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문제 정의
- 본 연구팀은 P. tolaasii의 특이 적 검출을 위한 PCR 방법을 개발하기 위하여 P. tolaasii의 tolaasin 생성에 관여하는 유전자를 클로닝하였고(이와 차, 1998), 이 유전자의 염기서열로부터 P. to/aasii에 특이적인 primer를 찾아서 순 수배 양된 세균으로부터는 P. tolaasii의 동정 이 가능하고 PCR 반응액에 P. tolaasii 세포가 3개만 존재하여도 검출이 가능하며, 검출하고자 하는 시료에 P. tola/sii와 매우 유사한 다른 세균이 10, 000게] 더 존재하여도 P. tolaasii를검 출할 수 있는 nested-PCR 방법 과 immunocapture - nested-PCR방법을 개발하여 보고하였다(Lee et a/, 2002). 본 연구에서는 개발된 PCR 방법을 이용하여 느타리 재배사에서 사용하는 물로부터 P.
- tolaasii를검 출할 수 있는 nested-PCR 방법 과 immunocapture - nested-PCR방법을 개발하여 보고하였다(Lee et a/, 2002). 본 연구에서는 개발된 PCR 방법을 이용하여 느타리 재배사에서 사용하는 물로부터 P. tolaasii를 검출하여 P. tolaasii의 오염정도를 파악해보고자 하였다.
제안 방법
- 물을 멸균한 종균배양용 플라스틱 통을 이용하여수집하였다. 실험실로 가져온 물은 100㎕를 NA (NutrientAgar; Bacto-beef extract 3 g, Bacto-peptone 5 g, Bacto-yeast extract 2 g, agar 15 g) 평판배지 에 도말하여 형성된 콜로u 수를 세어 물 속의 전체 세균수를 결정하였다. 수집한 물의 250㎕를 10, 000rpm에서 20분간 원심분리하여 가라앉은 세균세포를 1㎕ 멸균수에 현탁하였으며, 이 현탁액 10㎕는 직접 nested-PCR에 사용하였고 500㎕는 immunocapture-nested PCR에 사용하였다.
- 실험실로 가져온 물은 100㎕를 NA (NutrientAgar; Bacto-beef extract 3 g, Bacto-peptone 5 g, Bacto-yeast extract 2 g, agar 15 g) 평판배지 에 도말하여 형성된 콜로u 수를 세어 물 속의 전체 세균수를 결정하였다. 수집한 물의 250㎕를 10, 000rpm에서 20분간 원심분리하여 가라앉은 세균세포를 1㎕ 멸균수에 현탁하였으며, 이 현탁액 10㎕는 직접 nested-PCR에 사용하였고 500㎕는 immunocapture-nested PCR에 사용하였다.
- PCR 방법을 단순화하고 검출민감성을 높이기 위하여 세균 세포와 두 set의 primer를 이용한 nested-PCR를 실시하였다. PCR 방법은 Lee et al(2002)의 방법에 따랐다.
- PCR 방법은 Lee et al(2002)의 방법에 따랐다. 먼저 1차 PCR의 전체 PCR 반응액은 50㎕였으며, 그 반응액은 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH8.3, 1.5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 10 pM의 프라이 머 Pt- 1A(5'ATCCCTTCGGCGT TTACCTG3')와 Pt- 1D1 (5'CAAAGTAACCCTGCTTCTGC3*), 1 U 의 AmpliTaq Gold™ 중합효소 (PE Applied Biosystems,Norwalk, USA), 그리고 10 ㎕의 세균현탁액을 포함하였다. 이 반응액을 GeneAmp 2400(Perkin-Elmer, Norwalk, USA)에서 처음 95℃에서 10분간 처리 후 94℃ 에서 1분, 63℃에서 1분, 72℃에서 2분간 30회 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 처리하여 PCR를 수행하였다.
- 5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 10 pM의 프라이 머 Pt- 1A(5'ATCCCTTCGGCGT TTACCTG3')와 Pt- 1D1 (5'CAAAGTAACCCTGCTTCTGC3*), 1 U 의 AmpliTaq Gold™ 중합효소 (PE Applied Biosystems,Norwalk, USA), 그리고 10 ㎕의 세균현탁액을 포함하였다. 이 반응액을 GeneAmp 2400(Perkin-Elmer, Norwalk, USA)에서 처음 95℃에서 10분간 처리 후 94℃ 에서 1분, 63℃에서 1분, 72℃에서 2분간 30회 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 처리하여 PCR를 수행하였다. 2차 PCRe 10 ㎕의 세균현탁액 대신 2 ㎕의 1차 PCR 산물을 PCR 반응액에 첨가하였으며, 프라이 머는 Pt-PM(5'TGCCTTACGCGCTGATTGGC 3)과 Pt- QM (5'TGATCAAACTCCAGCAATAG3') 을 사용하였으며 반응액의 다른 성분과 증폭조건은 1차 PCR과 동일하게 하였다.
