[논문]PCR-RFLP 기법을 이용한 Porcine Stress Syndrome의 진단

황의경; 김연수

PCR-RFLP 기법을 이용한 Porcine Stress Syndrome의 진단
Detection of the Ryanodine Receptor Gene Mutation Associated with Porcine Stress Syndrome from Pig Hair Roots by PCR-RFLP 원문보기

大韓獸醫學會誌 = Korean journal of veterinary research, v.42 no.1 = no.106, 2002년, pp.65 - 71

황의경 (상지대학교 생명자원과학대학 응용동물과학부) , 김연수 (상지대학교 생명자원과학대학 응용동물과학부)

Abstract ▼ AI-Helper

We have utilized the PCR-RFLP method to detect the ryanodine receptor(RYR1) gene mutation and to estimate the genotype frequencies of the RYR1 gene in commercial crossbred pig population. The exon region(659bp) including point mutation(C ${\rightarrow}$T; Arg ${\rightarrow}$Cys) in the porcine ryanodine receptor gene, which is a causal mutation for PSS, was amplified by PCR and digested with Cfo I restriction enzyme. The RYR1 gene was classified into three genotypes by agarose gel electrophoresis. The normal homozygous(NN) individuals showed two DNA fragments consisted of 493 and 166bp. The mutant homozygous(nn) individuals showed only one DNA fragment of 659bp. Also, all three fragments(659, 493 and 166bp) were showed in heterozygous(Nn) carrier animals. The proportions of normal, carrier and PSS pigs within crossbred population of pigs were 81%, 15% and 4%, respectively. According to the results of analysis of variance for the association of genotypes of RYR1 of pigs at 30kg, day age at 90kg and average daily gains, the RYR1 nn genotype was very higher than RYR1 NN genotype for day age at 30kg with 5% level of significant difference, but no significant difference for association of any other genotypes with day age at 90kg and average daily gain in crossbred pigs. Therefore, DNA diagnosis by using PCR-RFLP analysis for the PSS gene was useful for large-scale screening of commercial pigs in the swine industry.

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문제 정의

본 연구는 PCR-RFLP 기법을 이용하여 국내 일반 양돈장에서 사육 관리되고 있는 비육용 교잡돈 집단의 PSS 유전자 출현빈도를 파악하여 PSE 돈육 발생을 억제하므로써 육질 개량 및 고품질 돼지고기 생산을 위한 기초자료를 얻고자 수행하였다.
따라서 스트레스에 의한 돼지 폐사율을 크게 줄이고 고품질 돈육생산을 통한 양돈농가의 경쟁력 제고를 위하여 스트레스 감수성 돼지에 대한 검색기술 개발과 함께 각종 스트레스 인자가 스트레스 감수성 돼지에 미치는 영향에 관한 연구는 중요한 과제라고 할 수 있다. 지금까지 국내에서는 주로 혈액을 이용하여 RYR1 유전자 돌연변이를 검출하였으나 혈액보다 채취하기가 훨씬 용이하고 돼지에게 가해지는 스트레스로 줄일 수 있도록 모근을 이용하여 이를 검출할 수 있는 방법을 국내에서는 처음으로 적용하였기에 이를 보고하고자 한다^12,13.

가설 설정

a, b : Means in the same row with different superscripts are significantly different(P < 0.05).

