본 연구는 한국 재래 산양 112두와 유산양인 Saanen종 7두의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하고, PCR-RFLP 방법에 의해 $\beta$-casein 유전자의 특성을 분석하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 자료로 제공하고자 실시하였다. 한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 $\beta$-casein의 유전자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다. $\beta$-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, $\beta$-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다. 유전자형 빈도에 있어서는 한국재래산양에서 $\beta$-casein AB 및 BB의 빈도는 각각 6.25 및 93.75%이었고, 유산양인 Saanen 종은 각각 57.14 및 42.86%이었다. 유전자빈도에 있어서는 한국재래산양의 $\beta$-casein A 및 B의 빈도가 각각 0.031 및 0.969이었고, Saanen 종에서는 각각 0.286 및 0.714의 빈도를 보였다. 한국재래산양의 $\beta$-casein 유전자의 염기서열과 이미 보고되어 있는 goat의 염기서열(GeneBank accession Number M90556)간에는 총 11개의 염기서열에 차이를 나타내어 97.71%의 상동성을 보였다. 따라서 한국재래산양의 $\beta$-casein 유전자의 다형성과 염기서열 분석에 의한 분자유전학적 특성의 규명은 한국재래산양의 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 및 응용 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구는 한국 재래 산양 112두와 유산양인 Saanen종 7두의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하고, PCR-RFLP 방법에 의해 $\beta$-casein 유전자의 특성을 분석하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 자료로 제공하고자 실시하였다. 한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 $\beta$-casein의 유전자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다. $\beta$-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, $\beta$-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다. 유전자형 빈도에 있어서는 한국재래산양에서 $\beta$-casein AB 및 BB의 빈도는 각각 6.25 및 93.75%이었고, 유산양인 Saanen 종은 각각 57.14 및 42.86%이었다. 유전자빈도에 있어서는 한국재래산양의 $\beta$-casein A 및 B의 빈도가 각각 0.031 및 0.969이었고, Saanen 종에서는 각각 0.286 및 0.714의 빈도를 보였다. 한국재래산양의 $\beta$-casein 유전자의 염기서열과 이미 보고되어 있는 goat의 염기서열(GeneBank accession Number M90556)간에는 총 11개의 염기서열에 차이를 나타내어 97.71%의 상동성을 보였다. 따라서 한국재래산양의 $\beta$-casein 유전자의 다형성과 염기서열 분석에 의한 분자유전학적 특성의 규명은 한국재래산양의 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 및 응용 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
This study was performed to provide the basic data for preservation and improvement of genetic resources according to finding genetic construction obtained from analysis of genetic characteristics of $\beta$-casein gene in Korean Native goat and Saanen using the PCR-RFLP. This study confi...
This study was performed to provide the basic data for preservation and improvement of genetic resources according to finding genetic construction obtained from analysis of genetic characteristics of $\beta$-casein gene in Korean Native goat and Saanen using the PCR-RFLP. This study confirmed the amplified products of 481bp fragments obtained from the amplification of $\beta$-casein loci by PCR. The $\beta$-casein AB genotype showed 481, 284 and 197bp, and $\beta$-casein BB genotype showed 284 and 197bp fragments in Korean Native goat and Saanen. The frequencies of $\beta$-casein genotype in Korean Native goat were 6.25 and 93.75% for AA and AB and the frequencies of $\beta$-casein genotype in Saanen were 57.14 and 42.86% for AA and AB types. The frequencies of $\beta$-casein A and B alleles were 0.031 and 0.969 in Korean Native goat and the frequencies of $\beta$-casein A and B alleles are 0.286 and 0.714 in Saanen, respectively. The nucleotide sequence of $\beta$-casein gene of Korean Native goat was 97.71% higher homology with 11 nucleotide sequences difference of that of goat reported in GeneBank (M90556). Therefore, this study of molecular genetic characteristics by the analysis of genetic polymorphism and sequencing for $\beta$-casein gene should be used as basic and applying data for preservation and improvement of genetic resources in Korean Native goat breeding.
