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문제 정의
- 간장 보호 효과의 기전들에서 다년생 길경 (CK)의 항산화 효과를 알아보기 위해 free radical 및 superoxide 소거능에 대해 조사하였다. 그 결과 Table I에 나타낸 것처럼 다년생 길경 투여농도 의존적으로 free radical 및 superoxide 소거작용을 나타냈다.
- 본 연구에서는 다년생 길경의 free radical 소거 작용에 의한산화적 간세포독성 보호효과를 조사하였다. Table I에서 보는 바와 같이 hydoxoy radical (OH .
제안 방법
- Glutathion (GSH) 함량 측정 - 다년생 길경을 1시간 전 처리한 후 t-BHP을 0.25 mM 농도로 1시간 동안 처리하였다. O- phthaldialdehyde를 3.
- 배지내의 LDH 활성을 측정하였다. LDH 활성은 기질 pyruvate가 lactate로 감소되는 정도를 조사하여 측정하였다. 이 감소는 reduced NADH가 산화되고, 340nm에서 최대 흡광도를 나타낸다.
- Superoxide 소거 작용 - Xanthine (IOOjjlM)과 xanthine oxidase (0.02 U)를 처리해 생성된 superoxide에 대한 다년생 길경의 소거 능을 알아보기 위하여 0.1 M potassium-phosphate buffer (pH 7.4)에 다양한 농도의 다년생 길경을 처리하였다. 처리 후 nitroblue tetrazolium (100 皿)을 기질로 사용하여 다년생 길경의 superoxide 활성도를 측정하였다.
- 加) 이에 븐 연구에서는 다년생 길경의 t-BHP에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 간 세포 보호효과를 확인하기 위해 간 손상 시 샏성되는 효소인 ALT, LDH, 지질과산화 정도를 나타내는 MDA. free radical 생성의 억제 및 생성된 free radical 제거흐卜 는데 필요한 GSH의 양 등을 측정하였으며, 그 작용기전을 규명하고 가 다년생 길경의 항산화 효과를 조사하였다.
- t-BHP에 의해 산화적 스트레스가 유도된 일차배양 간세포내 ROS에 의해 DCFDA가 발색하여 형광을 띄는 원리를 이용하여간 세포내 다년생 길경의 ROS 소거능을 측정하였다. 다년생 길경을 처리 한 경우 처리한 농도에 비례하여 간세포 나에 존재하는 ROS의 양기 유의성 있게 감소하였다 (Fig.
- 간 세포 내 ROS 측정 - 간 세포 내 ROS의 양은 형광 probe 인 DCF-DA을 사용하여 측정하였다. 배양액에 DCF-DA (2, 7- dichlorofluorescein diacetate)를 well당 25 로 처리하여 15분간 배양한 후 다년생 길경과 세포 내 ROS를 유발시키는 t-BHP (0.
- 배내 Lactate dehydrogenase (LDH) - 실험에 이용한 다년생 길경의 간세포 손상에 대한 영향을 조사하기 위하여 배지내의 LDH 활성을 측정하였다. LDH 활성은 기질 pyruvate가 lactate로 감소되는 정도를 조사하여 측정하였다.
- DCF-DA을 사용하여 측정하였다. 배양액에 DCF-DA (2, 7- dichlorofluorescein diacetate)를 well당 25 로 처리하여 15분간 배양한 후 다년생 길경과 세포 내 ROS를 유발시키는 t-BHP (0.25 mM)를 처리하였다. 반응 후 형성된 세포내 과산화물은 excitation 파장 485 nm, emission 파장 530 nm에서 fluorescence 를 측정하였다.
- 1시간 배양하였다. 배양액을 교환한 후 MTT labeling reagent에 electron coupling reagent를 첨가하여 준비한 MTT labeling mixture를 각 well당 10 卩/씩 (최종농도 0.5 mg/mZ) 4시간 처리한 후 550 nm 파장에서 흡광도를 이용하여 다년생 길경자체의 세포독성을 조사하였다.
