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문제 정의
- 그러나 경구투 여시의 효과에 대해서는 거의 연구가 이루어지지 않은 형편이다. 따라서 본 연구는 홍삼산성다당체 RGAP의 항종양효과를 조사하기 위한 연구의 일환으로, B16-F10 흑색종양을 마우스에 이식한 후 RGAP의 경구투여가 마우스의 종양증식에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- B16-F10 melanoma 고형암에 대한 RGAP의 항암효과를 조사하기 위하여 먼저 C57BL/6 마우스 (20.0 ±0.2 g)를 군당 7마리로 나누었다. RGAP를 300, 500, 1,000 mgkg의 용량별로 10일간 경구' 투여한 후 Kim 등11)의 방법에 따라 HBSS buffere.
- Antitumor activity of RGAP in B16-F10 melanoma tumor-bearing mice. C57BL/6 mice were p.o. administered daily with RGAP 300, 500 and 1,000 ㎎/㎏/day for 3 weeks. B16-F10 melanoma tumor cell was single inoculated the back side of mice for 10 days after administration of RGAP.
- RGAP를 경구 및 복강 투여한 BALB/c 마우스로부터 Kim 등의 방법에 준해 복강 macrophage를 분리하여 1 pig/m/ actinomycin D로 3시간 배양한 WEHI 164 암세포 (lxl05 cells/ml/well)에 암세포 : macrophage의 비율이 1:1, 1:5, 1:10되게 섞었다. 이때 암세포는 미리 107세포당 100 uCi의 NazeCrQ를 첨가하여 1시간 배양하여 방사능으로 표지시켰고 일정비율로 첨가된 macrophage와 1 ㎍/ml actinomycin D의 존재하에서 총 200 ㎕의 용적으로 6시간 배양시켰다.
- RGAP를 마우스(BALB/c)에 1주일 동안 각각 100, 300 mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 비장의 무게를 측정하였다. 또한 비장의 세포수는 비장을 파쇄한 후 haemacytometer (Germany)를 이용하여 측정하였다.
- RGAP를 투여기간별로 각각 1주, 5주 및 용량별로 각각 300, 600 ㎎/㎏으로 다르게 경구투여한 후 복강 macrophage 를 분리하여 WEHI-164 암세포에 대한 살해율을 조사하였다 (Fig. 3). 경구투여와 동시에 동일한 투여기간 및 용량별로 RGAP를 복강투여한 후 암세포살해율을 조사한 결과, RGAP 600m앙/kg를 5주간 경구 투여한 실험군이 가장 높은 암세포사 멸율을 나타내었다.
- RGAP의 경구투여가 비장의 무게에 미치는 영향을 조사하기위해 RGAP를 1주간 100, 300 ㎎/㎏의 용량으로 경구투여한 후 비장의 무게 및 비장의 세포수를 측정하였다. 아울러 복강투여와 비교하기 위해 동일한 용량으로 RGAP를 복강투여한 후 비장의 무게 및 세포수를 측정한 결과, RGAP를 100, 300 ㎎/㎏의 용량으로 1주간 경구투여시에는 비장의 무게 및 세포수에서 유의적 변화가 관찰되지 않았다(Fig.
- 경구투여와 동시에 동일한 투여기간 및 용량별로 RGAP를 복강투여한 후 암세포살해율을 조사한 결과, RGAP 600m앙/kg를 5주간 경구 투여한 실험군이 가장 높은 암세포사 멸율을 나타내었다. Target 세포인 WEHI-164 암세포와 effector인 macrophage의 배합비율을 1:1로 처리한 후, RGAP 600 ㎎/㎏을 5주간 경구투여한 시험군이 40%의 cell lysis를 나타내어 가장 높은 암세포사멸율을 나타내었다. 암세포와 macrophage의 비율을 1:5로 처리한 후 경구투여한 경우에도 RGAP 600 ㎎/㎏, 5주 투여의 경우가 가장 높은 암세포사멸율을 나타내었다.
- 4-5 주령의 동물을 구입하여 무작위로 폴리카보네이트 cage에 5 마리씩 분리, 수용하여 최소한 1 주 이상 순화시켰으며, 사료 (삼육, 대한민국)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다. 동물실의 환경조 건은 실내온도 23 ± 3, 상대습도 40-60%를 유지하였고, 150- 300 Lux의 조도로 12 시간씩 명암을 조절하였다.
