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문제 정의
- 본 연구에서는 QuEChERS AOAC Official 2007.01법(Lehotay 등, 2007)을 개선하여 사과, 포도, 배, 단감 4가지 과일을 대상으로 HPLC-UVD, GC-ECD 및 GC-NPD 을 이용하기 위한 QuEChERS 분석법을 개발하고자 하였으며 그 결과를 QuEChERS AOAC Official 2007.01 법을 적용하여 LC-MS/MS로 분석한 결과와 비교하였다.
- 현재 기존의 QuEChERS법과 수정된 QuEChERS법으로 HPLC-UVD나 GC-ECD/NPD를 이용한 잔류농약분석연구는 미흡한 단계이므로, 따라서 본 연구에서는 injection이전에 유기용매의 치환과 농축과정, 정제과정을 추가하여 HPLCUVD나 GC-ECD/NPD로 잔류농약분석 할 수 있는 방안을 강구하고자 하였다. GC-ECD/NPD에서는 acetonitrile 보다는 acetone이 더 적합한 용매이므로 유기용매 치환과정과 ECD, NPD, UVD에서 낮은 검출한계를 가질 수 있도록 농축과 정제과정을 추가시켰다.
가설 설정
- b) ND : not determined.
제안 방법
- 현재 기존의 QuEChERS법과 수정된 QuEChERS법으로 HPLC-UVD나 GC-ECD/NPD를 이용한 잔류농약분석연구는 미흡한 단계이므로, 따라서 본 연구에서는 injection이전에 유기용매의 치환과 농축과정, 정제과정을 추가하여 HPLCUVD나 GC-ECD/NPD로 잔류농약분석 할 수 있는 방안을 강구하고자 하였다. GC-ECD/NPD에서는 acetonitrile 보다는 acetone이 더 적합한 용매이므로 유기용매 치환과정과 ECD, NPD, UVD에서 낮은 검출한계를 가질 수 있도록 농축과 정제과정을 추가시켰다. 개선된 QuEChERS법을 이용한 회수율 실험의 각 작물별 크로마토그램은 Fig.
- 2와 3과 같았다. GC를 이용하여 분석한 농약에 대해서는 matrix matched standard를 이용하여 표준 검량선을 작성하고 정량분석하였다.
- 따라서 정확한 정량분석을 위해 retention time이 미세하게 차이나거나 겹치는 성분을 회피하고자 4개의 농약혼합그룹을 분류하였다. LC 그룹은 각 농약의 표준 용액을 10 mg/L 농도로 조제 한 후 200~400 nm 파장에서 자외선흡광스펙트럼을 조사하였으며, 그 결과를 바탕으로 각 그룹별 분석파장을 225 및 254 nm로 선정하였다.
- LC/MS/MS로 총 61종의 농약들을 한 그룹으로 분석하였으며, HPLC 및 GC 분석을 위해서는 retention time, 농약의 물리화학적 특성 및 검출기에 대한 반응성에 따라 LC그룹(225, 254 nm)와 GC그룹(ECD, NPD)의 4개 그룹으로 분류하여 분석하였다(Table 1). 분석그룹을 세분화한 이유는 농산물 시료 중에 미지의 분석대상 성분을 정성 분석할 경우 retention time의 차이로 분석하는 것이 가능하나 정량분석을 할 경우 retention time이 서로 겹치는 성분들을 동일한 혼합액으로 조제하면 간섭에 의해 정량분석이 매우 어려워지기 때문이다.
- 각 농약의 물리화학적 특성 및 검출능을 비교한 후 검출기별로 분류하여 분석 그룹을 만들었다. 각 농약을 그룹별로 혼합한 후, acetone과 acetonitrile로 희석하여 10 mg/L의 혼합 표준품 용액을 제조하였다.
- 단, carbendazim의 경우 용매에 대한 용해도가 낮아 methanol을 이용하여 200 mg/L의 stock solution을 제조하였다. 각 농약의 물리화학적 특성 및 검출능을 비교한 후 검출기별로 분류하여 분석 그룹을 만들었다. 각 농약을 그룹별로 혼합한 후, acetone과 acetonitrile로 희석하여 10 mg/L의 혼합 표준품 용액을 제조하였다.