- 이 반응액을 GeneAmp 2400(Perkin-Elmer, Norwalk, USA)에서 처음 95℃에서 10분간 처리 후 94℃ 에서 1분, 63℃에서 1분, 72℃에서 2분간 30회 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 처리하여 PCR를 수행하였다. 2차 PCRe 10 ㎕의 세균현탁액 대신 2 ㎕의 1차 PCR 산물을 PCR 반응액에 첨가하였으며, 프라이 머는 Pt-PM(5'TGCCTTACGCGCTGATTGGC 3)과 Pt- QM (5'TGATCAAACTCCAGCAATAG3') 을 사용하였으며 반응액의 다른 성분과 증폭조건은 1차 PCR과 동일하게 하였다.
- 1% BS A (bovine serum albumin) 을함유한 PBS 용액으로 두 번 씻은 후 최종적으로 300㎕의 PBS에 현탁시켰다. 이 세균현탁액에 5㎕의 양(sheep)에서 만든 anti-rabbit IgG가 부착된 Dynabead™ M- 280(Dynal, Oslo, Norway)를 넣고 상온에서 30분간 반응 시 킨 후 자석 (MPC—M, Dynal, Oslo, Norway) 을 이 용하여 Dynabeads를 회수하였다. 회수된 Dynabeads를 5㎕ 의 멸균수에 현탁시키고, 이 현탁액을 nested—PCR에 직접 사용하였다.
대상 데이터
- 주로 충북지방의 느타리 재배사로부터 느타리 재배에 사용하는 물을 멸균한 종균배양용 플라스틱 통을 이용하여수집하였다. 실험실로 가져온 물은 100㎕를 NA (NutrientAgar; Bacto-beef extract 3 g, Bacto-peptone 5 g, Bacto-yeast extract 2 g, agar 15 g) 평판배지 에 도말하여 형성된 콜로u 수를 세어 물 속의 전체 세균수를 결정하였다.
이론/모형
- PCR 방법은 Lee et al(2002)의 방법에 따랐다. 먼저 1차 PCR의 전체 PCR 반응액은 50㎕였으며, 그 반응액은 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH8.
- 세균현탁액으로부터 P tolaasii의 immunocapture 및 nested—PCRe Lee et al(2002)의 방법에 따랐다. 세균 현탁액 500㎕에 PBS에 500배 희석한 F.
성능/효과
- 수집된 전체 57개 물에는 일반 세균이 전혀 배양되지 않는 시료로부터 ml당 400, 000 cfu (colony forming unit)이상의 세균이 포함되어 있는 시료까지 다양하였다. 전체의 28.1%인 16개 물에는 ㎖당 1,000 cfu 이하의 일반 세균을 포함하고 있었으며, 54.4%인 31개의 시료가1, 001-10, 000 cfu, 10.5%인 6개의 시료가 10, 001- 100, 000 cfu, 그리고 7%인 4개의 시료가 100, 001 cfu 이상의 세균을 포함하고 있었다(Table 1). 이상의 결과는 일부 재배사에서 사용하는 물에 상당히 많은 수의 세균이 포함되어 있다는 것을 의미한다.
- 5%인 6개의 시료가 10, 001- 100, 000 cfu, 그리고 7%인 4개의 시료가 100, 001 cfu 이상의 세균을 포함하고 있었다(Table 1). 이상의 결과는 일부 재배사에서 사용하는 물에 상당히 많은 수의 세균이 포함되어 있다는 것을 의미한다. 그러나 이러한 세균이 버섯에 어떠한 영향을 미치는지는 아직까지 알 수 없다.
- 물로부터 P. tolaasii을 검출하는 실험에서는 전체의 5.3%인 3곳의 물에서 nested—PCR에 의해 병원균인 P.tolaasii ^-^>1 DNA가 증폭되었고, IC—nested—PCR의해서는 전체의 35.1%인 20개의 시료로부터 예상한 크기의 P. tolaasii 특이 적 DNA 밴드가 증폭되 었다(Table 1). 이 결과는 P.
