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문제 정의
- 본 연구는 토양 중에 검출이 많이 되거나 농산물 중 부적합빈도가 높게 나오는 124종의 농약을 선정하여 이들 농약을 대상으로 토양 중 잔류하는 농약을 다성분 동시분석하기 위한 QuEChERS 추출정제법 및 LC-MS/MS를 이용한 분석법을 개발하고자 수행하였다.
- 토양 종류에 따른 Matrix effect가 나타나는지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. 후)토양 입자로">토양입자로 추출용매의 접근성을 높이고 토양의 수분함량을 균일화시키기 위해 사용되는 수용액과 토양 중 잔류농약을 추출하기 위한 최적의 용매를 선정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 15 g으로 칭량된 Soil 2 토양시료에 90성분의 농약을 0.
제안 방법
- 2 µm PTFE 필터로 여과하여 LC-MS/MS로 분석하였다. Matrix effect를 고려하기 위해서 희석한 농약 표준용액을 공시료의 상징액과 1/1 (v/v)로 희석하여 분석하였다.
- Soil 1와 Soil2의 2가지 시료 각각 15 g을 50 mL centrifuge tube에 칭량한 후 acetonitrile에 용해되어있는 혼합농약 표준용액을 첨가하여 5, 10, 20, 100 ng/g의 첨가농도가 되도록 하여 회수율 실험을 실시하였다. 회수율 실험은 농약이 토양에 충분히 결합될 수 있도록 24시간 뒤 실시하였다.
- 29%로 조금 낮게 회수되었으며 나머지 89성분은 70~120% 범위의 회수율을 나타내었다. 따라서 토양 중 잔류농약분석을 위한 QuEChERS 전처리 방법은 NH4Cl 용액 침지 후 1% acetic acid 포함 acetonitrile 용매로 추출 후 MgSO4 및 NaOAc로 salting out 하고 PSA 50 mg, C18 50 mg, MgSO4 150 mg 이용해 정제하는 방법으로 정하였다. 이 QuEChERS 분석법의 검증을 위해 124성분의 농약에 대한 토성이 다른 두 토양을 대상으로 0.
- 후)무처리 구">무처리구 토양시료 추출용액과 표준용액을 1/1 (v/v)로 희석하여 100 ng/L의 matrix matched 표준용액(MMS)을 같은 농도수준으로 희석된 혼합 표준용액을 LC-MS/MS로 5반복 2회 분석하여 Matrix Effect (ME(%))를 조사하였다.
- 본 실험에서도 다양한 종류의 농약을 동시분석하기 위한 QuEChERS 추출과정에서 수용액과 추출유기용매에 따른 추출효율을 알아보고자 Soil2 시료에 90여 성분의 농약을 0.1 mg/kg 되도록 처리한 후 각각 증류수, 0.2 N NH4Cl 용액, 0.2 N KCl 용액을 첨가한 후 0.1% acetic acid 포함 acetonitrl, acetone, ethyl acetate 유기용매를 추출용매로 사용하여 QuEChERS 추출법의 효율 실험을 실시하였다.
- 상징액 500 µl를 채취한 후 200 µl 0.1% formic acid 함유 acetonitrile, 50 µl 내부표준물질(triphenylphosphate, TPP), 50 µl acetonitrile을 첨가한 후 이 용액을 0.2 µm PTFE 필터로 여과하여 기기분석조건에 따라 분석하였다.
- 상징액을 일정량 농축하고 acetonitrile로 재용해한 후 0.2 µm PTFE 필터로 여과하여 LC-MS/MS로 분석하였다.
- 후)시료 상">시료상 존재하는 물질에 의해 잔류농약 추출에 영향을 받을 것을 고려하여 2, 5, 10, 20, 100, 200 ng/g 수준으로 stock solution을 무처리 추출용매로 희석하여 matrix matched 표준용액을 만들었다.
- 후)정제하는">정제하는 방법으로 정하였다. 이 QuEChERS 분석법의 검증을 위해 124성분의 농약에 대한 토성이 다른 두 토양을 대상으로 0.005, 0.01, 0.02, 0.1 mg/kg 4농도 수준에서 회수율 실험을 실시하였다.
- 후)이동상은">이 동상은 0.1% formic acid를 포함한 10 mM ammonium acetate buffer 용액과 0.1% formic acid를 포함한 acetonitrile 용액을 사용하여 positive mode에서 분석하였다. LC-MS/MS의 이온화 장치에서 MRM조건을 설정하여 분석의 선택성을 후)추출 효율이">추출효율이 높았다고 보고하였다. 이들 실험을 살펴보면 추출용매의 추출효율을 높이고 토양의 수분함량을 균일화시키기 위해서 증류수나 NH4Cl 수용액을 첨가한 후 추출용매로 진탕 추출하는 방법을 주로 사용하였다.
