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문제 정의
- Cyclophosphamide (CY)는 alkylating agent로서 DNA replication 및 RNA transcription을 억제하여 항암작용을 나타내며 급, 만성 백혈병, 여러가지 고형암에 널리 사용되는 항암제이지만 심각한 면역억제 (면역독성) 작용을 나타낸다.15) 본 실험은 면역조절에 의해 항암작용을 나타내는 RGAP를 항암제 CY와 병용투여함으로써 저용량의 항암제를 사용하여 항암효과를 극대화시키고 항암제의 면역억제와 같은 부작용 및 독성을 감소시킬 수 있음을 제시하고자 하였다. 먼저 RGAP (100 ㎎/㎏) 및 CY (3, 10 ㎎/㎏) 단독투여군과 RGAP (100 ㎎/㎏) 와 CY (3 ㎎/㎏) 병용투여군의 sarcoma 180 암세포 를 이식한 마우스에서 30 일간 생존율을 조사하였다(Fig.
- 이러한 결과는 RGAP를 항암제 CY 및 5-FU 등과 병용투여하면 항암제를 저용량으로 사용하고도 고용량과 유사한 효과를 나타냄을 의미한다. 또한 숙주의 면역성을 증가시키는 RGAP를 항암제와 병용투여시 항암제가 나타내는 면역억제와 같은 심각한 부작용을 경감시키고 항암효과를 증가시킬 수 있음을 제시한다. 버섯류로부터 분리된 lentinan, polysaccharide K 등은 암치료를 위한 보조제로서 이미 활용되고 있으며, 홍삼으로부터 분리된 다당분획은 CY 투여로 야기된 면역독성을 감소시킴이 보고된 바 있다.
- 본 연구에서는 RGAP가 항암제와 병용투여로 항암제의 치료 효과를 증가시키고 항암제의 면역억제에 대한 심각한 부작용을 경감시킬 수 있는 항암보조치료제로서의 사용 가능성을 알아보기 위해 RGAP와 기존의 항암제인 cyclophophamide 및 5- fluorouracil과 병용투여하여 항암시너지 효과를 관찰하였다.
제안 방법
- 5-Fu는 pyrimidine 유도체로서 핵산대사를 억제하여 항암작용을 나타내는데 주로 유방암, 대장암, 위암, 췌장암 등에 사용되지만 골수억제, '구강, 소화기 궤양, 간 및 신장 손상 등의 부작용을 일으키는 항암제이다.15) RGAP를 5-FU와 병용 투여하면서 sarcoma 180 암세포 이식 마우스에서 30일간 수명연장효과를 조사하였다. RGAP (100㎎/㎏) 및 5-FU (5, lO㎎/㎏)는 단독투여하였고 RGAP (100㎎/㎏)와 5-FU (5㎎/㎏)는 병용투여 하였다 (Fig.
- 15) RGAP를 5-FU와 병용 투여하면서 sarcoma 180 암세포 이식 마우스에서 30일간 수명연장효과를 조사하였다. RGAP (100㎎/㎏) 및 5-FU (5, lO㎎/㎏)는 단독투여하였고 RGAP (100㎎/㎏)와 5-FU (5㎎/㎏)는 병용투여 하였다 (Fig. 3). 암세포 이식 30일에서의 생존율은 대조군이 0% 이었지만 RGAP (lOOmgkg) 및 5-FU (2.
- 피하이식 24시간 후부터 RGAP 또는 항암제를 1일 1회 7일간 복강투여한 후 발생한 종양을 떼어내서 무게를 측정하였다. RGAP와 항암제의 병용투여 효과를 알아보기 위해서는 RGAP 투여 30분 후에 항암제를 투여하였다.
- Survival rate after the combined treatment of RGAP and cyclophosphamide (CY) in sarcoma 180 tumor-bearing mice. The ICR mice were administered intraperioneally with RGAP (100 ㎎/㎏), CY (3 ㎎/㎏), CY (10 ㎎/㎏) and RGAP (100 ㎎/㎏+CY 3 ㎎/㎏) for consecutive 7 days after the intraperioneal inoculation of sarcoma 180 cells (lxl06/ml). Survival rates were observed for 30 days.