This study was performed to provide the basic data for preservation and improvement of genetic resources according to finding genetic construction obtained from analysis of genetic characteristics of $\beta$-casein gene in Korean Native goat and Saanen using the PCR-RFLP. This study confirmed the amplified products of 481bp fragments obtained from the amplification of $\beta$-casein loci by PCR. The $\beta$-casein AB genotype showed 481, 284 and 197bp, and $\beta$-casein BB genotype showed 284 and 197bp fragments in Korean Native goat and Saanen. The frequencies of $\beta$-casein genotype in Korean Native goat were 6.25 and 93.75% for AA and AB and the frequencies of $\beta$-casein genotype in Saanen were 57.14 and 42.86% for AA and AB types. The frequencies of $\beta$-casein A and B alleles were 0.031 and 0.969 in Korean Native goat and the frequencies of $\beta$-casein A and B alleles are 0.286 and 0.714 in Saanen, respectively. The nucleotide sequence of $\beta$-casein gene of Korean Native goat was 97.71% higher homology with 11 nucleotide sequences difference of that of goat reported in GeneBank (M90556). Therefore, this study of molecular genetic characteristics by the analysis of genetic polymorphism and sequencing for $\beta$-casein gene should be used as basic and applying data for preservation and improvement of genetic resources in Korean Native goat breeding.
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문제 정의
따라서 본 연구는 우리 나라에서 오래 전부터 사육되어 오던 민족 고유의 재래가축인 한국재래 산양의 유전적 능력개량에 분자유전학적 기법의 접목을 위해 주요 유단백질인 β-casein 유전자의 유전자형 및 유전자빈도를 추정하여 집단의 유전적 구조를 분석하고, 이 유전자의 염기서열 분석에 의한 분자유전학적 특성을 구명하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초자료를 얻고자 수행하였다.
본 연구는 한국 재래 산양 112두와 유산양인 Saanen종 7두의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하고, PCR-RFLP 방법에 의해 β-casein 유전자의 특성을 분석하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 자료로 제공하고자 실시하였다. 한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 β-casein의 유전 자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다.
제안 방법
β-casein 유전자좌의 증폭은 GeneAmp PCR System 2400(Perkin Elmer Co., USA)을 이용하여 증폭하였으며, 반응 혼합액의 양은 genomic DNA를 포함하여 sample당 25㎕로 적정하였다. 반응 혼합액의 조성은 10mM Tris-Cl(pH 8.
, USA)을 이용하여 증폭하였으며, 반응 혼합액의 양은 genomic DNA를 포함하여 sample당 25㎕로 적정하였다. 반응 혼합액의 조성은 10mM Tris-Cl(pH 8.3), 50mM KCl, 15mM MgCl2, 0.001% gelatin으로 구성된 10×PCR buffer와 dNTP mixture(TaKaRa Co., Japan), 10pmol primer, 50ng/㎕ genomic DNA, 5unit Taq DNA polymerase(TaKaRa Co., Japan) 을 혼합하였다. β-casein 유전좌위의 증폭을 위해 DNA 변성은 94℃에서 1분, primer 결합은 54℃에서 1분, 그리고 DNA 신장은 72℃에서 1분으로 설정하여 35cycles을 실시하였다.
PCR 반응에 의해 증폭되어진 유전자좌의 다형성을 확인하기 위해 사용한 제한효소와 혼합액은 PCR 증폭산물 10㎕에 0.1㎕(10000U/㎖)의 Mse I과 2.0㎕의 incubation buffer 및 7.9㎕의 dH2O로 이루어진 혼합액(10㎕)을 가하여 65℃에서 5시간 동안 처리하였다.
PCR 반응으로 증폭한 유전자좌 증폭산물은 1% agarose gel(Hoefer Scientific Instruments, USA)에서 20V로 약 40분간 전기영동하여 결과를 보았고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 PCR 증폭산물을 확인하였다. 증폭산물을 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편들의 다형성을 확인하기 위해서 9% polyacrylamide gel에서 150V로 약 1시간 30분 동안 전기영동하였다.
