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문제 정의
- 본 연구에서는 UAE가 즉시형 알레르기 반응의 조절에 미치는 효과를 검토하기 위하여 in vivo 실험으로 비면 역학적 자극제인 compound 48/80에 의한 전신성 아나필락시 및 IgE 매개 수동 피부 아나피락시에 대한 효과를 실험하였다. 또 in vitro 실험으로 compound 48/80에 의해 유도되는 복강 비만세포로부터 히스타민 유리 조절과 cAMP에 미치는 효과를 실험하였다.
- 본 연구에서는 연명초가 즉시형 알레르기 반응에 미치는 효과를 확인하기 위하여 in vivo 실험으로 compound 48/80 유도 전신성 아나필락시와 anti-DNP IgE 매개 국소성 아나필락시에 대한 실험을 하였다. 또 in vitro 실험으로 흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민의 유리에 미치는 연명초의 영향을 분석하였다.
제안 방법
- PCA 반응에 미치는 DAE의 효과를 검토하기 위하여 DNP- HSA와 evans blue의 혼합액을 투여하기 1시간 전에 UAE 를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 경구투여 하였다. Table Ⅳ에서와 같이 수동 피부 아나필락시 반응은 UAE 농도 의존적으로 억제되었으며, 특히 100mg/kg 및 1000 mg/ kg의 농도에서 유의성 있는 억제효과를 나타내었다.
- UAE 의 투여에 의해 전신성 아나필락시가 억제되므로 혈청 중 히스타민 양을 측정하여 DAE의 효과를 검토하였다. Table Ⅲ에서와 같이 LFAE에 의한 혈청중 히스타민의 유리는 compound 48/80에 의해 유도된 아나필락시 반응과 유사한 양상으로 억제되었으며, 특히 100mg/kg 및 1000mg/kg의 농도에서 유의성있는 억제 효과를 나타내었다.
- - 즉시형 과민반응에 대한 UAE의 효과를 검토하기 위하여 비면역학적 자극물질인 compound 48/80 을 사용하여 전신성 아나필락시를 유도하였다. Table Ⅰ에서와 같이 생리 식염수 200µl를 투여한 대조군은 100% 치사율을 나타내었다.
- 흰쥐의 복강 비만세포에 미치는 UAE의 효과를 검토하기 위하여 compound 48/80을 투여하기 10분전에 UAE를 0.001, 0.01, 0.1, 1 mg/ml의 농도로 처리하였다. Table V에서와 같이 UAE는 비만세포에서 compound 48/80에 의한 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였으며, 0.
- 즉 anti-DNP IgE 100 µg을 생쥐의 등에 피내주사하여 감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체 반응을 야기시켰다. anti- DNP IgE로 감작시킨 비만세포를 DNP-HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 IJAE를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 경구투여 하고 30분 후에 치사시켰다. Evans blue로 염색된 피부 부위를 잘라 1 M-KOH 1 ml를 가하고 인산과 아세톤 (5:13)의 혼액 9 ml를 가하여 색소를 추출한 후 Katayama 등18)의 방법에 따라 spectrophotometer로 620nm에서 색소량을 정량하였다.
- 실험하였다. 또 in vitro 실험으로 compound 48/80에 의해 유도되는 복강 비만세포로부터 히스타민 유리 조절과 cAMP에 미치는 효과를 실험하였다.
- 대한 실험을 하였다. 또 in vitro 실험으로 흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민의 유리에 미치는 연명초의 영향을 분석하였다. 세포 내 cAMP양을 측정함으로써 연명초가 compound 48/80 유도 비만세포로부터 히스타민의 유리를 억제하는 작용기전을 추측할 수 있으므로 cAMP의 양을 측정하여 작용기전을 검토하였다.
- 즉 비만세포의 탈과립제로 compound 48/80 8mg/kg을 생쥐의 복강 내에 주사하였으며, UAE를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 compound 48/80 주사 1시간 전에 경구 투여하였다. 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분, 10분, 20분 및 30분후에 각각 UAE 1000mg/kg을 경구 투여하였다. 치사율 실험은 아나필락시 쇽을 유발시킨 후 1시간 동안 관찰하였으며, 1시간 이내에 치사한 생쥐는 치사후 바로 심장에서 채혈하였으며, 1시간 동안 생존한 생쥐는 마취후 심장에서 채혈하고 혈청을 분리하여 히스타민을 정량하였다.
