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문제 정의
- 본 연구에서는 RGAP의 이화학적 특성을 알아보기 위해 당조 성을 분석하였고 항암작용을 알아보기 위해 in vitro 또는 in vivo 에서 macrophage와 NK 세포의 암세포 살해 능을 조사하였다. 또한 sarcoma 180 이식 쥐에서 수명연장율 및 B16 melanoma 이 식 쥐에 RGAP를 투여 시 나타나는 항암효과를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 RGAP의 항암 활성을 B16 melanoma와 sarcoma 180세포를 이식한 마우스에서 조사한 결과, 현저하게종양생성이 억제되고 수명이 연장되어 RGAP가 홍삼을 이용한새로운 의약품 소재로서의 개발 가능성을 시사하였다. 이러한 RGAP의 항암효과는 macrophage 및 NK 세포의 활성화에 의해기인됨을 나타내었다.
- 버섯류에서 분리된 다당체 성분의 lentinan, polysaccharide K등은 암 치료의 보조제로서 활용이 되고 있으며홍삼으로부터 분리된 산성 다당체도 선천적 면역계의 가장 주요한 macrophage 와 NK 세포를 활성화시켜서 면역증강과 항암효과를 갖는 의약품으로서의 개발 가능성을 보이고 있다. 이와 같은 개발을 위하여 RGAP의 지표물질로서 보다 정제된 분획을 분리하여 구조를 연구 중에 있으며 아울러 면역증강과 항암 작용에 관련된 기작을 연구하고자 한다.
제안 방법
- 수컷과 C57BL/6계 마우스 수컷 및 ICR계 마우스 수컷을 대한바이오링크(충북, 음성)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 4-5주령의 동물을 입수하여 무작위로폴리카보네이트 cage에 5마리씩 분리 수용하여 최소한 1주 이상 순화시켰으며, 사료(삼육)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다. 동물실의 환경 조건은 실내온도 23±3℃, 상대습도는 40- 60%를 유지하였고, 150-300 Lux의 조도로 12시간씩 명암을조절하였다.
- 5츠령의 BALB/c 마우스에 1 m/의 thioglycollate medium (Difcc>을 3일전에 복강 주사하거나 RGAJ를 1일 1회 연속 7일간복강즈*하였다. BALB/c 마우스의 복강으로부터 10 U/m/ heparn을 함유하는 RPMI 1640 complete 배지로 복강삼출세포를 화F云-고 hemacytometer로 세포 수를 즉정하여 총 복강 세포수(PEC)로 하였다.
- B16 melanoma는 IxlV개의 세포를 C57BL/6 마우스의 등에 피하이식 24시간 후에 RGAP를 1일 1회 7일간 복강 투여하여 생성된 종양의 무게를 측정하였다.
- BALB/c 마우스의 복강으로부터 10 U/m/ heparn을 함유하는 RPMI 1640 complete 배지로 복강삼출세포를 화F云-고 hemacytometer로 세포 수를 즉정하여 총 복강 세포수(PEC)로 하였다. Tbflon으로 코팅한 plastic dish에서 2시간 배양하6 부착되지 않는 세포를 제거하고 순수한 macrophage를 얻었다.
- NK 세포 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 RGAP를 100, 300 ㎎/㎏ 용량으로 7일간 C57BL/6 마우스에 복강투여 한 후 비장 세포를 effector 세포로 하고 YAC-1 lymphoma 세포를 표적세포로 사용하여 NK 세포의 활성을 측정하였다. RGAP 투여는 effector 세포와 표적 세포의 각 비율(25 :1, 50 : 1, 100 :1)에서 NK 세포의 활성을 유의적으로 증가시켰다(Fig.
- 측정하였다. RGAP 투여는 effector 세포와 표적 세포의 각 비율(25 :1, 50 : 1, 100 :1)에서 NK 세포의 활성을 유의적으로 증가시켰다(Fig. 3).
- Sarcoma 180 세포는 ICR 마우스의 복강에서 계대배양하여 유지하였으며 IX 106개의 세포를 복강에 이식하고 24시간 후부터 RGAP를 1일 1회 7일간 복강 투여한 후 30일간 수명을 관찰하였다. B16 melanoma는 IxlV개의 세포를 C57BL/6 마우스의 등에 피하이식 24시간 후에 RGAP를 1일 1회 7일간 복강 투여하여 생성된 종양의 무게를 측정하였다.
- TNF-a의 정량은 복강 macrophage의 배양액에 RGAI를 0, 4, 40, 400 의 농도로 처리하고 24시간 배양한 후 배양 상등액을 WEHI 164 세포에 가하여 WEHI 164 세포의 사멸을 정량하는 Lioassay 방법을 사용했다. 양성대조물질로 사용한 LPS는 1 의 농도로 처리 시 TNF-a 생성이 15, 670±47 pg/106 cells 이었:2 며 RGAP는 농도 의존적으로 TNF-a의 생성을 현저하게 증가 시 켰다(Eble II).