PCR 반응으로 증폭한 유전자좌 증폭산물은 1% agarose gel(Hoefer Scientific Instruments, USA)에서 20V로 약 40분간 전기영동하여 결과를 보았고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 PCR 증폭산물을 확인하였다. 증폭산물을 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편들의 다형성을 확인하기 위해서 9% polyacrylamide gel에서 150V로 약 1시간 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 다형성을 확인하였다.
증폭산물을 제한효소로 처리한 후 얻어진 단편들의 다형성을 확인하기 위해서 9% polyacrylamide gel에서 150V로 약 1시간 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV 상에서 polaroid film(polaroid 667, UK)에 노출시켜 다형성을 확인하였다.
β-casein 유전자의 발현조절부위의 염기서열은 ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer(Perkin Elmer Co.)를 이용하여 direct automated sequencing에 의해 분석하였다. 그리고 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하였으며 젤의 조성은 dH2O, 40% acrylamide stock solution(acrylamide : bis-acrylamide = 19 : 1), 10×TBE(tris base, boric acid, Na2EDTA․2H2O), TEMED, 10% ammonium persulfate 등을 혼합하여 만들었다.
)를 이용하여 direct automated sequencing에 의해 분석하였다. 그리고 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하였으며 젤의 조성은 dH2O, 40% acrylamide stock solution(acrylamide : bis-acrylamide = 19 : 1), 10×TBE(tris base, boric acid, Na2EDTA․2H2O), TEMED, 10% ammonium persulfate 등을 혼합하여 만들었다. Sequencing reaction의 조성은 50ng/㎕ template, 3.
그리고 5% denaturing polyacrylamide gel을 이용하였으며 젤의 조성은 dH2O, 40% acrylamide stock solution(acrylamide : bis-acrylamide = 19 : 1), 10×TBE(tris base, boric acid, Na2EDTA․2H2O), TEMED, 10% ammonium persulfate 등을 혼합하여 만들었다. Sequencing reaction의 조성은 50ng/㎕ template, 3.2pmol primer, 8㎕ terminator ready reaction mix(Bigdye terminator, Perkin Elmer), 그리고 20 ㎕의 증류수로 구성하였다. Sequencing reaction products을 얻기 위한 PCR 온도 조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분으로 25회 반복 되게 하였으며 얻어진 sequencing reaction products 는 80㎕ distilled water, 10㎕의 3M NaOAc(pH 4.
2pmol primer, 8㎕ terminator ready reaction mix(Bigdye terminator, Perkin Elmer), 그리고 20 ㎕의 증류수로 구성하였다. Sequencing reaction products을 얻기 위한 PCR 온도 조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분으로 25회 반복 되게 하였으며 얻어진 sequencing reaction products 는 80㎕ distilled water, 10㎕의 3M NaOAc(pH 4.6), 250㎕의 95% ethanol, 그리고 70% ethanol로 정제하였다. 전기영동 후 PCR products sequence 의 분석은 DNA sequencing analysis software (Perkin Elmer Co.
6), 250㎕의 95% ethanol, 그리고 70% ethanol로 정제하였다. 전기영동 후 PCR products sequence 의 분석은 DNA sequencing analysis software (Perkin Elmer Co.) 프로그램을 이용하였다.
β-casein 유전자좌의 다형성을 분석하기 위하여 PCR 반응에 의해 증폭되어진 481bp의 단편을 제한효소 Bal Ⅰ으로 절단한 후 그 다형성을 확인하기 위해 3% agarose gel에 전기영동한 결과는 Fig. 2에 나타낸 바와 같다. Fig.
대상 데이터
한국재래산양의 유단백질의 유전적 다형성을 구명하기 위해 본 연구에 이용된 공시축은 충남 당진군 대호지면에서 사육중인 재래산양 55두와 유산양(Saanen)은 7두를 공시재료로 이용하였다. Genomic DNA 추출을 위한 혈액의 채취는 재래산양의 경정맥으로부터 혈액 10㎖을 진공 채혈관(vacuumtainer with lithium heparin)에 채취하여 실험에 이용하였다.
