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문제 정의
- 않고 sandwich ELISA만을 비교하였다. CP4 EPSPS 에 대한 각기 다른 항체를 서로 조합하여 sandwich ELISA 를 실시하는 경우, 각 조합의 검출감도를 비교함으로써 가장 좋은 sandwich ELISA 조건을 찾고자 하였다. 즉, 단클론항체 3종과 다클론항체를 microplate에 코팅하여 항원을 포획하는 데 이용하고 2차항체로 각 항체-HRP conjugate를 이용하여 sandwich ELISA를 실시한 결과를 Fig.
- 본 연구에서는 제초제 저항성 콩에 형질 전환된 CP4 EPSPS를 검출대상으로 제초제 저항성 콩 여부를 판단하기 위한 ELISA를 개발하고자 하였다. CP4 EPSPS> 면역원으로 하여 다클론항체 및 단클론항체를 생산하고 단클론항체의 일부 특성을 밝혔으며 신속, 정확하고, 효율적이며, 경제적으로 CP4 EPSPS를 검출할 수 있는 다클론항체와 단클론항체를 서로 조합한 샌드위치 효소면역측정법을 개발하였다.
제안 방법
- "Sandwich ELISA was performed as follows: each monoclonal or polyclonal antibody was coated onto microplate and serially diluted CP4 EPSPS were reacted for 1 hr at R.T. And each monoclonal antibody or polyclonal antibody-HRP conjugate was reacted. After 1 hr, the plate was washed with PBST, the substrate solution (H2O2/TMB) was added, developed for 30 min, and finally the absorbance in 450 nm was measured.
- 5~1 mL 주사하고 10일 후 생쥐 복강에 마리당 107 가량의 융합세포주를 각각 주입하였다. 2주 후 각 마리당 10mL 가량의 복수액을 채취하고 l, 500Xg에서 15 분간 원심분리하여 단클론항체를 생산하였다.
- ELISA를 개발하고자 하였다. CP4 EPSPS> 면역원으로 하여 다클론항체 및 단클론항체를 생산하고 단클론항체의 일부 특성을 밝혔으며 신속, 정확하고, 효율적이며, 경제적으로 CP4 EPSPS를 검출할 수 있는 다클론항체와 단클론항체를 서로 조합한 샌드위치 효소면역측정법을 개발하였다.
- CP4 유래 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(CP4 EPSPS)를 편러하고 경제적으로 검출하고자 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 개발하였다. CP4 EPSPS에 대해 특이적인 다클론 및 단클론항체를 생산하였다. 다클론힝체의 경우 sandwich ELIS A(검출한계, 0.
- 유전자재조합 콩의 Agrobacterium sp. CP4 유래 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(CP4 EPSPS)를 편러하고 경제적으로 검출하고자 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 개발하였다. CP4 EPSPS에 대해 특이적인 다클론 및 단클론항체를 생산하였다.
- 간략하면, CP4 EPSPS를 PBS에 1 mg/mL로 희석하고 Freund's complete adjuvant와 함께 1 : 1로 유탁액을 만들어 생후 7주 가량 된 생쥐에 lOOpL씩 복강주사를 2주 간격으로 3회 면역하고 최종적으로 adjuvant 없이 정맥주사 하였다. 정맥주사 2일 후에 비장을 적출하고 이를 잘게 부수어 단세포화 한 후 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하였다.
- coli Tumer™(DE3)pLacI(Novagen, Darmstadt, Germany) 를 제공 받아 이들의 생산 방법에 따라 생산하였다. 간략하면, 유전자 재조합 E. coli를 ampicillin 첨가 LB배지에서 배양한 후 최종 농도가 1 mM이 되게 isopropyl-D-thiogalactopyrano- side(IPTG)를 처리하고 3UC에서 6시간 발현을 유도하였다. 배양액에서 회수한 균체를 용해시키기 위하여 lysis buffer (5 mM EDTA와 0.