- 이러한 DPPH의 작용은 hydroxyl radical과 유사하여 free radiacal 소거 실험에 활용된다. 본 실험은 60 皿의 DPPH 2 m/에 다년생 길경을 농도별로 처리한 다음 1분간 잘 섞고, 10분 후에 520nm에서 측정하였다.
- 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸의 증가는 GSH 양의 감소를 통해 나타나기 때문에 이를 측정하기 위해 세포 내 GSH 양을 측정하였다. 그 결과 다년생 길경을 처리 한 경우 t-BHP만을 처리한 경우에 비하여 다년생 길경을 처리한 농도에 비례하여 간세포 내에 존재하는 GSH의 양이 회복되었다 (Fig.
- 지질과산화 (lipid peroxidation)의 지표로써 MDA의 양을 측정하였다. 수합한 세포를 0.5 m2 취해 0.37% (w/v) TBA (2-thiobarbituric acid), 15% (w/v) TCA (trichloroacetic acid)이 포함된 0.25 M HC1 용액을 첨가하여 80°C로 15분간 가열하고, 동량의 부탄올을 첨가한 후 4000 g로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 취해 530 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 배잉액을 버리고, ice-cold PBS로 두차례 세척한 후 rubber policeman^로 긁어모아서 homogenizer로 균질화하였다. 지질과산화 (lipid peroxidation)의 지표로써 MDA의 양을 측정하였다. 수합한 세포를 0.
- 4)에 다양한 농도의 다년생 길경을 처리하였다. 처리 후 nitroblue tetrazolium (100 皿)을 기질로 사용하여 다년생 길경의 superoxide 활성도를 측정하였다.
대상 데이터
- 실험동물 - 생후 6-8주 된 약 150g£] SPF (Specific ftthogenic Free': Sprague-Dawley계 흰쥐 수컷을 다물사이언스 (대전)에서구입히여 실험동물로 사용하였다. 사료와 물은 자유롭게 먹게 하며, 사육실의 온도는 21-24°C, 상대 습도는 40-60%로 유지하였다.
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실험방법
실험재료 - 본 실험에서 사용한 다년생 길경 (Changkil; CK) 은 겨남 진주시 소재 (주)장생도라지로부터 수확 후 7일 이내의 것을 二입하였다. 건조된 장생 도라지 생채 100 g을 증류수 1 liter 에 느:1 3시간 동안 환류추출 한 후 마포를 사용하여 여과하였다.
데이터처리
- 통계처리 - 모든 실험 결과들은 mean土 SE로 나타냈고, 통계처리는 Student's t-test를 실시하여 p<0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- Perfusion 완충용액으로는 Hank's balanced solution (HBSS)을 사용하였다. 100 mg의 collagenase를 perfusion 완충용액에 녹여서 간세포로 환류 시킴으로써 간을 완전히 녹였다.
- 간세포의 분리 및 배양-간세포는 Dickins와 Peterson의 방법2刀 에 따라 collagenase perfusion 방법으로 분리하였다. Perfusion 완충용액으로는 Hank's balanced solution (HBSS)을 사용하였다.
성능/효과
- 다른 대사과정은 GSH peroxidase가 t-BHP와 결합하여 tert-butyl alcohol과 산화된 glutathion으로 전환됨으로서 해독되는 과정이다.2勿 이러한 대사과정을 통하여 간세포 내에서 t-BHP는 free radical을 생성하게 되고, 이렇게 생성된 free radical은 세포막을 구성하는 블포화 지방산과 직접적 및 간접적으로 반응하여 과산화 과정을 통해 분해됨으로서 결과적으로 MDA를 형성한다.2526)이러한 일련의 과정을 거쳐 t-BHP는 간세포의 세포자연사나 세포괴사를 일으킨다.
- 2에서 보여주는 바와 같이 t-BHP에 의해 산화적 스트레스가 유도된 일차배양 간세포에 비해 다년생 길경을 처리한 간세포>|서 다년생 길경을 10, 50, 100网/成로 처리하였을 때 각각 47. 58, 89%로 유의성 있게 지질과산화가 억제되었다 (P< 0.05).