- WEHI 164 세포를 96-well 세포배양 dish에 well 당 4x 104개의 세포로 분주하고 37℃의 CO2 배양기에서 18시간 배양한 다음, macrophage 배양상등액 (thioglycollate medium을 주사한 BALB/ c 마우스로부터 macrophage를 분리하여 96-well 세포배양 dish 에 well 당 2X105개의 세포로 분주하고 RGAP를 처리하여 24 시간 배양하여 얻음) 50 pZ, 2 ng/mi actinomycin D 용액 50 와 MEM complete 배지 50 gZ를 첨가하여 18시간 배양하였다. 배양종료후 배지를 제거하고 0.
- 여액과 세척액을 증발건조시켜 alditol을 분리하였다. alditoH 무수초산과 피리딘을 가해 실온에서 하루 동안 방치하여 아세틸화한 후 이로부터 얻은 아세틸 화물은 아래의 GLC 조건으로 분석하여 중성당의 mole 조성을 측정했다. Aldonic acid는 수지를 1.
- 匸淄과■ 같은 조건에서 단당류의 유도체를 분석하였다.
- 4-5주령의 동물을 입수하여 무작위로폴리카보네이트 cage에 5마리씩 분리 수용하여 최소한 1주 이상 순화시켰으며, 사료(삼육)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다. 동물실의 환경 조건은 실내온도 23±3℃, 상대습도는 40- 60%를 유지하였고, 150-300 Lux의 조도로 12시간씩 명암을조절하였다.
- 본 연구에서는 RGAP의 이화학적 특성을 알아보기 위해 당조 성을 분석하였고 항암작용을 알아보기 위해 in vitro 또는 in vivo 에서 macrophage와 NK 세포의 암세포 살해 능을 조사하였다. 또한 sarcoma 180 이식 쥐에서 수명연장율 및 B16 melanoma 이 식 쥐에 RGAP를 투여 시 나타나는 항암효과를 관찰하였다.
- 건조시킨 시료는 10 niM sodium borate에 용해하고 sodium borohydride 20 첨가하였다. 반응물을 냉장고에서 12시간 반웅시키고 증발농측하였다. 농축후 잔사를 pyridine과 acetic anhydride acet3 lation 시켜 alditol acetate를 얻었다.
- Spontanous release의 즉정은 target cell에 배지만 가한 경우이고, maximum release는 10% NP-40 100 p/를 가함 경우의 cpm이다. 배양종료후 1000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 100 B 취하여 Y-counter로 방사능 측정하였고, 활성은 다음과 같은 식으로계산하였다. % specific lysis=(experimental release cpm- spontanous release cpm)/(maximum release q)m-spontanous release cpm) x 100
- WEHI 164 세포를 96-well 세포배양 dish에 well 당 4x 104개의 세포로 분주하고 37℃의 CO2 배양기에서 18시간 배양한 다음, macrophage 배양상등액 (thioglycollate medium을 주사한 BALB/ c 마우스로부터 macrophage를 분리하여 96-well 세포배양 dish 에 well 당 2X105개의 세포로 분주하고 RGAP를 처리하여 24 시간 배양하여 얻음) 50 pZ, 2 ng/mi actinomycin D 용액 50 와 MEM complete 배지 50 gZ를 첨가하여 18시간 배양하였다. 배양종료후 배지를 제거하고 0.05% crystal violet으로 10분간염색한 후 100% methanol로 세척하고 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량곡선은 표준물질로써 사람 재조합 TNF-o* WEHI 164 세포에 첨가하여 18시간 배양하고 crystal violet으로 염색한후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.
- 먼저 WEHI 164 암세포를 세포당 100 eCi 의 N세Cr04를 첨가하여 1시간 배양하여 방사능을 표지시킨 다음 96-well 세포배양 dish에 well 당 以 揷 개의 세포로 분주하고 1 p&E actinomycin D의 존재하에서 3시간 배양했다. 암세포 : macrophage의 비율이 1:1, 1:5, 1:10되게 macrophage를첨가하여 1actinomycin D의 존재하에서 총 200 μ2의 용적으로 6시간 배양시켰다. 배양종료 후 상등액 100 世를 취해 scintillation vial에 담고 y-counterS.
- 밀봉하여 12TC에서 1시간 가수분해하였다. 얻어진 가수분해물을 여과하고 농축하였다. 잔사에 NaBH4 10 mg 을 함유한 1.
- 이 추출물을 흐르는 수돗물에서 7 일간 투석하여, 15 kDa 이상의 고분자가 함유된 투석 내액을 8000 rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 상등액에 EtOH를 가해생성된 침전을 동결 건조하여 산성 다당체(RGAP)를 제조하였다.