- Survival rate after the combined treatment of RGAP and 5-Fluorouracil (5-Fu) in sarcoma 180 tumor-bearing mice. The ICR mice were administered intraperioneally with RGAP and/or 5-Fu for consecutive 7 days at 24 h after the intraperioneal inoculation of sarcoma 180 cells (1x106). The suvival rates were observed for 30 days.
- 4-5주령의 동물을 구입하여 무작위로 폴리카보네이트 cage에 5 마리씩 분리, 수용하여 최소한 1주 이상 순화시켰으며, 사료(삼육, 대한민국)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다. 동물실의 환경조건은 실내온도 23±3℃, 상대습도 40-60%를 유지하였고, 150-300 Lux의 조도로 12 시간씩 명암을 조절하였다.
- 본 실험에서도 고형암인 LL/2 lung carcinoma에 대해서는 저용량인 CY 3n@kg에서는 효과가 관찰되지 않았다. 따라서 용량을 증량하여 CY (10, 20 ㎎/㎏)의 단독투여 와 RGAP (100 mg/kg)와 CY (10 mg/kg) 또는 CY (20 ㎎/㎏)를 병용하여 생성된 종양의 무게를 관찰하였다(Fig. 2). 대조군의 종양 무게는 469±134mg인데 반해 단독투여군 RGAP (100 mglig), CY (10 ㎎/㎏), CY (20 ㎎/㎏)의 경우는 각각 339±163, 324±71, 167± 183 mge] 였으며, RGAP와 CY (10 또는 20mgkg) 병용투여군에서는 287±132과 128± 81 mg으로 CY 단독투여군에 비하여 각각 11%, 23%의 종양 무게를 감소시키는 것으로 나타내었다(Fig.
- 15) 본 실험은 면역조절에 의해 항암작용을 나타내는 RGAP를 항암제 CY와 병용투여함으로써 저용량의 항암제를 사용하여 항암효과를 극대화시키고 항암제의 면역억제와 같은 부작용 및 독성을 감소시킬 수 있음을 제시하고자 하였다. 먼저 RGAP (100 ㎎/㎏) 및 CY (3, 10 ㎎/㎏) 단독투여군과 RGAP (100 ㎎/㎏) 와 CY (3 ㎎/㎏) 병용투여군의 sarcoma 180 암세포 를 이식한 마우스에서 30 일간 생존율을 조사하였다(Fig. 1). Sarcoma 180 암세포만을 투여한 대조군 흰쥐는 암세포 투여 15일 이후부터 급격히 생존율이 감소하기 시작하여 19일째에 는 0%의 생존율을 나타내었다.
- 즉, 다량의 세포를 얻기 위해서 sarcoma 180 복수암 세포를 ICR 마우스의 복강에 접종한 후 계대배양하여 유지하였다. 수명연장효과는 암세포를 lxl06cells/ml 농도로 1회 200μ1를 마우스의 복강에 이식하고 24시간 후부터 RGAP를 1일 1회 7일간 복강투여한 후 생존율을 관찰하였다. 생존율은 암세포 이식 흰쥐의 개체 수/최초 흰쥐의 개체수X100으로 계산하였다.
- , MA, USAX 이용하여 분자량 10 KD 이상과 이하로 나누었다. 이 중 분자량 10 K① 이상의 고분자량 화합물에 95%의 에탄올 을 5배 (v/v) 가해 4℃에서 24시간 방치한 후 열풍건조하여 RGAP를 제조하였다. 산성당 및 중성당의 구성당의 분석은 전보12)와 같았다.
- 홍삼알콜추출후 남은 잔사를 60℃에서 2일 동안 열풍건조 한 후 조분쇄하였다. 전보12)와 같이 홍삼알콜추출잔시를 열수 (95-100℃에서 3시간 씩, 4회 반복)로 추출한 후 대량분리를 위해 한외여과기 OJltrafiltration Kit, Milipore Co., MA, USAX 이용하여 분자량 10 KD 이상과 이하로 나누었다. 이 중 분자량 10 K① 이상의 고분자량 화합물에 95%의 에탄올 을 5배 (v/v) 가해 4℃에서 24시간 방치한 후 열풍건조하여 RGAP를 제조하였다.