- 다클론항체의 경우 ciELISA보다는 sandwich ELISA의 감도가 뛰어났기 때문에 단클론항체의 경우에도 ciELISA는 수행하지 않고 sandwich ELISA만을 비교하였다. CP4 EPSPS 에 대한 각기 다른 항체를 서로 조합하여 sandwich ELISA 를 실시하는 경우, 각 조합의 검출감도를 비교함으로써 가장 좋은 sandwich ELISA 조건을 찾고자 하였다.
- 5, 70 mM NaCl)로 CP4 EPSPS® 용출하여 정제하였다. 분리 정제된 것을 SDS-PAGE를 통해서 확인하여 PBS로 투석하여 이를 -2CFC에 냉동 보관하면서 다음 실험에 사용하였다.
- 수세 완충액으로 3회 세척한 다음, 생산된 항체와 수세 완충액으로 단계별로 희석한 CP4 EPSPS를 1: 1로 혼합하여 각 well 당 100 gL 씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응시켰다’ 다시 수세 완충액으로 3회 세척한 다음 2차 항체로 anti-rabbit IgG-HRP conjugate를 수세 완충액으로 일정배수 희석하여 각 well 당 100皿씩 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 수세 완충액으로 3회 세척 한 후 기질용액(0.01% 3,3，,5,5，-tetramethyl-benzidine(TMB) in phosphate-citrate buffer, pH 5.0, 0.05% H2O2 사용직전에 준비)을 각각의 Well에 100|iL씩 넣고 30분간 방치한 뒤 2M H2SO4 반응정지액 50皿씩을 첨가한 후 파장 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 다클론항체 및 단클론항체의 항체가 측정시 비경합 간접 ELISA를 수행 하였는데, 위의 과정 중 2차 항체 처리할 때 경합을 하지 않았다.
- CP4 EPSPS를 코팅 완충액에 2卩g/mL로 희석하여 microplate well에 100|iL씩 분주한 다음 4。<2에서 하룻밤 정치하여 코팅하였다. 수세 완충액으로 3회 세척한 다음, 생산된 항체와 수세 완충액으로 단계별로 희석한 CP4 EPSPS를 1: 1로 혼합하여 각 well 당 100 gL 씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응시켰다’ 다시 수세 완충액으로 3회 세척한 다음 2차 항체로 anti-rabbit IgG-HRP conjugate를 수세 완충액으로 일정배수 희석하여 각 well 당 100皿씩 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 수세 완충액으로 3회 세척 한 후 기질용액(0.
- 융합세포의 생산은 Coyles의 방법을 변형하여 생산하였다. 간략하면, CP4 EPSPS를 PBS에 1 mg/mL로 희석하고 Freund's complete adjuvant와 함께 1 : 1로 유탁액을 만들어 생후 7주 가량 된 생쥐에 lOOpL씩 복강주사를 2주 간격으로 3회 면역하고 최종적으로 adjuvant 없이 정맥주사 하였다.
- 96 well plate에서 융합세포를 분리한 후 CP4 EPSPS에 대한 반응성이 양호한 융합세포의 상징액에서 비경합 간접 enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A) 법에 의해 CP4 EPSPS 에 반응성이 양호한 5개의 클론을 선발하였다. 이들 융합세포를 생후 6~8주된 생쥐의 복강에 pristane을 0.5~1 mL 주사하고 10일 후 생쥐 복강에 마리당 107 가량의 융합세포주를 각각 주입하였다. 2주 후 각 마리당 10mL 가량의 복수액을 채취하고 l, 500Xg에서 15 분간 원심분리하여 단클론항체를 생산하였다.
- 간략하면, CP4 EPSPS를 PBS에 1 mg/mL로 희석하고 Freund's complete adjuvant와 함께 1 : 1로 유탁액을 만들어 생후 7주 가량 된 생쥐에 lOOpL씩 복강주사를 2주 간격으로 3회 면역하고 최종적으로 adjuvant 없이 정맥주사 하였다. 정맥주사 2일 후에 비장을 적출하고 이를 잘게 부수어 단세포화 한 후 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하였다. 96 well plate에서 융합세포를 분리한 후 CP4 EPSPS에 대한 반응성이 양호한 융합세포의 상징액에서 비경합 간접 enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A) 법에 의해 CP4 EPSPS 에 반응성이 양호한 5개의 클론을 선발하였다.