- RGAP를 마우스(BALB/c)에 1주일 동안 각각 100, 300 mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 비장의 무게를 측정하였다. 또한 비장의 세포수는 비장을 파쇄한 후 haemacytometer (Germany)를 이용하여 측정하였다.
- RGAP를 경구 및 복강 투여한 BALB/c 마우스로부터 Kim 등의 방법에 준해 복강 macrophage를 분리하여 1 pig/m/ actinomycin D로 3시간 배양한 WEHI 164 암세포 (lxl05 cells/ml/well)에 암세포 : macrophage의 비율이 1:1, 1:5, 1:10되게 섞었다. 이때 암세포는 미리 107세포당 100 uCi의 NazeCrQ를 첨가하여 1시간 배양하여 방사능으로 표지시켰고 일정비율로 첨가된 macrophage와 1 ㎍/ml actinomycin D의 존재하에서 총 200 ㎕의 용적으로 6시간 배양시켰다. 배양종료후 상등액 100 B를 취해 scintillation vial에 담고 gamma-counter로 유출 방사능을 측정하고 그 활성을 다음의 식을 이용하여 계산했다.
- 홍삼 (6년근, 양삼 30지, 한국인삼공사)으로부터 홍삼알콜추 출물을 제조하고 남은 홍삼을 60에서 2일 동안 열풍건조한 후 조분쇄한 후 Park⑸ 등의 방법에 준해 분리하였다. 즉, 열수 (95-100에서 3시간씩, 4회 반복)로 추출한 후 대량으로 분리하기 위해 한외 여과기 CJltrafiltration Kit, Milipore Co., MA, USA>를 이용하여 분자량 10 KD 이상과 이하의 분획으로 나누었다. 이 중 분자량 10 KD 이상의 고분자량 화합물에 95%의 에탄올을 5배 (v/v) 가해 4에서 24시간 방치 한 후 열풍건조하여 산성다당체를 분리하였다.
- 희석된 B16-F10 melanoma 암세포 (약 lxl06cells/㎖) 5-6 주령의 마우스 등에 피하이식 (100 W) 하였다. 피하이식 후 다시 12일 동안 RGAP를 경구투여하였다. 암세포를 이식한 후 22일째 마우스로부터 생성된 고형암을 적출하여 종양을 측정하였고, 종양증식억제율은 Kwak 등 12)의 방법에 준해 투여군의 평균종양중량/비투여군와 평균종양 중량 X 100으로 계산하였다.
- RGAP를 300, 500, 1,000 mgkg의 용량별로 10일간 경구' 투여한 후 Kim 등11)의 방법에 따라 HBSS buffere. 희석된 B16-F10 melanoma 암세포 (약 lxl06cells/㎖) 5-6 주령의 마우스 등에 피하이식 (100 W) 하였다. 피하이식 후 다시 12일 동안 RGAP를 경구투여하였다.
대상 데이터
- BL/6계 마우스는 대한바이오링크(음성, 충북, 대한민국)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 4-5 주령의 동물을 구입하여 무작위로 폴리카보네이트 cage에 5 마리씩 분리, 수용하여 최소한 1 주 이상 순화시켰으며, 사료 (삼육, 대한민국)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다. 동물실의 환경조 건은 실내온도 23 ± 3, 상대습도 40-60%를 유지하였고, 150- 300 Lux의 조도로 12 시간씩 명암을 조절하였다.
- B16-F10 melanoma cell linee ATCC (ATCC CRL-6475) 로부터 분양받았다. 10% heat-inactivated FBS, 1.
- BALB/c 및 C57BL/6계 마우스는 대한바이오링크(음성, 충북, 대한민국)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 4-5 주령의 동물을 구입하여 무작위로 폴리카보네이트 cage에 5 마리씩 분리, 수용하여 최소한 1 주 이상 순화시켰으며, 사료 (삼육, 대한민국)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다.
- Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma (St Louis, MO, USA)를 사용하였다. Earles balanced salt solution (EBSS), HEPES, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin/streptomycin solution, RPMI 1640 medium 등은 GIBCO (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입해 사용하였고 그 밖의 시약은 시판 특급시약을 사용하였다.
- Meyer, 양삼 30지, 한국인삼공사)으로부터 알콜추출물을 제조하고 남은 홍삼을 사용하였다. Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma (St Louis, MO, USA)를 사용하였다. Earles balanced salt solution (EBSS), HEPES, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin/streptomycin solution, RPMI 1640 medium 등은 GIBCO (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입해 사용하였고 그 밖의 시약은 시판 특급시약을 사용하였다.
- 실험에 사용된 시료는 6년근 홍삼(Rwtox ginseng C.A. Meyer, 양삼 30지, 한국인삼공사)으로부터 알콜추출물을 제조하고 남은 홍삼을 사용하였다. Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma (St Louis, MO, USA)를 사용하였다.
- 홍삼 (6년근, 양삼 30지, 한국인삼공사)으로부터 홍삼알콜추 출물을 제조하고 남은 홍삼을 60에서 2일 동안 열풍건조한 후 조분쇄한 후 Park⑸ 등의 방법에 준해 분리하였다. 즉, 열수 (95-100에서 3시간씩, 4회 반복)로 추출한 후 대량으로 분리하기 위해 한외 여과기 CJltrafiltration Kit, Milipore Co.
데이터처리
- 실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 결과의 유의성 검정은 student's t-test로 분석하였다.
이론/모형
- B16-F10 melanoma cell linee ATCC (ATCC CRL-6475) 로부터 분양받았다. 10% heat-inactivated FBS, 1.5 g/L의 4 mM glutamine, 100 μg/ml 의 sodium bicarbonate, lOOU/ml 의 streptomycin 및 penicillin, 4.5g/L의 glucose가 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's minimal essential Medium)에서 Kim 등의 방법에 따라 배양하였다. 배양은 CO2 배양기 (VISON사)를 이용하여 37에서 5% CO2 상태를 유지하였다.
- 2 g)를 군당 7마리로 나누었다. RGAP를 300, 500, 1,000 mgkg의 용량별로 10일간 경구' 투여한 후 Kim 등11)의 방법에 따라 HBSS buffere. 희석된 B16-F10 melanoma 암세포 (약 lxl06cells/㎖) 5-6 주령의 마우스 등에 피하이식 (100 W) 하였다.
- 피하이식 후 다시 12일 동안 RGAP를 경구투여하였다. 암세포를 이식한 후 22일째 마우스로부터 생성된 고형암을 적출하여 종양을 측정하였고, 종양증식억제율은 Kwak 등 12)의 방법에 준해 투여군의 평균종양중량/비투여군와 평균종양 중량 X 100으로 계산하였다.
성능/효과
- B16-F10 흑색종 암세포를 이식한 후 약 3주(22일)째 마우스를 도살하여 종양의 무게를 측정한 결과 RGAP 300, 500 ㎎/㎏/day 투여군은 종양의 무게가 4, 983.7 ±458 및 4, 590.3 ±367 mg 으로 대조군의 5, 214.9 ±347 mg과 비교해서 종양무게가 감소되었으나 유의적 감소는 관찰되지 않았다. 대조군에 대한 RGAP 투여군의 종양무게 억제율을 계산한 결과, 16) 종양증식억제율은 각각 4.
- 따라서 투여용량 및 기간별 RGAP의 경구투여 효과는 RGAP 600 ㎎/㎏을 5주간 투여하였을 때가 가장 높은 암세포사멸율을 나타내는 것으로 생각된다. RGAP의 경 구투여 와 복강투여시의 암세포사멸율을 비교해보면 , RGAP 600 ㎎/㎏을 5주간 경구투여한 시험군의 사멸율은 40%이 엇고, RGAP 300 ㎎/㎏을 1 주간 복강투여한 시험군의 사 멸율은 45%로 거의 비슷하게 나타나서, RGAP의 경구투여군은 복강투여군에 비해 투여기간은 1/5배 적고, 용량은 약 1/2 배 약한 것으로 생각된다. 따라서 암세포(WEHL164)에 대해 RGAP의 경구투여가 복강투여와 동일한 항종양효과를 나타내 기 위해서는 투여기간을 약 5배 길게, 용량은 약 2배 이상 증가시켜야 할 것으로 생각된다.