- t-BHP에 의해 산화적 스트레스가 유도된 일차배양 간세포에 비해 다년생 길경을 전처리 한 간세포에서 다년생 길경을 처리한 농도에 비례하여 배양액으로 유리되는 ALT 효소 및 LDH 효소의 양이 감소하였다 (Fig. 1). 그러나, 다년생 길경만을 처리한 다음 6시간 후 MTT 방법을 통하여 세포독성을 조사한 결과 100ng/mZ의 농도에서도 아무런 독성을 보이지 않았으며, t-BHF는 0.
- 이에 이 농도를 다음 실험에 사용하였다. 간세포의 생존율과 간세포 손상에 대한 다년생 길경의 효과를 측정하기 위하여 LDH와 ALT를 실시한 결과 t-BHP게 의한 간 세포의 소상이 다년생 길경 농도에 의존적으로 감소함을 관찰하였다 Fig. 1).
- 측정하였다. 그 결과 다년생 길경을 처리 한 경우 t-BHP만을 처리한 경우에 비하여 다년생 길경을 처리한 농도에 비례하여 간세포 내에 존재하는 GSH의 양이 회복되었다 (Fig. 4).
- 1). 그러나, 다년생 길경만을 처리한 다음 6시간 후 MTT 방법을 통하여 세포독성을 조사한 결과 100ng/mZ의 농도에서도 아무런 독성을 보이지 않았으며, t-BHF는 0.25 mM에서 대조군에 비하여 53%의 생존율을 저하시켰다 Table II). 이에 이 농도를 다음 실험에 사용하였다.
- 이러한 결과는 다년생 길경이 일차배양한 간세포 내 발생흐)는 radical을 직접 잡는 결과라 추정할 수 있다. 또한 세포 내 존재하는 ROS의 양을 측정한 결과 (Fig. 3)에서도 위 결과와 유사하게 다년생 길경을처리한 경우 t-BHP만을 처리한 것과 비교시 다년생 길경 처리농도 의존적으로 감소함을 관찰하였다.
- 1, 2). 또한 세포 내 존재하는 glutathione (GSH)의 양도 다년생 길경 처리농도에 비례하여 회복되었다 (Fig. 4). 이러한 세포내 GSH의 양의 회복은 다년생 길경 자체가 GSH의 활성도에 관여하는 glutathione-S- transferase의 생성에 관여하지 않는다는 본 연구자들의 선행 결과 9)에 비추어 볼 때 다년생 길경 자체가 free radical^ 생성을 직접적 혹은 간접적으로 작용하여 억제시킴으로서 간세포 내 존재하는 GSH의 양이 회복 된 것으로 추정된다.
- 본 실험결과에서 다년생 길경 (0-100 |ig/mZ)는 일차배양된 간세포에서 t-BHP에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 세포막 손상시 배양액내로 유출되는 ALT LDH 양, 세포 지질 과산화 정도를 측정하는 MDA 양이 다년생 길경 처리농도에 비례하여 감소함을 관찰하였다 (Fig. 1, 2). 또한 세포 내 존재하는 glutathione (GSH)의 양도 다년생 길경 처리농도에 비례하여 회복되었다 (Fig.
- 이러한 결과들을 종합해 볼 때 일차배양된 간세포에서 t-BHP 의 대사과정에 의해서 발생되는 free radical을 다년생 길경이 직접 및 간접적으로 반응하여 세포내 존재하는 free radiacal의 양을 현저히 줄임으로서 , 그에 따라 세포 내에서 지질과산화 현상을 방어하여, 세포막 손상시 배양액으로 유출되는 ALT LDH의양을 감소시켰으며, 간세포 내에서 t-BHP에 의해 발생되는 독성물질들을 제거하는 GSH의 양도 회복되었을 것으로 사료된다. 이는 다년생 길경을 지속적으로 섭취시 정상상태의 대사과정에서 발생되는 free radical 뿐만 아니라 음식물, 세균 감염 및 담배 등과 같은 외부 해로운 물질에 의해 발생되는 free radical을제거함으로서 인체에서 해독작용을 담당하는 조직인 간의 보호 효과에 큰 효과를 보여 줄 것이라 시사할 수 있다.
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