- 정제한 단클론항체의 class를 조사하기 위해 isotyping을 실시하였다. Rat anti-mouse purified mAb(kit)를 코팅 완충액에 2jJig/mL로 희석한 다음 microplate의 각 well 당 50㎕ 씩 분주하여 냉장고에서 하룻밤 코팅하였다.
- CP4 EPSPS 에 대한 각기 다른 항체를 서로 조합하여 sandwich ELISA 를 실시하는 경우, 각 조합의 검출감도를 비교함으로써 가장 좋은 sandwich ELISA 조건을 찾고자 하였다. 즉, 단클론항체 3종과 다클론항체를 microplate에 코팅하여 항원을 포획하는 데 이용하고 2차항체로 각 항체-HRP conjugate를 이용하여 sandwich ELISA를 실시한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 각각의 그림으로부터 sandwich ELISA의 검출한계를 Table 1 에 표시하였다.
- 생산된 단클론항체 3종의 CP4 EPSPS에 대한 인식 부위는 Mabl과 Mab2는 서로 같은 부위를, Mab3는 다른 부위를 인식하는 것으로 나타났다. 한편, 다클론항체 및 단클론항체를 조합하여 실시한 sandwich ELISA의 검출 감도를 서로 비교하였다. 그 결과, 항원 포획단계에서 단클론항체 Mab2를 코팅하고 다클론항체-horseradish peroxidase(HRP) conjugate를 사용하였을 때 가장 양호한 검출감도(검출한계, 0.
- 면역 1주일 후에 토끼 귀 정맥에서 채혈한 후 항혈청을 분리하였다. 항혈청 중 2번 토끼의 3차 항혈청이 가장 높은 항체가를 나타내어 이를 ImL씩 분주하여 NaN3를 최종농도가 0.02%가 되게 첨가하여 -70°C에 보관하여 다음 실험에 사용하였다.
- 항혈청 중의 특이항체를 제조자의 방법에 따라 Protein A column을 이용하여 정제한 후 Sephadex G-25 column으로 탈염하였다. 정제된 항체를 pool한 후 NaN3< 최종농도가 0.
대상 데이터
- (A) Mabl, (B) Mab2, (C) Mab3, and (D) anti-CP4 EPSPS polyclonal antibody was coated. Sandwich ELISA was performed as follows: each monoclonal or polyclonal antibody was coated onto microplate and serial diluted CP4 EPSPS was reacted for 1 hr.
- 정맥주사 2일 후에 비장을 적출하고 이를 잘게 부수어 단세포화 한 후 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하였다. 96 well plate에서 융합세포를 분리한 후 CP4 EPSPS에 대한 반응성이 양호한 융합세포의 상징액에서 비경합 간접 enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A) 법에 의해 CP4 EPSPS 에 반응성이 양호한 5개의 클론을 선발하였다. 이들 융합세포를 생후 6~8주된 생쥐의 복강에 pristane을 0.
- Thimerosal(mercury[(carbosyphenyl) thio]ethyl sodium salt), NaIO4, anti-rabbit IgG-HRP conjugate, sodium m-periodate (NaIO4), 코팅 완충액으로 TRIZMA® PRE-SET CRYSTALS [tris(hydroxymethyl)-aninomethane, 0.05 M, pH 9.0], 수세 완중액으로 phosphate buffered saline with Tween 20(PBST: 0.01 M phosphate buffer, 0.138M NaCl, 0.0027M KC1, 0.05% Tween 20), 기질 완중액으로 phosphate-citrate buffer tablets(0.05 M phosphate-citrate buffer, pH 5.0, 1 tablet/100 mL), 3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine dihydrochloride(TMB), DEAE anion exchange resin, horseradish Peroxidase, goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate, goat anti-mouse polyvalent immunoglobulins(IgG, A, M)-HRP conjugate 등을 Sigma사 (St. Louis, MO, US A) 에서 구입하여 사용하였고, 항체 정제용 Protein A column(ImmunoPure plus IgG Purification Kit(#44679)), Avidin Biotin Complex(ABC; immunopure® ultra-sensitive ABC anti-rabbit mouse IgG staining kit)은 Pierce사(Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. 96 well plate 는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 것을 사용하였고, 흡광도 측정은 THERMOmax™(Molecular Devices사", Sunnyvale, CA, USA)을 사용하였다.