- 건고물을 다시 1.5 mL의 acetonitrile 또는 acetone으로 재용해한 후 50 mg PSA, 50 mg C18, 150 mg MgSO4이 담긴 E-tube에 옮겨 2분간 강하게 흔들어 준 후 원심분리(12,000 rpm, 5 min)하여 상등액을 HPLC 또는 GC를 이용하여 분석하였다.
- 2003년 Anastassiades에 의해 처음 소개된 QuEChERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)분석법은 고체상의 분말을 시료에 직접 주입하여 원심분리를 통해 농약성분을 추출해내는 방법이다(Anastassiades 등, 2003). 고체상의 분말인 NaCl과 MgSO4를 사용하여 극성의 불순물이 용매층에 전이되는 것을 최소화하고 극성 농약들은 용매층에 잘 전이될 수 있도록 하였으며 정제를 위해 카트리지 대신 C18, PSA, GCB를 흡착제로 사용하였다. 현재는 염기성 조건에서는 불안정한 농약들의 분해를 피하고자 acetate와 citrate buffer를 사용하는 개선된 방법이 제시되어 있다(Lehotay 등, 2010).
- 1 mg/kg이 되도록 처리하였다. 단, dichlorvos, fenthion, methidathion, phenthoate, pirimiphos-M, prothiofos, pyridaphenthion은 NPD 검출기에 대한 감도가 좋아 상대적으로 낮은 LOD값을 가져 0.01 mg/kg 수준으로 처리하였다. 처리된 시료는 QuEChERS(Fig.
- 분석그룹을 세분화한 이유는 농산물 시료 중에 미지의 분석대상 성분을 정성 분석할 경우 retention time의 차이로 분석하는 것이 가능하나 정량분석을 할 경우 retention time이 서로 겹치는 성분들을 동일한 혼합액으로 조제하면 간섭에 의해 정량분석이 매우 어려워지기 때문이다. 따라서 정확한 정량분석을 위해 retention time이 미세하게 차이나거나 겹치는 성분을 회피하고자 4개의 농약혼합그룹을 분류하였다. LC 그룹은 각 농약의 표준 용액을 10 mg/L 농도로 조제 한 후 200~400 nm 파장에서 자외선흡광스펙트럼을 조사하였으며, 그 결과를 바탕으로 각 그룹별 분석파장을 225 및 254 nm로 선정하였다.
- 분석용 시료 상징액 0.5 mL을 취하여 50 µL의 5 mg/L triphenylphosphate, formic acid가 0.1% 포함된 3차 증류수 1 mL 및 acetonitrile 50 µL를 함께 섞은 후 0.2 µm PTFE syringe filter(Pall Corporation, Ann Arbor, USA)로 여과한 후 기기분석조건에 따라 LC/MS/MS를 이용하여 분석하였으며, 분석법의 모식도는 Fig. 1과 같다.
- 사과, 포도, 배, 단감 4가지 시료에 10 mg/L 혼합표준용액 group I~IV을 각각 150 µL씩 첨가하여 0.1 mg/kg이 되도록 처리하였다.
- 사과, 포도, 배, 단감 4가지 시료에 10 mg/L의 61종 농약혼합표준용액을 150 µL씩 첨가하여 0.1 mg/kg이 되도록 처리하였다.
- 사과, 포도, 배, 단감 4가지 시료에 61종 농약 혼합표준용액을 0.1 mg/kg이 되도록 처리한 후 QuEChERS AOAC Official 2007.01 분석방법으로 추출하여 4반복으로 회수율 실험을 수행하였으며 그 결과는 Table 4와 같았다.
- 사과, 포도, 배, 단감 총 4가지 시료를 각각 15 g을 50 mL Falcon® tube에 칭량한 후 acetic acid가 1% 포함된 acetonitrile용액을 15 mL 첨가하고 진탕기(엔바이오텍, NB-101MTH, Korea)를 사용하여 250 rpm에서 30분간 진탕하여 추출하였다.
- 시료추출은 AOAC 방법과 동일하였으며, 최종 원심분리 후 상등액을 8 mL을 취하여 다음 단계로 진행하였다.
