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문제 정의
- mimicus와 유사하지만 현재까지 분류되지 않은 다른 균종일 가능성이 높을 것으로 생각된다. 또한 분자생물학적 확인, 독성에 관한 특성 및 생태적인 특성이 더 세밀히 구명되어야 할 것으로 생각되므로 생화학적 차이를 분류의 기초 자료로서 제시하는 바이다.
- , 1995) Vibrio 속 세균일 것으로 추정이 되면서 용혈독소를 생산하는 균주가 분리되었다. 이 균주는 생화학적 특성상 기본적인 것은 V mimicus와 유사하였으나 세부적인 측면에서 차이를 보였으므로 아직 분류되지 않은 Vibrio 속이라고 추정되어 형태, 병원성 및 세균학적 특성과 16S rDNA 염기서열을 조사한 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 생화학적 시험에서 일치하는 균종이 없었던 시험 균주 Vibrio sp. E10의 분류학적 위치를 파악하고자 세균 자동동정기를 이용한 동정을 실시하였다.
- PCR 반응은 DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus)를 사용했으며, primer는 6F (5'GRAGTTTGATCMTGGC; csorresponding to position 6 to 23 of Escherichia coli 16SRANA)와와 1492 R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT; corresponding to position 1474 to 1492 of Escherichia coli 16S rDNA)을 사용하였다.
- 용혈 활성은 human 및 sheep blood agar plate에 균배양액을 획선하고 37±1℃에서 24시간 배양 후 투명 환을 확인하였다. Rat에 대한 피부혈관 투과 항진 성 시험은 Wista계 rat(270g)의 꼬리 정맥에 5% evans blue 0.1 mL 주사한 후 Kim (1993)의 방법에 준하여 조제한 조독소 용액을 rat의 털을 깎고 등피 중층에 0.1 mL 주사한 다음 6시간 경과 후 등피를 잘라 내피 쪽에서 혈관 내 알부민 누출에 따른 spot 관찰로 용혈성을 확인하였다. Mouse에 대한 치사 독성 시험은 Kim (1989)과 같은 방법에 따라 실시하였다.
- 균주를 LB broth (Luria-Bertani broth, 10 g of Tryptic digest of casein (Tryptopane); 5 mg of Yeast extract; 10g of NaCl; pre-adjusted to pH 7.0)에서 35℃, 18시간 동안 증균 배양한 후 Bioneer사의 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit(K-3032)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
- 금강 하구의 기수 시료를 1% peptone water에 접종하여 증균 배양한 후 TCBS 평판배지 상에서 분리하고 Bergey's manual (Holt et al., 1994)과 미국 FDA (Food and Drug Administration, 1992)의 방법에 준하여 기본적인 생화학적 시험을 실시하여 기존의 vibrio 속과 다른 균주를 선택하였다.
- 시험 균주를 BHI (Brain heart infusion, Difco Co., USA) broth에 37±1℃로 14시간 배양한 균액을 염분 및 pH를 각각 다르게 조정한 1% peptone water에 접종하여 24시간 배양한 후 각각의 증식 여부를 육안으로 측정하였으며 온도에 대한 증식 여부도 같은 방법으로 측정하였다.
- 염기서열 분석은 ABI 310 Automatic Sequencer (Perkin Elmer)와 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer)를 사용하여 실시하였고, 확보된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 World Wide Web Blast DNA database search service를 이용하여 검색하였다.
- 용혈 활성은 human 및 sheep blood agar plate에 균배양액을 획선하고 37±1℃에서 24시간 배양 후 투명 환을 확인하였다. Rat에 대한 피부혈관 투과 항진 성 시험은 Wista계 rat(270g)의 꼬리 정맥에 5% evans blue 0.
- 실험에 사용된 미국 Biolog사의 세균 자동동정기 시스템은 시험 균주의 탄 소원 및 질소원 기질 95종류에 대한 이용능력을 흡광도로 측정하고 이 값을 % data로 변환하여 +, -, V 등으로 나타낸 후 시스템 내에 database로 구축된 기존의 알려진 균의 반응 결과와 비교하는 동정 시스템이다. 이때 상호유사성 (similarity)이 0.5 이하이거나 편차 (distance)가 5.0 이상일 경우 동정이 안 된 것으로 분석하였다.
이론/모형
- 1 mL 주사한 다음 6시간 경과 후 등피를 잘라 내피 쪽에서 혈관 내 알부민 누출에 따른 spot 관찰로 용혈성을 확인하였다. Mouse에 대한 치사 독성 시험은 Kim (1989)과 같은 방법에 따라 실시하였다.
- 분리 균의 동정은 미국 Biolog사의 세균 자동동정기 (Micro Log™ system, Release 4.0)로 실시하였다.
성능/효과
- Vibrio sp. E10의 16S rDNA 염기서열은 10여 종의 V. cholerae 와 1종의 Vibrio mimicus의 염기서열과 99%의 상동성을 보여 유사 종으로 판명되었다.
