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문제 정의
- Pancreatic lipase 활성에 대한 PC-4의 영향: 황백으로부터분리한 활성물질인 PC-4가 지방대사에서 작용하는 다른 효소에서도 활성을 보이는지 확인하기 위해 지방대사의 다른과정 즉, 소장의 lumen에서 흡수된 중성지방을 지방산과 monoacyigiycerol로 분해하는데 관여하는 pancreatic lipase에대한 영향을 알아보았다. 5% gum arabic용액과 TBN(tribu- tyrin)을 섞어 유화시켜 agar 배지에 넣고 배지에 구멍을 뚫은 후 시료를 처리하여 lipase의 활성으로 생성되는 투명환의 생성여부를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 비만조절시스템과 연관지어 비만에 대한 저해활성을 나타내는 물질을 탐색하고자 국내의 식용 또는 약용식물을 대상으로 지방세포분화 저해활성을 측정하여 그 중저해활성이 높은 황백 (Phellodendri Cortex)을 선택하였으며 황백으로부터 전구 지방세포인 NIH-3T3 L1 의 지방세포로의분화를 억제하는 물질을 분리하였기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 200종류의 생약 시료 중 NIH-3T3 L1 전구 지방세포의 분화에 대한 저해 활성을 조사한 결과, 황백 (Phellodendri Cortex)의 methylene chloride 추출물에서 지방세포분화에 대한 강한 저해 활성을 보여 최종 후보 생약으로 선정하였다. 미분화상태의 전구지방세포인 NIH-3T3 L1 세포의 지방세포로의 분화에 미치는 황백 methylene chloride 추출물의 영향을 조사하기 위해 12-well plate의 각 well에 5×104 cells/mL의 세포를 넣고 2일 동안 배양하여 confluent stage 에 도달시킨 후, 0.
- NIH-3T3 L1 세포를 phosphate buffered saline(PBS) 용액으로 씻어준 후 5 × 104 cells/mL을 12 well-flat plate에 배양하였다. 48시간 후 10% FBS가 첨가된 medium에 0.5 mM DEXA, 10 mg/mL insulin, 1 ㎛ IB MX 를 48 시간 처리하였다. 그 후 6일 동안 이틀에 한번씩 10% FBS가 첨가된 medium에 10|ig/mL insulin과 시료를 처리하였다(13,14).
- 영향을 알아보았다. 5% gum arabic용액과 TBN(tribu- tyrin)을 섞어 유화시켜 agar 배지에 넣고 배지에 구멍을 뚫은 후 시료를 처리하여 lipase의 활성으로 생성되는 투명환의 생성여부를 관찰하였다. Table 5에서 보는바와 같이 증류수만 처리한 것과 lipase 억제제인 orlistat를 처리한 것은 투명환(clear zone)이 생성되지 않은 반면 lipase만 처리한 것과 시료를 처리한 경우에서는 투명환을 관찰할 수 있었다.
- 한천배지에 잘 섞어주었다. 5mm 두께의 한천배지에 지름 6 mm의 구멍을 뚫고 메탄올에 녹인 시료와 lipase(Sigma, St. Louis, USA)를 반응시켜 넣어준 후 30분마다 투명환(clear zone)이 생성되는 정도를 측정하였다.
- FAS에 대한 PC-4의 영향: 황백으로부터 분리한 PC-4의 비만관련 지방대사에 중요한 효소로 작용하는 FAS에 대한 저해활성을 측정하였다. 저해활성을 측정하는 과정에서 저해활성을 보이는 활성분획층이 주로 노란색을 띠는 것으로 보아 분광학적으로 측정되는 FAS저해활성이 황백 활성분획 자체의 색으로 인해 340nm에서 흡광도를 나타낼 수도 있으므로 정확한 FAS 저해활성을 측정하기 위하여 방사선 동위원소를 이용한 FAS assay를 병행하여 실시하였다.