-
농약표준용액 및 시약
시험 농약은 농약사용지침서(한국작물보호협회, 2011)와 식품의 농약 잔류허용기준(식품의약품안전청, 2011)을 참고하여 과일에 등록되어 자주 사용되고 잔류허용기준(Maximum residue limits, MRL)이 설정되어 있는 농약 중 2010년 잔류 모니터링 결과를 통해 적발건수가 높은 농약을 조사하여 선발하였다. 분석대상 농약은 다성분 동시분석이 가능한 살균제 28종, 살비제 7종, 살충제 24종, 제초제 1종, 생장조절제 1종 총 61종이었다.
- 데이터 처리는 Mass Hunter Workstation data acquisition프로그램을 사용하였으며, 기기분석조건은 Table 2와 3과 같았다. 정량분석은 무처리 추출물에 녹여진 혼합표준용액(matrix matched standard)을 가지고 작성한 표준 검량선을 이용하여 계산하였다.
대상 데이터
- Fomic acid(> 98% purity)와 ammonium acetate(99% purity)는 Sigma Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하였으며, glacial acetic acid(100%)는 Merck사(Merck KGaA, Germany)에서 구입하였다.
- 3차 증류수제조장치는 Millipore사의 Milli-Q system(Bedford, USA)을 사용하였다. QuEChERS 전처리를 위한 시약 및 제품은 Restek(Bellefonte, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료추출은 Restek Q 150(6 g anhydrous MgSO4, 1.
- 본 실험에는 사과, 포도, 배 그리고 단감 등 4종류의 과일을 대상으로 하였으며, 준비된 시료의 전처리는 씨, 받침, 꼭지, 심 및 양쪽 오목한 부분을 제거한 후 2 cm 정도로 세절하고 mix homogenizer(Artlon Gold Mix DA338-G, Korea)를 이용하여 갈아 분석 때까지 -20℃에서 냉동보관 하였다.
- 분석에 사용된 HPLC는 photodiode array(PDA) 검출기가 장착된 ACQuity ultra performance LC(Waters, USA)이며 225 nm와 254 nm의 파장에서 분석하였으며, 사용된 GC는 µECD와 NPD가 장착된 Agilent Technologies 7890A(Agilent, USA)사용하였다.
- 분석에 사용된 LC/MS/MS는 Agilent Technologies(Palo Alto, USA) model 1200 series HPLC이고 MS/MS는 Agilent 6410 triple-quadrupole mass spectrometer였다. 이동상은 10 mM NH4OAc와 0.
- 분석에 사용된 용매인 acetonitrile과 acetone은 Merck사(Merck KGaA, Germany)의 HPLC grade로 구입하였다. Fomic acid(> 98% purity)와 ammonium acetate(99% purity)는 Sigma Aldrich(St.
- 분석대상 농약은 다성분 동시분석이 가능한 살균제 28종, 살비제 7종, 살충제 24종, 제초제 1종, 생장조절제 1종 총 61종이었다. 분석에 사용한 표준품은 Dr. Ehrenstorfer GmbH(Ausberg, Germany)에서 구입하였으며 각각의 농약은 acetone과 acetonitrile을 이용하여 1,000 mg/L의 stock solution을 제조하였다. 단, carbendazim의 경우 용매에 대한 용해도가 낮아 methanol을 이용하여 200 mg/L의 stock solution을 제조하였다.
- QuEChERS 전처리를 위한 시약 및 제품은 Restek(Bellefonte, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료추출은 Restek Q 150(6 g anhydrous MgSO4, 1.5 g anhydrous NaOAc)을 사용하였으며 분산고상 추출은 Restek Q 251(50 mg Primary secandary amine(PSA), 50 mg C18, 150 mg MgSO4)과 Restek Q 351(400 mg PSA, 400 mg C18, 1,200 mg MgSO4)을 사용하였다.
- 1과 같다. 시험에 사용된 triphenylphosphate(TPP)는 기기의 검출능력 검증을 위해 내부표준물질로 사용하였으며 정량에는 이용하지 않았다.
데이터처리
- 5 ms이였다. 데이터 처리는 Mass Hunter Workstation data acquisition프로그램을 사용하였으며, 기기분석조건은 Table 2와 3과 같았다. 정량분석은 무처리 추출물에 녹여진 혼합표준용액(matrix matched standard)을 가지고 작성한 표준 검량선을 이용하여 계산하였다.