- 암세포 이식쥐에 대한 수명연장효과는 sarcoma 180 세포를 이용한 복수암모델을 이용하여 측정하였다. 즉, 다량의 세포를 얻기 위해서 sarcoma 180 복수암 세포를 ICR 마우스의 복강에 접종한 후 계대배양하여 유지하였다. 수명연장효과는 암세포를 lxl06cells/ml 농도로 1회 200μ1를 마우스의 복강에 이식하고 24시간 후부터 RGAP를 1일 1회 7일간 복강투여한 후 생존율을 관찰하였다.
- 2 g)의 등에 200 μ1를 피하 이식하였다. 피하이식 24시간 후부터 RGAP 또는 항암제를 1일 1회 7일간 복강투여한 후 발생한 종양을 떼어내서 무게를 측정하였다. RGAP와 항암제의 병용투여 효과를 알아보기 위해서는 RGAP 투여 30분 후에 항암제를 투여하였다.
- 한편 LL/2 lung carcinoma에 대한 RGAP와 5-FU 병용 투여에 의한 항종양 시너지 효과를 조사하였다. 대조군, RGAP (100 ㎎/㎏), 5-FU (5, 10 ㎎/㎏) 단독투여군의 종 양무게는 894±439, 875±447, 666±329, 451±219mg 이었으며, RGAP (100 ㎎/㎏)와 5-FU (5 mg/kg) 또는 5-FU (10 ㎎/㎏) 병용투여군의 종양무게는 각각 528±38, 234±198 mg으로 5-FU (5, 10㎎/㎏) 단독투여군의 종양무게에 비해 각각 21%, 49% 감소되었다(Fig.
대상 데이터
- BI/6계 및 ICR계 마우스 수컷을 대한 바이오링크 (음성, 충북, 대한민국)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 4-5주령의 동물을 구입하여 무작위로 폴리카보네이트 cage에 5 마리씩 분리, 수용하여 최소한 1주 이상 순화시켰으며, 사료(삼육, 대한민국)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다. 동물실의 환경조건은 실내온도 23±3℃, 상대습도 40-60%를 유지하였고, 150-300 Lux의 조도로 12 시간씩 명암을 조절하였다.
- C57BI/6계 및 ICR계 마우스 수컷을 대한 바이오링크 (음성, 충북, 대한민국)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 4-5주령의 동물을 구입하여 무작위로 폴리카보네이트 cage에 5 마리씩 분리, 수용하여 최소한 1주 이상 순화시켰으며, 사료(삼육, 대한민국)와 수돗물을 자유로이 섭취시켰다.
- Meyer, 양삼 30지, 한국인삼공사)으로부터 알콜추출물을 제조하고 남은 홍삼잔사를 사용하였다. HEPES, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin/streptomycin solution, HBSS, DMEM, RPMI 1640 medium 등은 GIBCO (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입해 사용하였다. 항암제 CY (cyclophophamide) 및 5-FU (5-fluorouracil) 은 Sigma (St.
- LL/2 lung carcinoma cell line (ATCC CRL-1642)은 ATCC로부터 분양받았다. LL/2 lung carcinoma는 10% heat-inactivated FBS, 1.
- 생존율은 암세포 이식 흰쥐의 개체 수/최초 흰쥐의 개체수X100으로 계산하였다. 또한 항종양효과는 HBSS (Hank's balanced salt solution without sodium bicarbonate and phenol red)에 현탁한 LL/2 lung carcinoma 암세포 (lxltKcells/ml)를 5-6주령의 C57BI/6 마우스 (20.0 ±0.2 g)의 등에 200 μ1를 피하 이식하였다. 피하이식 24시간 후부터 RGAP 또는 항암제를 1일 1회 7일간 복강투여한 후 발생한 종양을 떼어내서 무게를 측정하였다.