- 후)실온암조건">실온 암조건 하에 24시간 방치하였다. 준비된 시료에 각각 15 mL의 증류수, 0.2 N NH4Cl 용액, 0.2 N KCl 용액을 각각 첨가한 후 토양이 충분히 침지되도록 30분을 방치하였다. 침지된 토양에 용매별 후)넣은 후">넣은 후 뚜껑을 닫고 염이 뭉치지 않도록 즉시 손으로 2분간 흔들어준 후 원심분리(3500 rpm, 5 min)하고 상징액 1 mL을 취하였다. 채취한 상징액을 50 mg C18, 50 mg PSA, 150 mg MgSO4가 들어있는 2 mL 폴리프로필렌 원심분리관에 넣어준 후 30초간 vortex 후 다시 원심분리 (12000 rpm, 5 min)하였다. 상징액 500 µl를 채취한 후 200 µl 0.
- 후)첨가한 후">첨가한 후 토양이 충분히 침지되도록 30분을 방치하였다. 침지된 토양에 용매별 추출효율을 확인하기 위해 각각 15 mL의 1% acetic acid 포함 acetonitrile, acetone, ethyl acetate을 넣어주어 30분 진탕해주었다. 진탕 후 6 g MgSO4과 1.
- 후)혼합표준용액을">혼합 표준용액을 무처리구 토양시료 추출용액에 처리하여 0.1 mg/L의 matrix matched 표준용액과 acetonitrile용액으로 희석된 표준용액을 5반복으로 분석하여 matrix matched 표준용액과 대조 표준용액의 면적비를 비교하여 Matrix Effect 를 조사하였다. Niessen 혼합표준곡선의 직선성을 조사하기 위해 0.5-100 µg/L 사이 농도의 표준혼합용액을 이용하여 혼합표준곡선을 작성하였다.
대상 데이터
- Formic acid (> 98% purity)와 ammonium acetate (99% purity)는 Sigma Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였으며 glacial acetic acid (100%)는 Merck사(Merck KGaA, Germany)에서 구입하였다.
- 3차 증류수는 Millipore사의 Milli-Q system (Bedford, USA)을 사용하였다. QuEChERS 전처리를 위한 시약 및 제품은 Agilent (California, USA)에서 구입하여 사용하였다. 추출 및 정제에 사용된 시약은 Agilent QuEChERS Extract Kit AOAC 2007.
- 후)나올 수">나올수 있다. 따라서 본 실험은 토성이 다른 두 종류의 토양을 채집하여 사용하였다. Soil 1은 논에서 채집한 시료로 본 연구에 사용된 토양은 전라북도 부안군 계화면에서 채취한 논토양(Soil 1)과 경기도 수원시 국립농업과학원 시험 포장에서 채취한 밭토양(Soil 2)이었으며, 채취한 토양시료는 음건 후 2 mm 채를 통과시킨 후 분석시까지 −20o C에서냉동보관 하였다.
- 분석에 사용된 용매인 acetonitrile, acetone, methanol은 Merck사(Merck KGaA, Germany)의 HPLC Grade로 구입하였다. Formic acid (> 98% purity)와 ammonium acetate (99% purity)는 Sigma Aldrich (St.
- 분석에 사용한 표준품은 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Ausberg, Germany), WAKO (JAPAN) 에서 구입하였으며 각각의 농약은 acetone, acetonitrile, methanol으로 1,000 mg/L의 stock solution을 제조하였다. 단, carbendazim의 경우 용매에 대한 용해도가 낮기 때문에 acetone을 이용하여 250 mg/ L의 stock solution을 제조하였다.
-
농약표준용액 및 시약
시험 농약은 작물 및 토양에서 자주 검출되는 농약을 대상으로 조사하여 HPLC-MS/MS에서 다성분 동시분석이 가능한 살균제, 살충제, 제초제, 생장조정제 총 124종을 Table 2과 같이 선정하였다.
- QuEChERS 전처리를 위한 시약 및 제품은 Agilent (California, USA)에서 구입하여 사용하였다. 추출 및 정제에 사용된 시약은 Agilent QuEChERS Extract Kit AOAC 2007.01 (6 g MgSO4, 1.5 g sodium acetate (NaOAc))와 Agilent QuEChERS dispersive SPE 2 mL Fatty and wax (150 mg MgSO4, 50 mg Primarysecondaryamine (PSA), 50 mg C18EC)을 사용 하였다.
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후)토양 중">토양중 다성분농약 동시분석에 사용한 HPLC는 Agilent Technologies (Palo Alto, USA) model 1200 series HPLC이고, tandem mass spectrometer는 Agilent 6410 triplequadrupole mass spectrometer를 사용하였다.