- 다시 수세 완충액으로 3회 세척하고 HRP-labelled rat anti-mouste Ig mAb를 각 well 당 100 此씩 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 수세 완충액으로 3회 세척한 후 기질 용액 (kit상의 시약 A, B를 혼합) 100씩을 넣고 3~10분간 발색시켰다. 2M H2SO4 50pL씩을 각 well에 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정하였다.
- 다클론항체 및 단클론항체의 항체가 측정시 비경합 간접 ELISA를 수행 하였는데, 위의 과정 중 2차 항체 처리할 때 경합을 하지 않았다. 즉, 다클론항체의 경우 goat anti-rabbit IgG-HRP를, 단클론항체의 경우 goat anti-mouse polyvalent immunoglobulins(IgG, A, M)-HRP conjugate * 사용하였다.
- 96 well plate 는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 것을 사용하였고, 흡광도 측정은 THERMOmax™(Molecular Devices사", Sunnyvale, CA, USA)을 사용하였다. 토끼(New Zealand White)와 생쥐 (BALB/cAnN)는 한림실험동물연구소(수원, 한국)로부터 구입하여 각각 다클론항체 및 단클론항체의 생산에 이용하였다.
이론/모형
- Bradford법에의해 단백질 정량을 하였고 시약은 상업적으로 생산되는 Bio-Rad사의 단백질정량 kit(Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질정량을 하였다.
- CP4 EPSPS의 생산은 Son 등(1,2)이 제조한 (CP4 EPSPS 유전자를 함유하는 pETBlue-1 AccepTor™) 벡터가 들어있는 E. coli Tumer™(DE3)pLacI(Novagen, Darmstadt, Germany) 를 제공 받아 이들의 생산 방법에 따라 생산하였다. 간략하면, 유전자 재조합 E.
- 다클론항체의 검출한계를 확인하기 위해 경합간접 효소면 역측정법 (competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay, ciELISA)를 수행하였다. CP4 EPSPS를 코팅 완충액에 2卩g/mL로 희석하여 microplate well에 100|iL씩 분주한 다음 4。<2에서 하룻밤 정치하여 코팅하였다.
성능/효과
- 1에 나타내었다. 2차 column 통과 후 분자량 5만 가량의 단백질 밴드가 보였고 다른 불순물이 많이 없이 약 90% 이상의 정제도를 확인하였다. 이들 분 획분을 모아 PBS에 대해 투석한 후 다음 실험에 사용하였다.
- 3개의 단클론항체가 CP4 EPSPS에 특이성이 높은 항체가를 나타내었다(Mabl〜 Mab3). 단클론항체의 isotyping은 mouse Mab isotyping kit(Pierce사, Rockford, IL, USA)를 사용하였다.
- 단클론항체의 isotyping은 mouse Mab isotyping kit(Pierce사, Rockford, IL, USA)를 사용하였다. 3종류 모두 heavy chain은 IgGj type이었으며, light chain은 k type으로 확인되었다. 각각의 항체와 각각의 항체 -HRP conjugate를 경합하여 ciELISA를 수행했을 때의 결과를 Fig.
- 3에 나타내었다. Mabl, Mab2, Mab3 모두 단 클론 항체 자신끼리는 서로 잘 경합하는 것으로 나타났으며 Mabl 과 Mab3를 서로 경합하였을 때 단클론항체의 농도가 높아짐에 따라 경합을 보이고 있다(Fig. 3(A), (B)).