대상 데이터
- 6년근 홍삼(양삼 30지) 600 g을 분말로 하여 5배 량의 85% EtOH을 가하고 95℃에서 5회 추출하여 사포닌 등 비수용성 물질을 제거하고 남은 잔사에 물을 가하고 80℃에서 4회 추출하여 수용성 추출물을 얻었다. 이 추출물을 흐르는 수돗물에서 7 일간 투석하여, 15 kDa 이상의 고분자가 함유된 투석 내액을 8000 rpm에서 원심분리하였다.
- Island, NX 미국) 제품을 사용하였다. Cytosine |3-D- arabino-furanoside(ara-C), actinomycin D, TNF-a, Ae-mono- methyl-L-arginine(NMNA), lipopolysaccharide(LPS) 은 Sigma (St. Louis, USA) 제품을 사용하였다.
- Earle's balanced salt solution(EBSS), RPMI 1640, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), Minimum essential medium (MEM), Cae/Mg2*击'ee PBS, penicillin, streptomycin, new bom calf serum 및 fetal bovine serum(FBS) 은 Gibcc사 (Grand Island, NX 미국) 제품을 사용하였다. Cytosine |3-D- arabino-furanoside(ara-C), actinomycin D, TNF-a, Ae-mono- methyl-L-arginine(NMNA), lipopolysaccharide(LPS) 은 Sigma (St.
- Effector cells로서 C57BL/6 마우스 비장세포를 사용하고 target cell로서는 100 piCi의 NaeCrQ로 1시간 표지한 YAC-1 세포(IX①)를 사용하였다. Effector : target 세포의 비율이 100 :1, 50 :1, 25 :1이 되도록 96-well plate에 분주하여 4시간동안 37℃의 CO2 incubator에서 반응시켰다.
- 5 g/L glucose가 함유된 DMEM에서 배양하였고 P815 mastocytoma, WEHI 164 fibrinosarcoma 및 YAC-1 lymphoma는 10% heat- inactivated fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 streptomycin 및 100 U/m/ penicillin0] 함유된 RPMI complete 배7''에서 배양하였다. WEHI 164 Gbrinosarcoma는 10% heat- inacd'7ated FBS, 2 mM glutamin, 100 streptomycin 및 100 r/m/ penicillin이 함유된 MEM으로 배양하였다.
- BALB/c계 마우스 암. 수컷과 C57BL/6계 마우스 수컷 및 ICR계 마우스 수컷을 대한바이오링크(충북, 음성)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 4-5주령의 동물을 입수하여 무작위로폴리카보네이트 cage에 5마리씩 분리 수용하여 최소한 1주 이상 순화시켰으며, 사료(삼육)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균 土 표준편차로 나타내었으며 처리에 의한 결과의 유의성 검정은 student's f-test로 분석하였다.
이론/모형
- 하여 정량하였다. 단백질은 Lowry 법으로2》bovine serum albumin을 표준품으로 정량하고, Libermann-Burchard 반응으로 사포닌 함유 여부를 조사하였다.
- 배양 상등액 중의 TNF-a는 TNF-a 민감성 WEHI 164 세포의세포사를 이용하는 bioassay방법을 사용하여 정량하였다. WEHI 164 세포를 96-well 세포배양 dish에 well 당 4x 104개의 세포로 분주하고 37℃의 CO2 배양기에서 18시간 배양한 다음, macrophage 배양상등액 (thioglycollate medium을 주사한 BALB/ c 마우스로부터 macrophage를 분리하여 96-well 세포배양 dish 에 well 당 2X105개의 세포로 분주하고 RGAP를 처리하여 24 시간 배양하여 얻음) 50 pZ, 2 ng/mi actinomycin D 용액 50 와 MEM complete 배지 50 gZ를 첨가하여 18시간 배양하였다.
- 산성 다당체 분쵝의 중성당, 산성당 및 단백질의 조성비 - 총당은 Phenol-HzSQ법幻)으로 glucose를 표준품으로 하여 정량하였으며, 산성당은 Carbazole-IeSQ법幻)으로 glucuronic acid를 표준품으로 하여 정량하였다. 단백질은 Lowry 법으로2》bovine serum albumin을 표준품으로 정량하고, Libermann-Burchard 반응으로 사포닌 함유 여부를 조사하였다.
성능/효과
- 양성대조물질로 사용한 LPS는 1 의 농도로 처리 시 TNF-a 생성이 15, 670±47 pg/106 cells 이었:2 며 RGAP는 농도 의존적으로 TNF-a의 생성을 현저하게 증가 시 켰다(Eble II). 또한 RGAI를 BALB/c 마우스에 복강 투여하고 븍강 macrophage를 분리하여 WEHI 164 세포의 사멸을 측정한 결고" WEHI 164 세포의 사멸이 RGAP의 투여 용량 의존적으로 현저히 증가되었다(Eble IU).