제안 방법

5μM, dNTP 각 200μM, 10× PCR buffer 그리고 Taq DNA polymerase 1 unit를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR cycle은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 1분, 67℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분간의 cycle을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료하였다.
PSS의 원인이 되는 ryanodine receptor 유전자의 단일 염기 돌연변이(C →T; Arg →Cys)를 포함하는 659bp 영역을 PCR로 증폭한 후 Cfo I 제한효소로 처리하므로써 검정 개체의 DNA 유전자형을 판정하였다. 정상개체(NN)는 493bp와 166bp 2개의 DNA 단편이 검출되었으나 돌연변이 유전자를 동형접합체로 가지고 있는 PSS 감수성 개체(nn)는 659bp의 단일 밴드만이 검출되었다.
RYR1 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응조건은 GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer Cetus, Foster City, California, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉, 반응액은 0.
각 검정대상 공시돈으로부터 채취한 모근의 genomic DNA의 추출은 Trommelen et al⁹의 방법을 변형하여 수행하였다. 즉 두당 3∼5개의 모근을 100% 에탄올에 10초간 담근 후 3차 증류수를 이용하여 수세하고 1.
화살표가 가리키는 990bp 부분의 C가 T로 치환됨으로써 PSS 돈이 발생하게 된다. 따라서, 990bp 부분이 C가 T로 치환된 것을 확인하기 위하여 다음과 같은 RYR1-F와 RYR1-R 두 개의 primer 조합을 설계하고 합성하였다.
PCR-RFLP 방법으로 PSS를 유발하는 ryanodine receptor 유전자의 단일 염기돌연변이(C →T)인 990번째를 포함하는 염기배열을 갖는 primer를 이용하여 RYR1 유전자 좌위를 증폭한 PCR 결과는 Fig 2와 같다. 또한, PCR 반응에 의해 증폭된 659bp의 RYR1 유전자 좌위의 PCR 증폭산물을 Cfo I 제한효소를 이용하여 절단한 다음 그 다형성을 확인하기 위하여 agarose gel 전기영동법으로 검출한 RFLP 양상은 Fig 3과 같다. Fig 3에서 보는 바와 같이 제한효소 Cfo I(G/CGC)으로 절단하였을 때 돌연변이 유전자가 존재하지 않는 정상의 개체(NN)에서는 493bp와 166bp 2개의 band가 검출되었다.
5% SDS)와 proteinase K(500㎍/ml)를 첨가하고 65℃에서 10시간정도 배양한 후 4℃에서 원심분리기를 이용하여 12,000rpm 속도로 10분간 원심분리하였다. 상청액에 phenol:chloroform:isoamylalchol(25:24:1)을 동량 섞어 4℃에서 14,000rpm 속도로 원심분리한 다음 상청액에 다시 chloroform : isoamylalchol(24:1)을 동량 첨가한 후 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 spectrophotometer를 이용하여 DNA 농도를 정량한 후 PCR에 이용하였다.
PCR 종료 후 RYR1 유전자(659bp)의 제한효소 처리는 5㎕의 증폭산물에 5 unit의 Cfo I (Boehringer Mannheim) 제한효소를 이용하여 37℃에서 3시간 이상 반응시켜 절단했다. 제한효소로 절단하여 얻어진 DNA 단편을 TBE buffer(90mM tris-borate, 2mM EDTA, pH 8.0)를 이용한 2% agarose gel로 전기영동하여 분리한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 UV 상에 발현된 DNA band 양상을 관찰하고 각 개체별 PSS 유전자형을 판정하였다.
RYR1 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응조건은 GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer Cetus, Foster City, California, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉, 반응액은 0.5㎖ tube에 template DNA 50∼80ng, primer 각 0.5μM, dNTP 각 200μM, 10× PCR buffer 그리고 Taq DNA polymerase 1 unit를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR cycle은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 1분, 67℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분간의 cycle을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 공시재료는 종돈장으로부터 종돈 능력 검정을 위해 출품된 종돈 총 100두(대요크셔 45두, 랜드레이스 38두, 듀록 17두)와 강원도와 경기도 일대의 양돈장에서 사육관리되고 있는 교잡종 돼지 총 100두로부터 채취한 모근(각 두당 3∼5개)을 공시재료로 이용하였다.