- Vibrio sp. E10의 16S rDNA 염기서열은 Heidelberg et al. (2000)에 의해 보고된 V. cholerae El Tor N16961를 비롯한 10여 종의 V. cholerae 와 V. mimicus ATCC 33653T의 염기서열과 99%의 상동성을 보여 동일한 그룹 (Proteobacteria; gamma subdivision; Vibrionaceae; vibrio)에 속하는 유사 종으로 판명되었다 (Fig.4).
- mimicus와는 차이를 보였다. Human과 sheep blood agar에서의 뚜렷한 용혈 환과 rat에 피부 혈관투과 항진 작용으로 용혈 독성이 있었으며, mouse에 대한 치사 독성이 있었으므로 병원성이 확인되었다.
- mimicus와는 tween 40, cellobiose, gentiobiose, minositol, β-methyl-D-glucoside, D-sorbitol, α-hydroxybutyric acid, succinamic acid, D-alanine, L-alanine, L-alanyl-glycine, L-asparagine, L-glutamic acid, glycyl-L-aspartic acid, glycyl-L-glutamic acid, thymidine, glycerol, D,L-a-glycerol phosphate 등 18종류의 항목이, V cholerae 와는 tween 40, N-acetyl-D-galactosamine, α-Dlactose, sucrose, acetic acid, citric acid, α-hydroxybutyric acid, succinamic acid, D-alanine, L-proline, glucose-6-phosphate 등 11종류의 항목이 다른 반응을 나타내었다. V. cholerae 에서 V. mimicus가 새로운 종으로 독립 명명될 때 유전적 상동성에서는 큰 차이를 보였으나 생화학적 시험에서는 sucrose 분해성과 Voges-Proskauer 시험 등 2항목에서만 차이를 보였던 점 (Davis et al., 1981)을 감안하면 시험 균주는 V. mimicus와 유사하지만 현재까지 분류되지 않은 다른 균종일 가능성이 높을 것으로 생각된다. 또한 분자생물학적 확인, 독성에 관한 특성 및 생태적인 특성이 더 세밀히 구명되어야 할 것으로 생각되므로 생화학적 차이를 분류의 기초 자료로서 제시하는 바이다.
- 그러나 세균 자동동정기를 이용한 동정 결과, genus는 Vibrio 속으로 동정되었으나 species는 일치하는 균종이 없었다. 알려진 Vibrio 속 중에서 유사성이 높았던 V mimicus와 비교해 볼 때 18종류의 항목이, V.
- 동정 결과 균 속의 차원에서는 거의가 Vibrio 속으로 동정되었다 (Table 6). 그러나 균종 동정을 위한 상호유사성(similarity)은 모두 0.
- 3). 또한 균배양액을 복강 투여받은 mouse가 땀과 설사 증상을 보이며 대부분 4~6시간 이내에 사망하여 균주 배양액은 강한 치사 독성을 나타내었다 (Table 2).
- 0 이상이었으므로 시스템 내 database의 Vibrio 속과는 일치하는 균주가 없었다. 반면 대조구로 사용한 일본 오까야마 대학으로부터 분양받은 V. vulnificus의 동정 결과 similarity 0.77, distance 2.02의 V. vulnificus로 동정되어 사용 시스템의 신뢰성을 나타내었다. 한편 두 균주에 대한 5회의 시험 결과를 Table 7과 같이 종합하고 기본적인 생화학적 시험에서 유사하였던 V.
- 분리된 시험 균주는 TCBS 평판배지에서 직경 l~2mm가량의 녹색 집락을 형성하여 V. vulnificus와 유사하였으며 집락의 크기가 작은 V. mimicus와는 차이가 있었다. 미국 FDA (Food and Drug Administration, 1992) 및 Bergey's manual (Holt et al.
- 그러나 세균 자동동정기를 이용한 동정 결과, genus는 Vibrio 속으로 동정되었으나 species는 일치하는 균종이 없었다. 알려진 Vibrio 속 중에서 유사성이 높았던 V mimicus와 비교해 볼 때 18종류의 항목이, V. cholerae 와는 11종류의 항목이 다른 반응을 나타내어 미분류 균종으로 확인되었다.
- vulnificus로 동정되어 사용 시스템의 신뢰성을 나타내었다. 한편 두 균주에 대한 5회의 시험 결과를 Table 7과 같이 종합하고 기본적인 생화학적 시험에서 유사하였던 V. mimicus 및 V. cholerae를 비교하면, V. mimicus와는 tween 40, cellobiose, gentiobiose, minositol, β-methyl-D-glucoside, D-sorbitol, α-hydroxybutyric acid, succinamic acid, D-alanine, L-alanine, L-alanyl-glycine, L-asparagine, L-glutamic acid, glycyl-L-aspartic acid, glycyl-L-glutamic acid, thymidine, glycerol, D,L-a-glycerol phosphate 등 18종류의 항목이, V cholerae 와는 tween 40, N-acetyl-D-galactosamine, α-Dlactose, sucrose, acetic acid, citric acid, α-hydroxybutyric acid, succinamic acid, D-alanine, L-proline, glucose-6-phosphate 등 11종류의 항목이 다른 반응을 나타내었다. V.
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