한국재래산양의 유단백질의 유전적 다형성을 구명하기 위해 본 연구에 이용된 공시축은 충남 당진군 대호지면에서 사육중인 재래산양 55두와 유산양(Saanen)은 7두를 공시재료로 이용하였다. Genomic DNA 추출을 위한 혈액의 채취는 재래산양의 경정맥으로부터 혈액 10㎖을 진공 채혈관(vacuumtainer with lithium heparin)에 채취하여 실험에 이용하였다.
이론/모형
Genomic DNA는 혈액으로부터 분리된 leukocyte pellets를 이용하여 Maniatis 등(1982)과 Gibco BRL manual methods에 의해 분리하였다.
β-casein 유전자좌의 증폭을 위해 사용된 primer는 Pappalardo 등(1990)에 의해 보고된 exon 2와 intron5을 증폭시킬 수 있는 forward primer로 5'-GAT GAA ACC TGC ACT CCT-3'과 reverse primer로는 5'-CTT CTT GTT GGT CTG TTG CT-3'을 이용하였다.
본 실험에 의해 확인된 β-casein 유전자좌위에 있어서 유전자빈도의 산출은 Pirchner(1983)의 simple gene counting법에 따라 다음과 같이 추정하였다.
재래산양 혈액으로부터 추출한 DNA를 Pappalardo 등(1996)에 의해 보고된 primer로 GeneAmp PCR system 2400(Perkin Elmer, USA) 을 이용하였으며, 유전자좌위의 증폭을 위한 PCR 온도조건은 94℃/1분, 59℃/1분, 92℃/1분을 1 cycle로 총 35 cycle을 수행하여 얻어진 β-casein유 전자좌의 증폭산물을 1% agarose gel에 전기영동한 결과는 Fig.1에 나타낸 바와 같다
성능/효과
2에서 보는 바와 같이 M은 pUC18 MSP I(Sigma USA)이며, 본 실험에서 β-casein 유전자좌는 절단되지 않은 상태의 481bp A유전좌단편과 197bp와 284bp의 두 단편을 나타내는 B유전자 좌위의 단편을 보였으며 Pappalardo 등(1996)이 보고한 결과와 일치하였다. 한편 한국재래산양 및 유산양에서 모두 β-casein 유전자형이 AB형 및 BB형만의 유전좌형만을 보 였는데 이는 β-casein A유전자빈도가 아주 낮고 샘풀의 크기가 작아서 AA 유전자형은 출현되지 않은 것으로 판단된다. β-casein의 유전자형을 개체별로 살펴보면 lane 3, 4, 7 및 8은 β-casein AB 형으로 Bal I 처리시 절단되지 않은 상태의 481bp의 A유전자단편과 197bp 및 284bp의 두 단편을 나타내는 B유전자 단편을 보였으며, lane 1, 2, 5 및 6은 197bp와 284bp의 B유전자 단편을 갖는 BB형을 나타내었다.
Pappalardo 등(1996)은 산양에서 β-casein의 유전자형은 AA, AB 및 BB 이 있다고 보고하였으나 본 연구의 재래산양에 있어서는 β-casein AB 및 BB형만 출현되고 AA형은 출현되지 않았는데 이는 A유전자빈도가 아주 낮고 sample의 수가 적었기 때문인 것으로 사료된다. β-casein의 유전자형 분포에 있어서는 한국재래산양에서 AB형이 6.25%이었고, BB형이 93.75%로 BB유전자형이 아주 높게 나타났다.
β-casein 유전자의 유전자빈도에 있어서는 한국 재래산양에서 β-casein A와 B 유전자빈도가 각각 0.286 및 0.714로 B 유전자빈도가 A유전자 빈도에 비하여 다소 높게 나타났다. 이는 Pappalardo 등 (1996)이 Alpine, Malta 및 Southern Italy 산양집단에서 β-casein A 유전자 빈도는 각각 0.