성능/효과

PCR-RFLP 기법을 이용하여 RYR1 유전자 돌연변이를 진단한 결과 정상개체가 전체의 81두(81.0%)로 매우 높은 출현율을 보인 반면 헤테로(잠재성) 개체가 15두(15.0%)였고, PSS 감수성 개체의 출현 비율은 4두(4.0%)로 출현빈도가 매우 낮았다. 이러한 연구 결과를 국내외 연구자들의 PSS에 관한 연구결과와 비교하여 보면 약간 높은 수치였다^7,8,11,12,13.
7로 나타났으며, 30㎏ 도달일령과 90㎏ 도달일령은 PSS 개체(nn)가 정상개체(NN)에 비하여 현저하게 늦은 경향을 보였다. PSS 개체와 정상개체간 차이는 30㎏ 도달일령, 90kg 도달일령과 일당증체량에서 통계적 유의성이 있었으며 PSS 개체와 잠재성 개체간의 차이는 일당증체량과 90㎏도달일령에서 통계적 유의성이 있었다(P < 0.05). 이상의 결과를 종합해 볼 때 돼지의 30kg 도달일령과 90kg 도달일령은 PSS 개체(nn)가 정상개체(NN)에 비하여 유의적으로 늦었고, 일당증체량에서는 정상개체(NN)가 PSS 개체(nn)에 비하여 유의적으로 높았다.
RYR1 유전자형과 30kg 도달일령, 90kg 도달일령 및 일당증체량과의 연관성 분석에서 30kg 도달일령과 90kg 도달일령은 RYR1 유전자 좌위의 정상개체(NN), 헤테로(잠재성) 개체(Nn) 및 PSS 감수성 개체(nn) 유전자형이 각각 73.9, 75.3 및 78.0과 141.7, 143.8 및 152.7로 나타났으며, 30㎏ 도달일령과 90㎏ 도달일령은 PSS 개체(nn)가 정상개체(NN)에 비하여 현저하게 늦은 경향을 보였다. PSS 개체와 정상개체간 차이는 30㎏ 도달일령, 90kg 도달일령과 일당증체량에서 통계적 유의성이 있었으며 PSS 개체와 잠재성 개체간의 차이는 일당증체량과 90㎏도달일령에서 통계적 유의성이 있었다(P < 0.
Fig 3에서 보는 바와 같이 제한효소 Cfo I(G/CGC)으로 절단하였을 때 돌연변이 유전자가 존재하지 않는 정상의 개체(NN)에서는 493bp와 166bp 2개의 band가 검출되었다. 그러나 돌연변이 유전자를 동형접합체 상태로 보유하고 있는 PSS 감수성 개체(nn)는 C → T의 염기치환으로 Cfo I 제한효소의 인자부위가 존재하지 않아 659bp의 단일 band만이 검출되었고 한편, 돌연변이 유전자를 이형접합체 상태로 보유하고 있는 헤테로(잠재성) 개체(Nn)는 정상 유전자와 PSS 유전자를 절반씩 가지므로 493bp와 166bp 2개의 band 이외에 Cfo I 제한효소에 의해 인식되지 않는 659bp band까지 3개의 band가 모두 검출되었다.
8%로 나타났지만 PSS인 개체는 검색되지 않아 매우 낮은 PSS 유전자의 비율을 나타냈다. 그러나, 랜드레이스는 헤테로 31.6%, PSS 13.2%로 매우 높은 비율의 PSS 유전자를 보유하고 있음을 알 수 있었다.
또한, 돼지 품종별 PSS 유전자형 출현빈도는 Table 2와 같다. 대요크셔는 헤테로가 18.0%, PSS인 개체는 4.0%를 나타내었으며, 듀록은 헤테로가 11.8%로 나타났지만 PSS인 개체는 검색되지 않아 매우 낮은 PSS 유전자의 비율을 나타냈다. 그러나, 랜드레이스는 헤테로 31.
05%에서 통계적 유의차가 인정된다고 하였으며, Wittmann et al¹⁷과 Hanset et al¹⁸은 헤테로 개체가 정상개체나 PSS 감수성 개체보다 평균 일당증체량이 높을 뿐만 아니라 육질에 영향을 미친다고 보고하였다. 본 연구의 결과를 외국의 경우와 비교하여 보면 PSS 유전자형 발생 비율이 다소 높은 것을 알 수 있었는데, 이러한 결과는 우리나라 비육돈의 생산방식이 대부분 대요크셔, 랜드레이스 및 듀록의 3개 품종을 이용한 3원 교잡종 돼지를 생산하고 있기 때문에 이들 3품종의 평균 PSS 유전자 출현빈도와 큰 차이가 나지 않는 것으로 판단된다.
비육용 교잡종 돼지의 RYR1 유전자형과 30kg 도달일령, 90kg 도달일령 및 일당증체량간의 연관성을 규명하기 위한 분산분석에서 RYR1 nn 유전자형이 NN 유전자 형보다 30kg 도달일령에서 5% 수준에서 유의적으로 높았으나 그외 다른 유전자형은 90kg 도달일령 및 일당증체량에 유의적인 영향을 미치지 않았다.
그리고 이형접합체의 잠재성 개체(Nn)는 659, 493 및 166bp 3개의 밴드가 모두 관찰되었다. 이 실험에 이용된 비육용 교잡종 100두에서 정상 개체가 73.6%였고 이형 접합체의 잠재성 개체가 21.6% 그리고 PSS 감수성 개체의 출현비율은 4.8%로 조사되었다.
05). 이상의 결과를 종합해 볼 때 돼지의 30kg 도달일령과 90kg 도달일령은 PSS 개체(nn)가 정상개체(NN)에 비하여 유의적으로 늦었고, 일당증체량에서는 정상개체(NN)가 PSS 개체(nn)에 비하여 유의적으로 높았다.
PSS의 원인이 되는 ryanodine receptor 유전자의 단일 염기 돌연변이(C →T; Arg →Cys)를 포함하는 659bp 영역을 PCR로 증폭한 후 Cfo I 제한효소로 처리하므로써 검정 개체의 DNA 유전자형을 판정하였다. 정상개체(NN)는 493bp와 166bp 2개의 DNA 단편이 검출되었으나 돌연변이 유전자를 동형접합체로 가지고 있는 PSS 감수성 개체(nn)는 659bp의 단일 밴드만이 검출되었다. 그리고 이형접합체의 잠재성 개체(Nn)는 659, 493 및 166bp 3개의 밴드가 모두 관찰되었다.
이상과 같이 비육용 교잡돈을 대상으로 Cfo I 제한효소를 이용하여 RYR1 좌위의 PCR-RFLP 유전자형 및 유전자 출현빈도를 분석한 결과는 Table 1과 같다. 즉, 국내 비육용 교잡돈 100두에서 NN, Nn 및 nn 3종류의 유전자형이 확인되었으며, 이 가운데 정상 즉, PSS 저항성 개체가 전체의 81두(81.0%)로 매우 높은 출현율을 보인 반면 이형접합체의 잠재성 개체가 15두(15.0%)였고, PSS 감수성 개체의 출현 비율은 4두(4.0%)로 출현빈도가 매우 낮았다.