- 각각의 그림으로부터 sandwich ELISA의 검출한계를 Table 1 에 표시하였다. 각각의 검출한계가 각 조합마다 약간의 차이가 있었지만 그들 중에서 다클론항체를 코팅하고 2차 항체로 Mab2-HRP를 이용한 것과 Mab2항체를 코팅하고 2차 항체를 다클론항체-HRP로 사용한 것의 검출감도가 가장 양호하게 나타나 CP4 EPSPS의 검출이 0.02 |ig/mL 이상에서 가능한 것으로 나타났다. 이는 앞서 보여준 다클론항체를 이용한 sandwich ELISA의 검출감도보다 약간 좋은 것으로 나타났다.
- 한편, 다클론항체 및 단클론항체를 조합하여 실시한 sandwich ELISA의 검출 감도를 서로 비교하였다. 그 결과, 항원 포획단계에서 단클론항체 Mab2를 코팅하고 다클론항체-horseradish peroxidase(HRP) conjugate를 사용하였을 때 가장 양호한 검출감도(검출한계, 0.02pg/mL)를 나타내었다. 본 연구에서 개발한 sandwich ELISA는 제초제 저항성 유전자재조합 콩의 분석에 적용가능 것으로 생각된다.
- 5에 나타내었다. 두 가지 조합 중 단클론항체 Mab 2를 코팅하고 다클론항체-HRP를 이용하여 수행한 sandwich ELISA가 다클론항체를 코팅하고 단클론항체 Mab 2-HRP를 이용하여 수행한 sandwich ELISA보다 약간 검출 감도가 좋은 것으로 나타났다. Rogan 등3)이 CP4 EPSPS 검출을 위해 biotin-avidin system을 이용하여 sandwich ELISA를 개발하였는데, 실제 이번 연구에서 biotin-avidin system을 이용하여 검출한계를 측정한 결과 흡광도는 증가하나 검출 감도는 그다지 개선되지 않았다(자료생략).
- 03/ig/mL)는 com petitive indirect ELISA(1 典/mL)보다 CP4 EPSPS의 검출 감도가 낮았다. 생산된 단클론항체 3종의 CP4 EPSPS에 대한 인식 부위는 Mabl과 Mab2는 서로 같은 부위를, Mab3는 다른 부위를 인식하는 것으로 나타났다. 한편, 다클론항체 및 단클론항체를 조합하여 실시한 sandwich ELISA의 검출 감도를 서로 비교하였다.
- 당시 유전자재조합농산물의 재배면적은 120만 ha였는데, 1998년에는 2, 780만 ha, 1999년에는 3, 990만 ha로 급격히 늘어났다. 현재까지 미국에서 시판이 허용된 유전자재조합농산물은 옥수수, 콩, 토마토, 감자 등 39개 품목으로 주요 작물별, 특성별 재배면적을 보면, 제초제저항성 콩이 54%로 가장 많고, 해충저항성 옥수수 19%, 제초제저항성 카놀라 9%, 해충저항성 및 제초제저항성 옥수수 5%, 제초제저항성 면화 4%, 제초제저항성 옥수수 4%, 해충저항성 면화 3%, 해충저항성 및 제초제저항성 면화 2%의 순이다.
후속연구
- 02pg/mL)를 나타내었다. 본 연구에서 개발한 sandwich ELISA는 제초제 저항성 유전자재조합 콩의 분석에 적용가능 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 확립한 단클론항체 Mab2를 항원 포획 단계로 이용하고 CP4 EPSPS 특이 다클론항체-HRP를 이용한 sandwich ELISA를 수행 한다면 CP4 EPSPS의 농도 0.02㎍/ mL 이상에서 검출이 가능하므로, 앞으로 제초제 저항성 콩과 같은 CP4 EPSPS의 유전자가 조합된 농산물이나 그 가공품에서 CP4 EPSPS 검출에 활용할 수 있을 것으로 생각한다.
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