- 1% bovine serum albumin) 약 20 ml를 복강 내에 주입하고 복벽을 마사지하였다. 복벽 중앙선을 절개하고 pasteur pipette로 복강 세척액을 채취하여 원심분리 (150xg, 10분)하였다. 상징액을 제거한 후 비만세포 부유액을 Tyrode buffer B에 재부유시켰다.
- 또 in vitro 실험으로 흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민의 유리에 미치는 연명초의 영향을 분석하였다. 세포 내 cAMP양을 측정함으로써 연명초가 compound 48/80 유도 비만세포로부터 히스타민의 유리를 억제하는 작용기전을 추측할 수 있으므로 cAMP의 양을 측정하여 작용기전을 검토하였다.
- 9 ml를 취해 감압 건조시켰다. 이 건조 시료 중의 cAMP 함량은 cAMP 정량 kit를 사용하여 측정하였다.
- 추출하고 감압 농축한 다음 동결 건조하였다. 이 추출물을 사용 직전에 생리식염수 또는 Tyrode buffer A (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM KCI, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 0.1% bovine serum albumin)를 사용하여 일정 농도로 조제하였다.
- 방법에 따라 실험하였다. 즉 anti-DNP IgE 100 µg을 생쥐의 등에 피내주사하여 감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체 반응을 야기시켰다. anti- DNP IgE로 감작시킨 비만세포를 DNP-HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 IJAE를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 경구투여 하고 30분 후에 치사시켰다.
- 방법에 따라 실험하였다. 즉 비만세포의 탈과립제로 compound 48/80 8mg/kg을 생쥐의 복강 내에 주사하였으며, UAE를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 compound 48/80 주사 1시간 전에 경구 투여하였다. 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분, 10분, 20분 및 30분후에 각각 UAE 1000mg/kg을 경구 투여하였다.
- 의 방법에 따라 정량하였다. 즉 에펜돌프튜브에 시료 500µl를 취하여 0.1 M HCI 450µl와 60% 과염소산 용액 50µl를 혼합한 후 원심분리 (400xg, 20분)하였다. 그 상징 액 800 µl를 취해 5 M NaOH 용액 500 µl, 증류수 3 ml, n-butanol 10 ml 및 NaCl 1.
- 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분, 10분, 20분 및 30분후에 각각 UAE 1000mg/kg을 경구 투여하였다. 치사율 실험은 아나필락시 쇽을 유발시킨 후 1시간 동안 관찰하였으며, 1시간 이내에 치사한 생쥐는 치사후 바로 심장에서 채혈하였으며, 1시간 동안 생존한 생쥐는 마취후 심장에서 채혈하고 혈청을 분리하여 히스타민을 정량하였다.
대상 데이터
- - Compound 48/80, anti-dinitrophenyl (DNP) IgE, DNP-Human serum albumin (HSA), o- phthaldialdehyde 및 metrizamide는 Sigma사 제품을 사용하였다. α-minimal essential medium (a-MEM)은 Flow Laboratories에서 구입하였다.
- - SD계 흰쥐 및 ICR계 생쥐는 대한 바이오링크 (충북)에서 구입하여 실험에 사용할 때까지 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%로 유지되는 항온, 항습 사육실에서 사육하였다.
- - 본 실험에 사용된 연명초는 2000년 8월 전북 순창에서 채집하여 음건후 정제수로 수욕상에서 5 시간 추출하고 감압 농축한 다음 동결 건조하였다. 이 추출물을 사용 직전에 생리식염수 또는 Tyrode buffer A (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM KCI, 1.
- α-minimal essential medium (a-MEM)은 Flow Laboratories에서 구입하였다. cAMP kil는 Amersham사에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 시판시약 특급을 사용하였다. 기기는 spectrofluorometer (Shimadzu, RF-5301 PC), spectrophotometer (Shimadzu, UV-1201)를 사용하였다.
- 사용하였다. α-minimal essential medium (a-MEM)은 Flow Laboratories에서 구입하였다. cAMP kil는 Amersham사에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 시판시약 특급을 사용하였다.
- cAMP kil는 Amersham사에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 시판시약 특급을 사용하였다. 기기는 spectrofluorometer (Shimadzu, RF-5301 PC), spectrophotometer (Shimadzu, UV-1201)를 사용하였다.