- 첫째는 nested—PCR과 IC-nested-PCR를 위해서 수집한 물 250 ml를 원심분리하여 생긴 pellet를 1 ml로 현탁하여 10㎕를 직접 nested-PCR에 시.용하였고, 500㎕를 IC-nested-PCR에 사용하였으므로 IC-nested-PCR에 사용한 시료에 nested-PCR에 사용한 시료에서보다 50배 많은 세균이 사용되었고, nested-PCR의 경우 농축한 시료를 직접 PCR반응에 사용하였으므로 농축된 시료에 P. tolaasii가 아닌 다른 non-target 세균이 많이 있을 경우와보다 중요하게 농축된 시료에 PCR반응을 저해하는 저해물이 존재 할 경우 P. tolaasii가 존재하더라도 P. tolaasii특이적 DNA를 증폭하지 못했을 가능성이 매우 크다. 반면에 IC-nested-PCR의 경우 nested-PCR보다 세균을 50배 더 많이 사용했을 뿐만 아니라 P.
- 이러한 이유에도 불구하고 전체의 35.1%의 물에서 P. tolaasii가 검출되었다는 것은매우 높은 빈도로 P. tolaasii 가 검출된 결과이어서 혹시 IC-nested-PCR에 의해 다른 target으로부터 혹은 DNA의 target이 아닌 다른 부위 로부터 잘못 증폭된 결과(false positive)7} 의심되므로 증폭된 DNA를 처음 primer를 design한 DNA와 hybridization 한 실험을 수행하였는데, nested-PCR 혹은 IC—nested— PCR로 증폭한 모든 DNA는 원래 DNA와 모두 잘 hybridize되어 (결과 첨 가하지 않음, Lee et al, 2002의 논문 참고) 이 결과의 false positive에 의할 가능성은 없다.
- 이상의 결과는 세균성갈색무늬병 병원균 검출에 있어서 순수배양한 세균을 이용한 실험에서는 nested-PCR과 IC-nested-PCR의 검출민감도에 차이가 없지만(Lee et al, 2002) 물로부터 병원균을 검출하는 방법으로는 IC- nested-PCR이 nested-PCR에 비해 휠씬 우수한 방법임을 제시해주고 있으며, 물 이외의 다른 시료로부터 병원균을 검출하는 방법으로도 IC-nested-PCR 방법이 보다 좋은 방법임을 암시해주고 있다.
- tolaasii를 가지고 있는 것을 의미한다. 물론 양송이 세균성갈색무늬병의 경우 병발생을 위해서는 높은 밀도(최소한 6xl07cfu/ml)의 병원세균이 존재해야 한다는 보고 (Wong과 Preece, 1982)가 있으므로 느타리에서도 병발생을 위해 높은 밀도의 세균이 요구된다면 재배사에서 사용하는 물에서 P. tolaasii가 검출되었다고 해서 바로 병이 발생한다고 할 수는 없지만, 재배사에서 사용하는 물이 중요한 병원균의 오염원임은 확실하다는 것을 본 연구의 결과가 제시해주고 있다.
- 느타리 세균성갈색무늬병 병원균 P. tolaasii의 전염 원을 파악하기 위하여 느타리 재배사에서 사용하고 있는 물로부터 PCR방법을 이용하여 병원세균을 검출한 결과, 주로 충북지방의 느타리 재배사에서 수집된 57개 물 시료 전체의 28.1%인 16개 물에는 ㎖당 1,000 cfu 이하의 일반 세균을 포함하고 있었으며, 54.4%인 31개의 시료가1, 001-10, 000 cfu, 10.5%인 6개의 시료가 10, 001- 100, 000 cfu, 그리고 7%인 4개의 시료가 100, 001 cfu 이상의 세균을 포함하고 있었다. P.
- 3%인 3곳의 물이Immunocapture - nested - PCRS. 검출하였을 경우 전체의 35.1%인 20개의 물 시료로부터 P. tokasii 특이적 DNA가 증폭되었다. 물에 포함된 일반세균의 농도와 P.
- tolaasii 검출과는 상관없었다. 이상의 결과는 물로부터 병원균을 검출하는 방법으로 IC-nested-PCR 방법이 더 민감하고 우수한 방법이며, 여러 곳의 느타리 재배사에서 사용하고 있는 물이 병원균 P. tolaasii으로 오염되어 있는 것을 제시하고 있다.
후속연구
- 그러나 지금까지 느타리 재배환경에서 병원균의 전 염원 파악, 전염경로 추적, 발병환경 조건에 대한 정보가 매우 부족한 실정이다. 그런데 이러한 느타리 세균성 갈색무늬병의 병원세균의 정확한 생태파악, 병 발생 예측에 의한 병 발생 예방, 그리고 효과적인 병 방제법의 확립 등을 위한 연구를 위해서는 무엇보다 병원균인 P. tolaasii의 정확하고 민감하며 신속한 검출 및 동정 방법이 있어야 한다.
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