- 5g/L의 glucose가 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's minimal essential Medium) 에서 배양하였다. 배양은 CO2 배양기 VSON사, 대한민국)를 이용하여 37℃에서 5% CO2 상태로 배양하였다.
- 실험에 사용된 시료는 6년근 홍삼 (Panax ginseng C.A. Meyer, 양삼 30지, 한국인삼공사)으로부터 알콜추출물을 제조하고 남은 홍삼잔사를 사용하였다. HEPES, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin/streptomycin solution, HBSS, DMEM, RPMI 1640 medium 등은 GIBCO (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입해 사용하였다.
- HEPES, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin/streptomycin solution, HBSS, DMEM, RPMI 1640 medium 등은 GIBCO (Grand Island, NY, USA) 제품을 구입해 사용하였다. 항암제 CY (cyclophophamide) 및 5-FU (5-fluorouracil) 은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고 그 밖의 시약은 시 판 특급시약을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 결과의 유의성 검정은 student's t-test로 분석하였다.
이론/모형
- 암세포 이식쥐에 대한 수명연장효과는 sarcoma 180 세포를 이용한 복수암모델을 이용하여 측정하였다. 즉, 다량의 세포를 얻기 위해서 sarcoma 180 복수암 세포를 ICR 마우스의 복강에 접종한 후 계대배양하여 유지하였다.
성능/효과
- 12) 홍삼으로부터 분리한 RGAP는 선천적 면역계에서 가장 주요한 역할을 담당하는 macrophage 와 NK 세포를 활성화시켜 항암작용을 나타내었다.(2) 그러므로 RGAP를 항암제와 병용투여시 저용량의 항암제를 사용하여 항암효과를 증대시키고 항암제의 면역억제와 같은 부작용을 감소시켜 암치료 보조제로서의 사용가능성을 보이고 있다.
- 버섯류로부터 분리된 lentinan, polysaccharide K 등은 암치료를 위한 보조제로서 이미 활용되고 있으며, 홍삼으로부터 분리된 다당분획은 CY 투여로 야기된 면역독성을 감소시킴이 보고된 바 있다.12) 홍삼으로부터 분리한 RGAP는 선천적 면역계에서 가장 주요한 역할을 담당하는 macrophage 와 NK 세포를 활성화시켜 항암작용을 나타내었다.(2) 그러므로 RGAP를 항암제와 병용투여시 저용량의 항암제를 사용하여 항암효과를 증대시키고 항암제의 면역억제와 같은 부작용을 감소시켜 암치료 보조제로서의 사용가능성을 보이고 있다.
- 저자들은 홍삼으로부터 홍삼알콜추출물을 제조하고 남은 잔사로부터 홍삼산성다당체 (RGAB red ginseng acidic polysaccharide)를 분리하한 바 있다.4.12) 백삼으로부터 분리한 ginsan과 RGAP의 화학적 조성을 비교시 ginsane 산성당이 43.1% 인데 반해 홍삼으로부터 분리한 RGAP는 산성당을 56.9%를 함유하고 있었고, ginsan의 중성당 조성은 glucose, galactose 였으나,3,6) RGAP는 glucose, arabinose, rhamnose, galactose를 함유하여12) 홍삼다당체는 백삼다당체인 ginsan과는 화학적 조성이 다른 새로운 산성다당체임을 제시한 바 있다. 또한 RGAP를 마우스에 투여시 macroph- age를 증가시키고 nitric oxide synthase를 유도시켜 면역조절작용을 나타내며, natural killer 세포 및 macrophage를 활성화시켜 면역조절에 대한 항암작용을 나타냄을 보고한 바 있다.
- Sarcoma 180 암세포만을 투여한 대조군 흰쥐는 암세포 투여 15일 이후부터 급격히 생존율이 감소하기 시작하여 19일째에 는 0%의 생존율을 나타내었다. RGAP 단독투여군은 완만한 생존율 감소을 나타내었고, 암세포 투여 17 일 이후부터 30일 까지의 생존율이 40%로 14일간 지속되었다. CY (3 mg/kg)은 암세포 투여 15 일 이후부터 생존율 감소를 나타내어 20일 이후에는 14%의 생존율을 나타내었다.