- RGAP의 경구투여가 마우스복강 macrophage의 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 RGAP를 100, 300 ㎎/㎏의 용량으로 1주간 투여한 후 복강 macrophage 세포수를 조사한 결과, 경구투여군은 대조군과 유사하게 100 및 300 mg/ kg 투여군에서 모두 50xl04 cells로 조사되어 큰 변화가 관 찰되지 않았다(Fig. 2). 반면 RGAP 복강투여군은 100, 300 ㎎/㎏의 용량에서 용량의존적으로 복강 macrophage의 수가 증가하는 경향을 나타내었다(pvO.
- 3). 경구투여와 동시에 동일한 투여기간 및 용량별로 RGAP를 복강투여한 후 암세포살해율을 조사한 결과, RGAP 600m앙/kg를 5주간 경구 투여한 실험군이 가장 높은 암세포사 멸율을 나타내었다. Target 세포인 WEHI-164 암세포와 effector인 macrophage의 배합비율을 1:1로 처리한 후, RGAP 600 ㎎/㎏을 5주간 경구투여한 시험군이 40%의 cell lysis를 나타내어 가장 높은 암세포사멸율을 나타내었다.
- 암세포와 macrophage의 비율을 1:5로 처리한 후 경구투여한 경우에도 RGAP 600 ㎎/㎏, 5주 투여의 경우가 가장 높은 암세포사멸율을 나타내었다. 그러나 암세포와 macrophage-^] 비율을 1:10으로 조정한 후 RGAP를 투여한 경우에는 300 ㎎/㎏보다는 600 ㎎/㎏이 더 높은 사멸율을 나타내었지만 600 ㎎/㎏을 1주 투여한 시험군이 5주 투여한 시험군보다 반대로 약간 높은 사멸율을 나타내었다. 그러나 이는 암세포 에대한 macrophage의 비율이 너무 높아서 macrophage가 과량발현된 것으로 생각되며, 이상의 결과로부터 암세포와 macrophage의 배합비율은 1:1로 처리하는 것이 최적인 것으로 생각되다.
- 그러나 암세포와 macrophage-^] 비율을 1:10으로 조정한 후 RGAP를 투여한 경우에는 300 ㎎/㎏보다는 600 ㎎/㎏이 더 높은 사멸율을 나타내었지만 600 ㎎/㎏을 1주 투여한 시험군이 5주 투여한 시험군보다 반대로 약간 높은 사멸율을 나타내었다. 그러나 이는 암세포 에대한 macrophage의 비율이 너무 높아서 macrophage가 과량발현된 것으로 생각되며, 이상의 결과로부터 암세포와 macrophage의 배합비율은 1:1로 처리하는 것이 최적인 것으로 생각되다. 따라서 투여용량 및 기간별 RGAP의 경구투여 효과는 RGAP 600 ㎎/㎏을 5주간 투여하였을 때가 가장 높은 암세포사멸율을 나타내는 것으로 생각된다.
- 9 ±347 mg과 비교해서 종양무게가 감소되었으나 유의적 감소는 관찰되지 않았다. 대조군에 대한 RGAP 투여군의 종양무게 억제율을 계산한 결과, 16) 종양증식억제율은 각각 4.4, 12.0%로 계산되었다. 아울러 RGAP 1,000 ㎎/㎏/day 투여군은 종양무게가 2, 848.
- 그러나 이는 암세포 에대한 macrophage의 비율이 너무 높아서 macrophage가 과량발현된 것으로 생각되며, 이상의 결과로부터 암세포와 macrophage의 배합비율은 1:1로 처리하는 것이 최적인 것으로 생각되다. 따라서 투여용량 및 기간별 RGAP의 경구투여 효과는 RGAP 600 ㎎/㎏을 5주간 투여하였을 때가 가장 높은 암세포사멸율을 나타내는 것으로 생각된다. RGAP의 경 구투여 와 복강투여시의 암세포사멸율을 비교해보면 , RGAP 600 ㎎/㎏을 5주간 경구투여한 시험군의 사멸율은 40%이 엇고, RGAP 300 ㎎/㎏을 1 주간 복강투여한 시험군의 사 멸율은 45%로 거의 비슷하게 나타나서, RGAP의 경구투여군은 복강투여군에 비해 투여기간은 1/5배 적고, 용량은 약 1/2 배 약한 것으로 생각된다.