데이터처리
- - 실험 결과는 meandSE로 표시하였으며 Student's f-test에 의해 유의성을 검정하여 p<0.05인 결과를 얻었을 때 유의성이 있는 것으로 하였다.
이론/모형
- - Kanemoto 등19)의 방법에 따라 분리하였다. 즉 흰쥐를 에테르로 마취시킨 후 Tyrode buffer B (137 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.
- Kawabata 등17)의 방법에 따라 실험하였다. 즉 anti-DNP IgE 100 µg을 생쥐의 등에 피내주사하여 감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체 반응을 야기시켰다.
- - Peachell 등22) 의 방법에 따라 실험하였다. 즉, Tyrode buffer A에 부유시킨 사람 비만세포 (5xl05 cells/ml) 에 Tyrode buffer A로 조제한 UAE (1mg/ ml)를 가하고 5% CO2 incubatorS.
- - 세포 배양액 및 혈청 중에 있는 히스타민은 Shore 등21)의 방법에 따라 정량하였다. 즉 에펜돌프튜브에 시료 500µl를 취하여 0.
- - 신 등16)의 방법에 따라 실험하였다. 즉 비만세포의 탈과립제로 compound 48/80 8mg/kg을 생쥐의 복강 내에 주사하였으며, UAE를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 compound 48/80 주사 1시간 전에 경구 투여하였다.
- anti- DNP IgE로 감작시킨 비만세포를 DNP-HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 IJAE를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 경구투여 하고 30분 후에 치사시켰다. Evans blue로 염색된 피부 부위를 잘라 1 M-KOH 1 ml를 가하고 인산과 아세톤 (5:13)의 혼액 9 ml를 가하여 색소를 추출한 후 Katayama 등18)의 방법에 따라 spectrophotometer로 620nm에서 색소량을 정량하였다.
- 상징액을 제거한 후 비만세포 부유액을 Tyrode buffer B에 재부유시켰다. 세포 부유액 중 비만세포는 Yurt 등20)의 방법으로 정제하였다. 즉 Tyrode buffer B 1ml에 재부유시킨 비만세포 부유액을 22.
성능/효과
- 1. UAE는 compound 48/80에 의해 유도된 전신성 아나필락시 및 anti-DNP IgE로 유도된 국소성 아나필락시를 농도 의존적으로 억제하였다.
- 2. UAE는 compound 48/80에 의한 흰쥐의 복강 비만세포로부터 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였다.
- 3. UAE는 비만세포의 cAMP의 양을 최고 3배까지 증가시켰다.
- Table Ⅲ에서와 같이 LFAE에 의한 혈청중 히스타민의 유리는 compound 48/80에 의해 유도된 아나필락시 반응과 유사한 양상으로 억제되었으며, 특히 100mg/kg 및 1000mg/kg의 농도에서 유의성있는 억제 효과를 나타내었다. 이는 UAE가 히스타민 등 화학적 매개물질의 유리를 억제한 결과로 사료된다.
- 그러나 compound 48/80을 투여하기 1시간 전에 UAE를 1, 10, 100, 1000mg/kg의 용량으로 투여한 후 치사율을 관찰한 결과 농도 의존적으로 치사율이 감소 하였다. 또 시간 의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분, 10분, 20분 및 30분 후에 UAE (1000mg/kg)를 투여한 결과 Table Ⅱ에서와 같이 치사율은 시간 의존적으로 증가하였다.
- 이러한 결과로 미루어 볼 때 UAE는 비만세포 매개 즉시형 알레르기 반응을 억제하며, UAE의 알레르기반응 억제 효과는 세포내 cAMP 함량의 증가에 의한 것으로 사료된다.
- 이상의 연구 결과에 의하면 연명초에는 비만세포 매개 즉시형 알레르기 반응을 억제하는 성분이 함유되어 있을 것으로 사료된다. 따라서 연명초 추출물 자체에 비해 강력한 효과를 나타내는 아나필락시 억제 물질의 규명이 필요하며 이 연구는 현재 진행중에 있다.
후속연구
- 사료된다. 따라서 연명초 추출물 자체에 비해 강력한 효과를 나타내는 아나필락시 억제 물질의 규명이 필요하며 이 연구는 현재 진행중에 있다.
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