데이터처리
- 데이터 처리는 Mass Hunter® Workstation acquisition프로그램을 사용하였으며 기기분석에 대한 조건은 Table 3, 4와 같았다.
이론/모형
- 후)시험포장에서">시험 포장에서 채취한 밭토양(Soil 2)이었으며, 채취한 토양시료는 음건 후 2 mm 채를 통과시킨 후 분석시까지 -20℃에서 냉동보관 하였다. 채집된 토양의 물리화학성은 농업과학기술 연구조사분석기준(RDA, 2003) 에 따라 조사하였으며, 각 토양의 물리화학성은 Table 1과 같았다.
성능/효과
- 5% 이었다. 0.2N KCl 용액 침지 후 용매별 추출효율은 acetonitrile 64.7-113.4, acetone 64.6-120.9, ethyl acetate 0.8~115.3%, 각각의 평균은 85.4, 93.7, 89.1%이었다. 0.
- 1%이었다. 0.2N KCl용액으로 침지한 경우 전체적으로 낮은 회수율을 나타내었으며, 증류수와 0.2 N NH4Cl 용액으로 침지한 경우는 비슷한 추출효율을 나타내었다. 추출용액은 acetone이 가장 추출효율이 높았고 acetonitrile, ethyl acetate순이었다.
- 1%이었다. 0.2N NH4Cl 용액 침지 후 용매별 추출효율은 acetonitrile 72.8~110.9%, acetone 66.3~108.1%, ethyl acetate 1.0~154.3%, 각각의 평균은 93.1, 91.0, 87.5% 이었다. 0.
- Ethyl acetate를 사용할 경우 비극성 농약은 추출효율이 높은 반면 극성 농약은 낮았으며, 분석농약 중 log P가−0.18이며, 수용해도가 0.29 g/l로 비교적 높은 극성의 농약인 Pymetrozine의 경우 ethyl acetate 추출효율이 0.8~6.8%로 거의 회수가 되지 않았는데 이로 볼 때 극성 농약을 포함한 농약 분석에는 추출용매로 적정하지 못한 것으로 판단되었다.
- 1% formic acid를 포함한 acetonitrile 용액을 사용하여 positive mode에서 분석하였다. LC-MS/MS의 이온화 장치에서 MRM조건을 설정하여 분석의 선택성을 높였다. Matrix effect 시험 결과 대부분의 농약이 ± 20% 이하의 soft matrix effect 효과를 나타내었으며, ± 20% 이상의 matrix effect를 나타낸 농약은 soil 1의 경우 Acephate, Clotianidin, Cymoxanil, Omethoate, Parathionmethyl 등 5성분이었고 Soil2의 경우 Acephate, methamidophos 2성분이었으며, 이 농약들의 matrix effect도 30% 이하로 낮은 편이었다(Table 9).
- 두 토양에서의 회수율 결과를 보았을 때 각 농약별 회수율의 정도는 비슷한 것으로 나타났다. 즉 Benfuracarb와 같이 회수율이 낮은 농약은 Soil 1 및 Soil2에서 모두 낮았고 이들 농약을 제외하고 나머지 성분들은 모두 70~120%의 적정 회수율을 나타내었으며, 두">1). 두 토양은 토성 및 유기물함량 등 물리화학적 성질이 상이한 토양으로 분석법 검증 결과를 비교하는데 적합할 것으로 판단되었다.
- 후)분석 시">분석시 불순물이 적을 것으로 생각되었고 농산물 시료를 정제하는 방법이 적용 가능할 것으로 판단되었다. 따라서 농산물 정제 분석에 많이 사용되는 AOAC 2007.01 법의 정제방법(PSA 50 mg, C18 50 mg, MgSO4 150 mg 이용 정제)을 이용하여 앞선 실험에 사용된 90성분 농약을 대상으로 예비실험을 실시한 결과 Ethiofencarb 성분만 69.29%로 조금 낮게 회수되었으며 나머지 89성분은 70~120% 범위의 회수율을 나타내었다. 따라서 토양 중 후)추출 효율을">추출효율을 나타내었으며, 그 중 65성분의 농약들이 90~110% 사이의 높은 효율을 나타내었다(Table 5). 따라서 토양 중 농약잔류분석을 위해서는 0.2 N NH4Cl로 침지한 후 1% acetic acid를 포함한 acetonitrile용액으로 추출하는 것이 가장 좋은 것으로 판단되었다.