- NIH-3T3 L1 세포의 분화는 역상현미경으로 관찰하여 세포내에 밝은색의 작은 지방과립의 형성이 생기는 것으로 확인하였고 세포의 분화 정도는 Oil red O로 염색하여 측정하였다. Oil red O stock solution(60% triethyl-phosphate 100 mL 에 500 mg Oil red O)을 녹여 여과한 후 용액 12mL을취하고 여기에 8mg 증류수를 첨가하여 실험에 이용하였다.
- 13C- NMR spectrum(50 MHz)을 즉정한 결과 2개의 methylene carbon(26, 55 ppm), 2개 의 methoxy carbon(57, 62 ppm), aromatic ring에서 유래된 methine 및 4급 탄소 signal(100~ 150 ppm)이 확인되었다. PC-4의 NMR spectrum의 signal을 정리한 결과는 Table 2와 같았으며 이 결과는 이미 보고된(19,20) berberine의 NMR data와 일치하여 분리된 PC-4를 berberine 으로 동정하였다(Fig. 4).
- 강한 저해활성을 나타내는 methylene chloride층은 감압농죽한 후, silica gel column chromatography(Kiesegel 60, particle size: 0.040〜0.063 nm)를 실시 하였으며 ethyl-acetate : methanol(5 : 1, v/v)의 용매조건으로 활성물질을 용출하였다. 활성분획을 감압농죽한 후, ODS RP-18 column chromatog- raphy(ODS-A, 120A, S-150 μm)를 실시하였으며 40% aceto nitrile(0.
- 5 mM DEXA, 10 mg/mL insulin, 1 ㎛ IB MX 를 48 시간 처리하였다. 그 후 6일 동안 이틀에 한번씩 10% FBS가 첨가된 medium에 10|ig/mL insulin과 시료를 처리하였다(13,14).
- 미분화상태의 전구지방세포인 NIH-3T3 L1 세포의 지방세포로의 분화에 미치는 황백 methylene chloride 추출물의 영향을 조사하기 위해 12-well plate의 각 well에 5×104 cells/mL의 세포를 넣고 2일 동안 배양하여 confluent stage 에 도달시킨 후, 0.5mM dexamethasone, 10 ㎍/mL insulin, 1 ㎍ 3-isobutyl-l- methylxanthine을 처리하여 2일간 배양한 후 지방세포 분화저해물질의 첨가 없이 또는 첨가 하에 6일간 배양하였다. 배양 후 황백 추출물 처리에 의한 영향을 조사한 결과 Fig.
- 방사선 동위원소를 이용한 측정은 3mM의 malonyl-CoA([malonyl-2- 14C]-CoA)를 반응용액에 넣은 후 가볍게 흔들어 준 뒤 30분간 반응하였다. 반응을 종결시키기 위하여 0.5 N NaOH 100 ㎕를 넣은 후 끓는 물에서 20분 동안 비누화 반응을 하고 1 N HCI 수용액 0.5㎕을 넣어 반응을 중화한 뒤 1.4 mL의 핵산을 넣어 상등액인 핵산층의 방사능도(radioactivity)를 측정하였다(18).
- 중량 250 g인 수컷 SD(Sprague-Dewley)쥐를 2일간 굶긴 후, 지방을 뺀 고탄수화물 식이를 3일간 실시한 후 간을 분리하여 분쇄 후 buffer로 씻어내고 polyethylene glycerol (PEG) 용액과 원심분리 등을 이용하여 지방산 생합성 효소를 분리하였다. 분광학적 방법으로 3mM acetyl-CoA, 0.2 M DTT, 2.8 mM NADPH 및 검정시료를 포함하는 75 mM의 포스페이트 완충용액 1 mL에 50J1L의 지방산 생합성 효소 분획물을 첨가한 뒤 상온에서 30분간 방치한 후, 3mM의 malonyl-CoA를 반응용액에 넣고 가볍게 흔들어 준 후, 30분간 방치하고 340nm에서 흡광도를 측정하였다(18).방사선 동위원소를 이용한 측정은 3mM의 malonyl-CoA([malonyl-2- 14C]-CoA)를 반응용액에 넣은 후 가볍게 흔들어 준 뒤 30분간 반응하였다.
