초월분리 현상을 보였다. SSR 마커를 이용한 유전자지도의 작성에는 양친에 다형성을 나타내는 136개의 마커를 사용하였다. 작성된 유전자 지도는 전체 길이가 1, 909 cM이었으며, 마커간 평균길이는 14 cM을 나타내었다.
본 실험에 사용되어진 SSR 마커는 Panaud 등 (1996)의 SSR primer중 일부의 sequence를 사용하였다. PCR은 Gene Amp PCR system 9600을 사용하였으며, 증폭을 위한 시약의 조성은 genomic DNA 가 10 ~ 15 ng/㎕이고, dNTP 및 taq-polymerase는 각각 200 pM과 0.
데이터처리
유전자 지도의 작성은 Macintosh iMac 의 MAPMAKER 2.0 program을 이용하여 분석하였으며, LOD (logarithm of odds) score는 3.0, 마커간 거리 한계는 10 cM을 기준으로 분석하였다. 분석 방법은 모, 부본을 따르는 SSR 마커를 분석하여, 삼강벼/낙동벼, 조합의 183개의 DH계통 중에서 무작위로 선발되어진 94개 DH계통의 DNA를 이용하여 map을 작성하였다.
성능/효과
'삼강벼'와 '낙동벼'의 어린잎 (30일묘)의 DNA를 추출하고 PCR 증폭을 위한 DNA 량을 조절하여 총 598개의 SSR marker를 사용하여 parent screening한 결과 다형성을 보이는 136개의 SSR marker를 선발할 수 있었다 (Table 4, Figure 2).
DH 집단의 주요 농업형질을 조사한바 초장, 간장, 수장, 삼절간장, 수수 및 출수일수는 양적형질의 특징인 넓은 범위의 변이폭, 연속적인 빈도 분포양상 및 양친을 초월하는 초월분리 현상을 보였다. SSR 마커를 이용한 유전자지도의 작성에는 양친에 다형성을 나타내는 136개의 마커를 사용하였다.
분석된 SSR marker의 유전자좌들의 분리비는 53%만 DH계통의 기대 분리비인 1:1에 적합하였고 나머지 47% (P M0.05)는 삼강벼나 낙동벼에 치우치는 경향을 나타내었다. 이 결과는 Xiao 등 (1996)이 F8 재조합자식성 유전집단을 이용하여 얻은 36.
, 98/, 99 동계에서부터 2003년 하계까지 '삼강벼/낙동벼' 조합에서 54, 000 약 이상을 배양하였으나 조합이 원연교잡된 관계로 식물체 분화율은 저조한 경향이었다. 약배양 후 30일 동안 조사된 교배친과 Fi의 캘러스 형성률은 양친의 평균치보다 다소 높게 나타났으나, 캘러스를 명상태로 옮긴 후 50일 동안 조사된녹색체 분화율은 양친의 평균치보다 낮은 경향을 나타내었다 (Table 1).
약으로부터 재분화된 식물체는 시험관에서 충분히 생장시킨 다음 수경액에 20일 동안 재배한 후 활착이 양호한 개체를 온실에 재배하면서 각 조합별로 배수성을 조사한 바,전체의 약 73.5%가 2배체로 조사되었다 (Table 2).
SSR 마커를 이용한 유전자지도의 작성에는 양친에 다형성을 나타내는 136개의 마커를 사용하였다. 작성된 유전자 지도는 전체 길이가 1, 909 cM이었으며, 마커간 평균길이는 14 cM을 나타내었다.
후속연구
이렇듯 여러 가지 방법 및집단을 이용한 분자 유전자 지도작성의 최종적인 목표는 바로 육종으로의 활용에 있다. 즉 분자 유전자 지도상에 작물학적으로 중요한 농업형질을 지배하는 유전자들을 mapping하고 이와 관련된 DNA 마커를 선발하게 되면 마커 검정에 의해 실용형질을 선발하는 분자육종기술의 실용화가 가능하게 될 것이다. 특히 환경에 영향을 많이 받는 양적형질의 개량이나 생물검정에 의해 선발하는 내병충성 육종분야에서 DNA 마커의 이용 효율은 더욱 높아지게 될 것이다.
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