- 01 mg/kg 수준으로 처리하였다. 처리된 시료는 QuEChERS(Fig. 2)의 분석방법으로 추출하여 4반복으로 회수율 실험을 실시하였다.
이론/모형
- 1 mg/kg이 되도록 처리하였다. 처리된 시료는 QuEChERS(Fig. 1)의 분석방법으로 추출하여 4반복으로 회수율 실험을 수행하였다.
성능/효과
- 그리고 LC-MS/MS 분석에서 matrix match standard를 이용함에 따라 일부농약은 분석시료별 정량한계값(limit of quantitation, LOQ)이 큰 차이가 있었다. Fenazaquin은 사과(1.22 ng/g)와 배(18.17 ng/g)에서는 낮은 LOQ를 나타내었지만 포도(59.62 ng/g)와 감(69.93 ng/g)에서는 비교적 높은 LOQ를 가져 일부농약의 경우 matrix의 종류에 따라 잔류농약 분석에 영향을 받을 수 있음을 알 수 있었다.
- HPLC-UVD(225 nm)로 분석한 teflubenzuron과 GC-NPD 로 분석한 cyproconazole은 포도 시료에서는 회수율이 나타나지 않았으며, dichlorvos는 오직 감 시료에서만 회수율이 낮아 시료의 matrix 종류에 따라 회수율이 영향을 받고 있음을 알 수 있었다. HPLC-UVD(254 nm)로 분석한 forchlorfenuron은 모든 과일 시료에서 회수율이 낮고 RSD가 높은 경향을 나타내었으며, 이는 농축과정에서 소실되거나 추가정제과정에서 사용되는 흡착제에 의해 흡착에 의한 결과로 추정되었다.
- HPLC-UVD(225 nm)로 분석한 teflubenzuron과 GC-NPD 로 분석한 cyproconazole은 포도 시료에서는 회수율이 나타나지 않았으며, dichlorvos는 오직 감 시료에서만 회수율이 낮아 시료의 matrix 종류에 따라 회수율이 영향을 받고 있음을 알 수 있었다. HPLC-UVD(254 nm)로 분석한 forchlorfenuron은 모든 과일 시료에서 회수율이 낮고 RSD가 높은 경향을 나타내었으며, 이는 농축과정에서 소실되거나 추가정제과정에서 사용되는 흡착제에 의해 흡착에 의한 결과로 추정되었다. 작물별 회수율은 각각 사과 70.
- 개선된 QuEChERS법으로 회수율 실험을 하였을 때 61종의 농약 중 90%이상의 농약이 70~120%의 회수율을 만족하였다. QuEChERS Official AOAC 2007.01법으로 실험한 농약 중 bifenazate와 etoxazole은 LC-MS 분석기에서 회수율이 낮거나 분석이 불가능하였지만 개선된 QuEChERS법을 이용하여 UVD와 NPD검출기로 분석한 결과에서는 회수율이 우수하였다. 또한 organophosphate계에 속하는 농약들은 NPD검출기에서 매우 높은 감도를 나타내어 MS/MS를 사용하지 않아도 낮은 검출한계를 가질 수 있었다.
- 하지만 forchlorfenuron 농약은 개선된 QuEChERS 방법에서 매우 낮은 회수율을 나타내었으며, 이는 개선된 전처리과정 중 acetonitrile 용매를 농축해야 하는 과정을 수행하면서 농약이 소실되거나 두 번째 분산고상추출과정에서 농약이 흡착제에 흡착되어 소실된 것으로 예상되었다. 개선된 QuEChERS법 이용할 경우 일부를 제외한 대부분의 농약이 HPLC 및 GC 분석에서 좋은 회수율을 보였다. Furlani (2011)는 사탕수수 음료를 분석시료로 하여 7종의 농약을 대상으로 QuEChERS 전처리 후 GC-ECD로 분석한 결과 62.
- 개선된 QuEChERS법으로 회수율 실험을 하였을 때 61종의 농약 중 90%이상의 농약이 70~120%의 회수율을 만족하였다. QuEChERS Official AOAC 2007.
- 분석대상 농약 중 etoxazole, bifenazate, spiromesifen 등 3 농약은 본 실험의 LC-MS/MS 분석조건에서 회수율이 낮거나 분석이 불가능하였다. 그리고 LC-MS/MS 분석에서 matrix match standard를 이용함에 따라 일부농약은 분석시료별 정량한계값(limit of quantitation, LOQ)이 큰 차이가 있었다. Fenazaquin은 사과(1.