- 05% H3PO4)의 용매조건으로 활성분획을 용출하여 감압농축시 킨 후 methylene chloride : methanol: H2O (6:3:1, 아래층)의 용매조건으로 silica gel column chromatography를 실시하였다. 이러한 용매조건으로 얻어진 활성분획물을 감압농축하고 methanol에 녹여 HPLC(YMC-Pack ODS-H80, 250 × 10 mml.D., S-4 μm)를 반복적으로 실시하여 저해물질을 분리하였다(Fig. 2). 그 결과 Fig.
- , Tokyo, Japan)로 구성된것을 사용하였다. 저해물질을 분리하기 위해 silica gel column chromatography, ODS RP-18 column chromatography, HPLC(YMC-Pack ODS-H8, 250×10 mml.D., S-4 gm, Tokyo, Japan) 등을 사용하여 분리하였고, 구조분석을 위한 'H-과 13C-NMR spectrum 은 Vari an unity-300, Varian unity- 500 NMR spectrometer를 이용하여 측정하였으며, 저해물질의 질량분석을 위해 Navigator mass spectrometer(Finnigan, Manchester, UK)를 사용하여 El-mass를 측정하였다.
- 측정하였다. 저해활성을 측정하는 과정에서 저해활성을 보이는 활성분획층이 주로 노란색을 띠는 것으로 보아 분광학적으로 측정되는 FAS저해활성이 황백 활성분획 자체의 색으로 인해 340nm에서 흡광도를 나타낼 수도 있으므로 정확한 FAS 저해활성을 측정하기 위하여 방사선 동위원소를 이용한 FAS assay를 병행하여 실시하였다. Table 4에서 보는바와 같이 황백 활성분획을 분광학적으로 FAS 저해활성을 측정한 결과 10㎍/mL에서도 약간의 저해활성을 보이고 이러한 저해활성은 농도의존적으로 나타남을 관찰할 수 있었다.
- 중량 250 g인 수컷 SD(Sprague-Dewley)쥐를 2일간 굶긴 후, 지방을 뺀 고탄수화물 식이를 3일간 실시한 후 간을 분리하여 분쇄 후 buffer로 씻어내고 polyethylene glycerol (PEG) 용액과 원심분리 등을 이용하여 지방산 생합성 효소를 분리하였다. 분광학적 방법으로 3mM acetyl-CoA, 0.
- 063 nm)를 실시 하였으며 ethyl-acetate : methanol(5 : 1, v/v)의 용매조건으로 활성물질을 용출하였다. 활성분획을 감압농죽한 후, ODS RP-18 column chromatog- raphy(ODS-A, 120A, S-150 μm)를 실시하였으며 40% aceto nitrile(0.05% H3PO4)의 용매조건으로 활성분획을 용출하여 감압농축시 킨 후 methylene chloride : methanol: H2O (6:3:1, 아래층)의 용매조건으로 silica gel column chromatography를 실시하였다. 이러한 용매조건으로 얻어진 활성분획물을 감압농축하고 methanol에 녹여 HPLC(YMC-Pack ODS-H80, 250 × 10 mml.
- 황백으로부터 지방세포 분화 저해물질을 분리하기 위해 황백을 7일 동안 메탄올에 침지하여 3회 추출하고 감압 농축한 후, methylene chloride, 부탄올을 이용하여 용매분획을 실시하였다. 강한 저해활성을 나타내는 methylene chloride층은 감압농죽한 후, silica gel column chromatography(Kiesegel 60, particle size: 0.