- 4). B16 melanoma 세포를 C57BV6 마우스에 피하 주사하여 고형암의 생성 정도를조사해 본 결과, RGAP 100 또는 300 ㎎/㎏ 투여군에서는 고형암의 생성이 39%, 53% 억제되었으며 ara-C 10 ㎎/㎏ 투여군에서는 67% 억제되었다(nble IV).
- RGAP는 중성당이 28.3%, 산성 당이 56.9%, 단백질이 0.1%이하로 함유된 다당분획으로 GLC로 분석한 결과, 중성당은 glucose 92.4%, arabinose 5.53%, rhamnose 1.03%, galactose 1.02% °] 었다. 산성당의 GLC 분석 결과는 glucuronic acid 90.
- RGAP의 항암작용을 알아보기 위해 sarcoma 180 세포를 ICR 마우스에 복강으로 이식한 후 30일간의 생존율을 관찰한 결과, 대조군은 20일 이후에는 생존한 마우스가 없었으나 RGAP 100, 300 ㎎/㎏ 투여군에서는 생존율이 각각 57.1%, 85.7% 였으며 ara-C 5 ㎎/㎏ 투여군에서는 28.6%였다(Fig. 4). B16 melanoma 세포를 C57BV6 마우스에 피하 주사하여 고형암의 생성 정도를조사해 본 결과, RGAP 100 또는 300 ㎎/㎏ 투여군에서는 고형암의 생성이 39%, 53% 억제되었으며 ara-C 10 ㎎/㎏ 투여군에서는 67% 억제되었다(nble IV).
- 저자 등은 홍삼으로부터 분리한 15 kDa 이상의 산성 다당체 (Red Ginseng Acidic Polysaccharide, RGAP)를 마우스에 투여 시 macrophage를 증가시키며 nitric oxide synthase를 유도시킴 을 보고하였다. 또한 RGAP의 면역조절 작용이 macrophage에서 유래되는 NO에 의해 매개되어짐을 제시하였다.2°
- 6 1%이었다. 또한 백삼 堂부터 면역 증강작용을 갖는 ginsan 은 산성당이 43.1% 함유에 비하여 RGAP는 산성당이 56.9%를 함유하고 ginsan의 중성당 조성은 glucose와 galactose였으나, *(2) RGAP는 glucose, arabinose, rhamnose, galactose 를 함유하여 gkisan과는 화학적 조성과 구조가 다른 새로운 산성 다당체임을 제시하였다. 본연구 결과, RGAP를 마우스에 투여시 macrophage 를 활성화시켜 NO와 TNF-以의 생성이 증가되고 NK 세포의 활성화가 일어나 암세포를 사멸시킴으로써 항암작용을 나타낼 수 있음을 나타내었다.
- 8%로 증가되었다. 또한, RGAP 400 ng/mZ과 NO 합성 억제제인 NMMA 1 曲를 동시 처리시 NO 생성은 2.3 pM로 감소되었으며 P815 세포의 사멸도 현저하게 억제되어 (Fig. 1), RGAP에 의한 암세포의 사멸이 NO를매개로 일어남을 확인하였다. RGAP를 BALB/c 마우스에 복강투여 후 분리한 복강 macrophage를 P815 암세포와 함께 배양시 배지내의 NO 농도는 대조군에서 4.
- 。와 in 旃o에서 조사하였다. 복강 macrophage에 RGAP를 첨가하고 P815 비만 세포종과 함께 배양했을 때 NO는 RGAP를 0, 4, 40, 400 μg/m/의 농도로 첨가시 각각 2.2, 7.9, 10.6, 33.4 |1M로 증가되었으며, P815 세포의사멸은 각각 0, 10.5, 23.9, 35.8%로 증가되었다. 또한, RGAP 400 ng/mZ과 NO 합성 억제제인 NMMA 1 曲를 동시 처리시 NO 생성은 2.
- 9%를 함유하고 ginsan의 중성당 조성은 glucose와 galactose였으나, *(2) RGAP는 glucose, arabinose, rhamnose, galactose 를 함유하여 gkisan과는 화학적 조성과 구조가 다른 새로운 산성 다당체임을 제시하였다. 본연구 결과, RGAP를 마우스에 투여시 macrophage 를 활성화시켜 NO와 TNF-以의 생성이 증가되고 NK 세포의 활성화가 일어나 암세포를 사멸시킴으로써 항암작용을 나타낼 수 있음을 나타내었다.
- 02% °] 었다. 산성당의 GLC 분석 결과는 glucuronic acid 90.8%, galacturonic acid 9.2%이었다. RGAP 구성 당의 mol%를 종합하면 Table I과 같다.
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