379로 보고한 결과와 비교하였을 때 한국재래산양의 경우 β-casein A 유전자빈도가 아주 낮은 빈도를 보여, 유산양인 Saanen종과 Alpine 종과는 차이를 보였지만 Malta 및 Southern Italy 산양집단에서의 보고와 유사한 유전자 빈도의 결과를 보였다. 이상의 결과에서 한국재래산양은 β -casein A 유전자 빈도가 유산양인 Saanen종 및 다른 염소 품종보다는 아주 낮은 빈도를 보이는 것으로 사료된다.
Fig. 3에 나타낸 바와 같이 β-casein의 intron 1 및 2의 일부와 exon2에 대한 염기서열을 GeneBank에 등록된 산양의 염기서열상의 차이를 비교하여 보면 분석된 총 481개의 염기서열중 intron 1의 일부와 exon2는 GeneBank에 등록된 산양과 재래산양간에 는 염기서열상에 차이를 보이지 않았으나, intron 2에서는 241, 204, 274, 323, 225, 326, 327, 325, 329, 330, 352bp 위치의 총 11개의 염기서열에서 차이를 보여 GeneBank에 등록된 산양과 재래산양간에는 97.71% 의 높은 염기서열의 상동성을 보였다.
한편 GeneBank에 등록된 산양의 325, 326, 327, 328, 329 및 330bp 위치에 A염기가 한국재래산양에서는 T로 치환되어 있음을 확인할 수 있었고, GeneBank에 등록된 산양의 352bp 위치에 염기가 결실되어 있었으나, 한국재래산양에서는 염기 A가 삽입되어 있었다. 이상의 결과에서 GeneBank에 등록된 β-casein의 염기서열과 한국재래산양간에 기능을 갖고있는 exon2 염기서열에는 차이가 없이 잘 보존되어 있었으며, intron2에서만 11개의 염기 서열에서 차이를 보여 97.
한편 GeneBank에 등록된 산양의 325, 326, 327, 328, 329 및 330bp 위치에 A염기가 한국재래산양에서는 T로 치환되어 있음을 확인할 수 있었고, GeneBank에 등록된 산양의 352bp 위치에 염기가 결실되어 있었으나, 한국재래산양에서는 염기 A가 삽입되어 있었다. 이상의 결과에서 GeneBank에 등록된 β-casein의 염기서열과 한국재래산양간에 기능을 갖고있는 exon2 염기서열에는 차이가 없이 잘 보존되어 있었으며, intron2에서만 11개의 염기 서열에서 차이를 보여 97.71%의 높은 상동성을 보였는데 이는 같은 종내의 품종으로서의 유전적 유사성이 아주 높은 것으로 사료된다.
본 연구는 한국 재래 산양 112두와 유산양인 Saanen종 7두의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하고, PCR-RFLP 방법에 의해 β-casein 유전자의 특성을 분석하여 한국재래산양의 효율적인 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 자료로 제공하고자 실시하였다. 한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 β-casein의 유전 자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다. β-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, β-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다.
한국재래산양의 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 β-casein의 유전 자좌를 증폭한 결과 각각 481bp 크기의 단편이 양호하게 증폭되었음을 확인하였다. β-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, β-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다. 유전자형 빈도에 있어서는 한국재래산 양에서 β-casein AB 및 BB의 빈도는 각각 6.
β-casein 유전자 좌의 증폭산물에 대한 Bal I의 제한효소를 처리한 결과, β-casein AB형은 481bp, 284bp 및 197bp의 단편을, 그리고 BB형은 284bp와 197bp의 단편을 한국재래산양과 유산양인 Saanen 종에서 확인 할 수 있었다. 유전자형 빈도에 있어서는 한국재래산 양에서 β-casein AB 및 BB의 빈도는 각각 6.25 및 93.75%이었고, 유산양인 Saanen 종은 각각 57.14 및 42.86%이었다. 유전자빈도에 있어서는 한국재래산양의 β-casein A 및 B의 빈도가 각각 0.
후속연구
71%의 상동성을 보였다. 따라서 한국재래산양의 β-casein 유전자의 다형성과 염기서열 분석에 의한 분자유전학적 특성의 규명은 한국재래 산양의 유전자원의 보존 및 개량을 위한 기초 및 응용 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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