- 후)상대 표준편차도">상대표준편차도 20% 이내의 양호한 결과를 나타내었다. 따라서 토양 중 잔류농약 분석법으로 QuEChERS 분석법을 토성이 다양한 여러 토양에 적용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 995 이상으로 매우 양호하였다. 분석법의 정량한계 LOQ는 회수율시험 결과를 바탕으로 구하였으며, Chlorfluazuron, Chloropropham, Methabenzthiazuron, Pyrethrins 등 4농약의 LOQ는 0.01 mg/kg이었고, Novaluron, Parathionmethyl, Procymidone, Profenofos, Pyrethrin 등 5농약은 0.02 mg/kg, Terbufos 1농약은 0.1 mg/kg이었으며, 나머지 농약들은 0.005 mg/kg 이하였다(Table 8).
- 수용액 처리 및 추출용매 별 추출효율의 분포를 비교해본 결과 0.2 N NH4Cl 처리 후 acetonitrile로 추출하였을 때 90성분의 농약 모두 70~120%의 추출효율을 나타내었으며, 그 중 65성분의 농약들이 90~110% 사이의 높은 효율을 나타내었다(Table 5). 따라서 토양 중 이로">9). 이로 볼 때 토양 중 잔류농약을 QuEChERS 분석을 통한 LC-MS/MS 분석시 matrix effect 에 의한 영향은 매우 낮은 것으로 사료되었다. 토양을 대상으로 QuEChERS 분석 실험을 수행한 Dankyi 등(2014)과 Rouviere 등(2012)의 실험에서도 대부분의 성분에 대한 matrix effect는 낮은 것으로 보고된 바 있다.
- 후)회수율의">회수율의 정도는 비슷한 것으로 나타났다. 즉 Benfuracarb와 같이 회수율이 낮은 농약은 Soil 1 및 Soil2에서 모두 낮았고 이들 농약을 제외하고 나머지 성분들은 모두 70~120%의 적정 회수율을 나타내었으며, 상대표준편차도 20% 이내의 양호한 결과를 나타내었다. 따라서 토양 중 잔류농약 후)증류수침지">증류수 침지 후 용매별 추출효율은 acetonitrile 68.5~107.0%, acetone 66.2~121.8%, ethyl acetate 6.8~189.1%, 각각의 평균은 87.4, 91.2, 93.1%이었다. 0.
- 토양시료는 농산물에 비하여 유기물함량이 적어 분석시 불순물이 적을 것으로 생각되었고 농산물 시료를 정제하는 방법이 적용 가능할 것으로 판단되었다. 따라서 농산물 정제 분석에 많이 사용되는 AOAC 회수율 실험결과 Soil1의 경우 Benfuracarb, Ethiofencarb, Pymetrozine, Pyrethrin 등 4 성분의 농약이 70% 이하의 회수율을 나타내었으며, Chorfluazuron, Chlorpropham, Novaluron, Parathion-methyl, Procymidone, profenofos, terbufos 등이 7성분이 낮은 농도에서 검출되지 않거나 낮은 회수율을 나타내었다. soil2의 경우 Benfuracarb, Pymetrozine 등 2성분의 농약이 70% 이하의 회수율을 나타내었으며, Ethiofencarb과 Pyrethrin은 각각 65.
후속연구
- 토양을 대상으로 QuEChERS 분석 실험을 수행한 Dankyi 등(2014)과 Rouviere 등(2012)의 실험에서도 대부분의 성분에 대한 matrix effect는 낮은 것으로 보고된 바 있다. 그러나 두 토양간의 matrix effect가 조금 차이 가 있는 것을 확인 할 수 있었으며, 따라서 토양 종류에 따른 matrix effect에 대한 연구는 앞으로 더 수행할 필요가 있다.
- 후)정제 과정">정제과정 중 PSA에 흡착되는 특성이 있어 회수율이 떨어진다는 보고가 있다. 따라서 이들 4 농약은 낮은 추출효율과 정제시 PSA에 일부 흡착되는 특성으로 회수율이 낮아진 것으로 보였으며, 이들의 회수율을 높이기 위해서는 좀 더 연구가 필요하다. Chlorpropham 등 낮은 농도에서 낮은 회수율 및 불검출을 보이는 농약 등은 LC-MS/ MS에서 이온화가 불안정하고 감도가 낮은 농약들로 저농도에서 낮은 회수율을 보이는 것은 기기감도에 따른 정량한계의 차이에 의한 것이었다.
- 토양 중의 잔류농약은 농산물로 전이·잔류되어 안전성 문제 발생시킬 가능성이 있으므로 효율적인 농산물 안전관리를 위해서는 농산물의 오염 원인이 되는 재배환경 내 잔류농약의 사전 예방적 관리가 중요하며, 이에 재배환경중 잔류농약에 대한 지속적인 연구와 모니터링이 필요하다.
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