- 본 실험에서 RGAP의 경구투여는 복강투여와 달리 100, 300 ㎎/㎏g의 용량으로 1주간 투여해서는 비장무게 및 세포수에 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 생각되며, 경구투여에 의한 뚜렷한 효과를 나타내기 위해서는 투여기간은 1 주일 이상, 그리고 투여용량은 300㎎/㎏g 이상으로 증가시켜야 햘 것으로 사료된다.
- 이와 유사한 실험으로 Kim 등11)은 B16-F10 흑색종양을 이식한 마우스에 RGAPS- 100-300 ㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 종양무게를 측정한 결과 종양의 무게가 30-40% 감 소되 었다고 보고한 바 있다. 본 실험에서는 500-1,000 ㎎/㎏ 의 용량으로 RGAP를 경구투여한 결과 대조군 대비 1245% 의 종양무게 감소가 관찰되었다. 이러한 실험결과로부터 동일한 B16 흑색종양에 대해 투여 방법만을 달리하여 실험하였을 경우 RGAP의 항종양효과는 경구투여시가 복강투여시보다 약 1/6-1/10배 약한 것으로 나타났다.
- 0%로 계산되었다. 아울러 RGAP 1,000 ㎎/㎏/day 투여군은 종양무게가 2, 848.4 ±548 mg으로 크게 감소되어 종양증식억제율은 45.4%로 나타났다(P<0.05). 따라서 RGAP는 경구투여시 500mgZkg 이상의 용량에서 B16-F10 흑색종양에 대한 항종양효과 있는 것으로 생각된다(Fig.
- RGAP의 경구투여가 비장의 무게에 미치는 영향을 조사하기위해 RGAP를 1주간 100, 300 ㎎/㎏의 용량으로 경구투여한 후 비장의 무게 및 비장의 세포수를 측정하였다. 아울러 복강투여와 비교하기 위해 동일한 용량으로 RGAP를 복강투여한 후 비장의 무게 및 세포수를 측정한 결과, RGAP를 100, 300 ㎎/㎏의 용량으로 1주간 경구투여시에는 비장의 무게 및 세포수에서 유의적 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 1). 그러나 RGAP를 동일한 용량으로 투여한 복강투여군에서는 비장의 무게 및 세포수가 증가되는 경향을 나타내었다.
- 본 실험에서는 500-1,000 ㎎/㎏ 의 용량으로 RGAP를 경구투여한 결과 대조군 대비 1245% 의 종양무게 감소가 관찰되었다. 이러한 실험결과로부터 동일한 B16 흑색종양에 대해 투여 방법만을 달리하여 실험하였을 경우 RGAP의 항종양효과는 경구투여시가 복강투여시보다 약 1/6-1/10배 약한 것으로 나타났다. 이는 RGAP의 경구투여는 복강투여에 비해 소화과정 중 위액 및 장액에의해 대부분 가수분해되어 그 활성이 감소되는 때문으로 생각된다.
후속연구
- RGAP의 항암 및 항종양효과4,11)는 복강투여시 sarcoma 180 암세포가 이식된 마우스에서 수명연장 효과를 나타내었으며, 자연살해세포 (Natural killer cell, NK cell)을 활성화시키고 대식세 포 (macrophage)에의한 NO 생성을 유도함으로써 항암효과를 나타낸다고 보고된 바 있다. 경구투여시의 효과는 복강투여시 발현되는 효과와 기본적으로 동일할 것으로 생각되나 자세한 기작은 추후 상세한 연구를 필요로 할 것으로 생각된다.
- RGAP의 경구투여시 macrophage의 변화는 앞서 측정한 비장의 무게 및 세포수와 동일한 결과를 나타내었다. 따라서 RGAP의 경구투여시 효과를 나타나기 위해서는 RGAP를 최소한 300 ㎎/㎏ 이상의 용량으로 1 주 이상 투여해야 할 것으로 사료된다.
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