- 네 가지 과일시료에서 0.1 mg/kg수준의 평균 회수율은 전체 대상 농약 수의 90%에 해당하는 농약들이 70~130%의 회수율을 만족하였다. 작물별 회수율은 사과에서는 71.
- 01법으로 실험한 농약 중 bifenazate와 etoxazole은 LC-MS 분석기에서 회수율이 낮거나 분석이 불가능하였지만 개선된 QuEChERS법을 이용하여 UVD와 NPD검출기로 분석한 결과에서는 회수율이 우수하였다. 또한 organophosphate계에 속하는 농약들은 NPD검출기에서 매우 높은 감도를 나타내어 MS/MS를 사용하지 않아도 낮은 검출한계를 가질 수 있었다. 하지만 forchlorfenuron 농약은 개선된 QuEChERS 방법에서 매우 낮은 회수율을 나타내었으며, 이는 개선된 전처리과정 중 acetonitrile 용매를 농축해야 하는 과정을 수행하면서 농약이 소실되거나 두 번째 분산고상추출과정에서 농약이 흡착제에 흡착되어 소실된 것으로 예상되었다.
- 시험 농약은 농약사용지침서(한국작물보호협회, 2011)와 식품의 농약 잔류허용기준(식품의약품안전청, 2011)을 참고하여 과일에 등록되어 자주 사용되고 잔류허용기준(Maximum residue limits, MRL)이 설정되어 있는 농약 중 2010년 잔류 모니터링 결과를 통해 적발건수가 높은 농약을 조사하여 선발하였다. 분석대상 농약은 다성분 동시분석이 가능한 살균제 28종, 살비제 7종, 살충제 24종, 제초제 1종, 생장조절제 1종 총 61종이었다. 분석에 사용한 표준품은 Dr.
- HPLC-UVD(254 nm)로 분석한 forchlorfenuron은 모든 과일 시료에서 회수율이 낮고 RSD가 높은 경향을 나타내었으며, 이는 농축과정에서 소실되거나 추가정제과정에서 사용되는 흡착제에 의해 흡착에 의한 결과로 추정되었다. 작물별 회수율은 각각 사과 70.9~112.9%, 포도 71.3~101, 배 71.3~126%, 감 76.4~122.5%수준이었으며, 이는 분석효율에 중심으로 잔류농약 검색용 목적을 둔 다성분 분석법의 회수율 기준인 70~130%이내 조건을 만족하였다(Table 5).
- 1 mg/kg수준의 평균 회수율은 전체 대상 농약 수의 90%에 해당하는 농약들이 70~130%의 회수율을 만족하였다. 작물별 회수율은 사과에서는 71.1~104%이고 포도에서는 75.7~132.2%이고 배에서는 84.8~108.7%이고, 감에서는 78.3~127.4%로 분석효율에 중점을 두어 개발되고 잔류농약 검색용 목적을 둔 다성분 분석의 기준인 70~130%이내를 만족하였다.
- 또한 organophosphate계에 속하는 농약들은 NPD검출기에서 매우 높은 감도를 나타내어 MS/MS를 사용하지 않아도 낮은 검출한계를 가질 수 있었다. 하지만 forchlorfenuron 농약은 개선된 QuEChERS 방법에서 매우 낮은 회수율을 나타내었으며, 이는 개선된 전처리과정 중 acetonitrile 용매를 농축해야 하는 과정을 수행하면서 농약이 소실되거나 두 번째 분산고상추출과정에서 농약이 흡착제에 흡착되어 소실된 것으로 예상되었다. 개선된 QuEChERS법 이용할 경우 일부를 제외한 대부분의 농약이 HPLC 및 GC 분석에서 좋은 회수율을 보였다.
후속연구
- 5%의 회수율과 좋은 검출한계값(limits of detection, LOD)을 나타었다고 보고하였다. 따라서 기존의 QuEChERS 전처리법을 개선하면 GC-ECD/NPD 및 HPLCUVD와 같이 현재 분석기관에서 많이 보급된 분석 장비로 잔류농약 다성분 동시분석에 응용이 가능할 것으로 판단되었다.
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