후속연구

따라서, 이 연구의 PCR-RFLP 기법을 이용한 DNA 검사 방법은 양돈 산업에서 대단위 집단의 돼지 PSS 유전자 진단에 신속 정확하게 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.
앞으로 이 기술을 이용하여 국내 종돈장 및 일반 양돈장에서 보다 쉽게 PSS 유전인자 보유 돼지를 검출함으로써 생산성 향상 및 PSE 돈육의 발생을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 생각된다.

참고문헌 (18)

MacLennan DH and Phillips MS. Malignant hyperthermia. Science 256:789-794, 1992
Sather AP, Jones SDM, Tong AKW, et al. Halothane genotype by weight interactions on pig meat quality. Can J Anim Sci 71:645-651, 1991
Simpson SP, Webb AJ. Growth and carcass performance of British landrace pigs heterozygous at the halothane locus. Anim Prod, 49:503-509
Christian LL. Inheritance of the porcine stress syndrome. Proc Anim Ind Week, Iowa State Univ. AS-447D, 1977.
Fujii J, Otsu K, Zorzaton F et al. Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science 253:448-451, 1991
Rempel WE, Lu MY, Mickelson JR et al. The effect of skeletal muscle ryanodine receptor genotype on pig performance and carcass quality traits. Anim Sci60:249-257, 1995
Houde A, Pommier SA, Roy R. Detection of the ryanodine receptor mutation associated with malignant hyperthermia in purebred swine populations. J AnimSci 71:1414-1418, $1993^a$
Houde A, Pommier SA. Use of PCR technology to detect a mutation associated with malignant hyperthermia in different pig tissues. Meat Sci 33:349, $1993^b$
Trommelen GJM, Den Dass NHG, Vijg J et al. Identify and paternity testing of cattle: Application of a deoxyribonucleic acid profiling protocol. J Dairy Sci76: 1403-1411, 1993
Topel DG, Bicknell EJ, Preston KS et al. Porcine stress syndrome. Mod Vet Pract 49:40, 1968
Knorr C, Schwille M, Moser G et al. Calcium-releasechannel genotypes in several pig populations associations with halothane and CK reactions. J Anim Breed Genet 111:243, 1994
박영일, 박태섭, 신영수 등. PCR-RFLP 기법을 이용한 PSS 돼지 검색에 관한 연구. 한국동물유전육종학회지 1:73-80, 1997
정의룡, 김우태, 김동균. DNA 분석기법을 이용한 PSS 돼지 진단. 생명자연과학논총 4:53-62, 1998
Berger PJ, Christian LL, Louis CF et al. Estimation of genetic parameters for growth, muscle quality and nutritional content of meat products for centrally tested purebred market pigs. Research Investment Report, National Pork Producers Council, Des Moines, Iowa. 51-63. 1994
O'Brien PJ, Shen H, Cory CR et al. Use of a DNA-based test for the mutation associated with porcine stress syndrome(malignant hyperthemia) in 10,000 breeding swine. J Am Vet Med Assoc 203:842-851, 1993
Leach LM, Ellis M, Sutton DS et al. The growth performance, carcass characteristics and meat quality of halothane carrier and negative pigs. J Anim Sci 74:934-943, 1996
Wittmann W, Peschke W, Littmann E et al. Mast-und schlachtleistungen von DL-Kastraten in Abhangigkeitvon MHS-Genotyp. Zuchtungskunde 65:197-205, 1993
Hanset R, Dasnois C, Scalais S et al. Genotypes au locus de sensibilite a halothane et caracteres de croissance et de carcass dans une population F2pietrain $\chi$ Large White. Genet Sel Evol 27:63-76, 1995

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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