- 한편 LL/2 lung carcinoma에 대한 RGAP와 5-FU 병용 투여에 의한 항종양 시너지 효과를 조사하였다. 대조군, RGAP (100 ㎎/㎏), 5-FU (5, 10 ㎎/㎏) 단독투여군의 종 양무게는 894±439, 875±447, 666±329, 451±219mg 이었으며, RGAP (100 ㎎/㎏)와 5-FU (5 mg/kg) 또는 5-FU (10 ㎎/㎏) 병용투여군의 종양무게는 각각 528±38, 234±198 mg으로 5-FU (5, 10㎎/㎏) 단독투여군의 종양무게에 비해 각각 21%, 49% 감소되었다(Fig. 4).
- 2). 대조군의 종양 무게는 469±134mg인데 반해 단독투여군 RGAP (100 mglig), CY (10 ㎎/㎏), CY (20 ㎎/㎏)의 경우는 각각 339±163, 324±71, 167± 183 mge] 였으며, RGAP와 CY (10 또는 20mgkg) 병용투여군에서는 287±132과 128± 81 mg으로 CY 단독투여군에 비하여 각각 11%, 23%의 종양 무게를 감소시키는 것으로 나타내었다(Fig. 2).
- 일반적으로 복수암보다 고형암에 대한 항암제 투여시 고용량을 투여해야 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 본 실험에서도 고형암인 LL/2 lung carcinoma에 대해서는 저용량인 CY 3n@kg에서는 효과가 관찰되지 않았다. 따라서 용량을 증량하여 CY (10, 20 ㎎/㎏)의 단독투여 와 RGAP (100 mg/kg)와 CY (10 mg/kg) 또는 CY (20 ㎎/㎏)를 병용하여 생성된 종양의 무게를 관찰하였다(Fig.
- 3). 암세포 이식 30일에서의 생존율은 대조군이 0% 이었지만 RGAP (lOOmgkg) 및 5-FU (2.5, 5㎎/㎏) 단독투여군은 각각 25.0, 37.5, 87.5% 이었으며, RGAP와 5-FU (2.5㎎/㎏) 병용투여군은 62.5%로 5-Fu 단독투여군의 37.5% 생존율보다 1.7 배 높았으나 5-FU (5.0㎎/㎏) 단독투여군보다는 낮았다(Fig. 3).
- 1). 이러한 결과는 RGAP와 저용량의 CY를 병용투여시 고용량의 CY 투여보다 그 이상의 효과를 나타내는 시너지 효과가 있음을 나타내었다.
- 이상과 같이 RGAP와 항암제 CY 및 5-FU의 병용투여는 sarcoma 180 암세포 이식 마우스와 LL/2 lung carcinoma 이식 마우스에서 항암제 단독투여 또는 고용량의 항암제 투여에서보다 항암 작용이 크거나 같은 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 RGAP를 항암제 CY 및 5-FU 등과 병용투여하면 항암제를 저용량으로 사용하고도 고용량과 유사한 효과를 나타냄을 의미한다.
- 반면 RGAP와 CY (3 mgetg) 병용투여군은 암세포투여 22일때까지 100%의 생존율을 나타내었고 투여 30일 후에도 71%의 높은 생존율을 나타내었다. 이상의 결과로부터 암세포 투여 30일 후 계산된 RGAP 및 CY (3, lOmgekg) 단독투여군의 수명연장 효과는 각각 43, 14, 43%로 나타났으나, RGAP와 CY 병용 투여군에서는 71%로 나타나서 CY 단독 투여군보다 높은 수명연장 효과를 나타내었다(Fig. 1). 이러한 결과는 RGAP와 저용량의 CY를 병용투여시 고용량의 CY 투여보다 그 이상의 효과를 나타내는 시너지 효과가 있음을 나타내었다.
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