- 선정하였다. 황백을 메탄올로 추출한 후, silica gel column chromatography, ODS RP-18 column chromatogra phy, HPLC 등을 수행하여 지방세포 분화 저해활성을 갖는화합물 PC-4를 분리하였다. PC-4는 노란색의 분말형태로 메탄올을 용매로 UV 최대흡수치를 조사한 결과, 222, 265, 349, 429nm에서 최대의 UV의 흡수치를 보였으며 산이나 알카리조건에서 최대 흡수치의 변화가 관찰되지 않았다.
대상 데이터
- 각 분리단계에 이용된 유기용매는 덕산약품공업(주)의 고순도 제품을 이용하였고, HPLC 용매는 Burdick & Jackson(Muskegon, USA)제품을 사용하였다. NMR용 DMSO는 Norell사(Landis- ville, USA)로부터 구입하였다. 지방산 생합성 효소(fatty acid synthase, FAS)활성의 측정에 사용한 acetyl-CoA, malonyl- CoA, NADPH는 Sigma(St.
- 5 mm in thickness) 와 ODS RP-18 F254S(25DC-Platten 5 × 10 cm) 는 Merck사(Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 각 분리단계에 이용된 유기용매는 덕산약품공업(주)의 고순도 제품을 이용하였고, HPLC 용매는 Burdick & Jackson(Muskegon, USA)제품을 사용하였다. NMR용 DMSO는 Norell사(Landis- ville, USA)로부터 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 HPLC는 SCL-6A system controller, SDP-6A UV spectrophotometric detector, LC-6A liquid 아iromatograph로 구성된 것과 SPD-M10A photo diode array detector, CTO-10A column oven, LC-10AD liquid chro- matograph(Shimadzu Scientific Co., Tokyo, Japan)로 구성된것을 사용하였다. 저해물질을 분리하기 위해 silica gel column chromatography, ODS RP-18 column chromatography, HPLC(YMC-Pack ODS-H8, 250×10 mml.
- 본 실험에 사용된 생약재료는 황백나무(Phellodendron amurense RUPRCHT)의 주피를 벗겨낸 후 말린 줄기껍질인 황백 (Phellodendri Cortex)으로 대전의 일신약품(주)에서 구입하였다. 활성 물질 분리 및 확인에 사용된 silica gel(Kiesegel 60, particle size: 0.
- 비만 저해 물질을 탐색하고자 전통의학에서 사용되는 200 여 종류의 식용 또는 약용식물을 대상으로 지방세포 분화 저해 활성을 보이는 생약식물을 선별하여 용매층으로 활성이 이행되는 생약 중 황백(Phellodendri Cortex)을 최종적으로 후보 식물로 선정하였다. 황백을 메탄올로 추출한 후, silica gel column chromatography, ODS RP-18 column chromatogra phy, HPLC 등을 수행하여 지방세포 분화 저해활성을 갖는화합물 PC-4를 분리하였다.
- Gallen, Switzer- land)에서 gum arabic은 Sigma에서 구입하였다. 세포배양에 사용한 시약 중 Dulbecco^ modified Eagle's medium (DMEM), Oil red O, dexamethasone(DEXA), insulin, 3- isobutyl-l-methylxanthine(IBMX), phosphate buffered saline (PBS)은 Sigma에서, fetal bovine serum(FBS)은 Hyelone (Logan, USA)에서, trypsin, penicillin, streptomycin은 Gibco (Grand Island, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 NIH-3T3 L1 세포(preadipocyte)는 ATCC에서 구입하여 DMEM에 10% FBS, 50 U/mL penicillin, 50 ug/mL streptomycin과 함께 37℃, 5% CO2 세포 배양기에 배양하였다. NIH-3T3 L1 세포를 phosphate buffered saline(PBS) 용액으로 씻어준 후 5 × 104 cells/mL을 12 well-flat plate에 배양하였다.
- NMR용 DMSO는 Norell사(Landis- ville, USA)로부터 구입하였다. 지방산 생합성 효소(fatty acid synthase, FAS)활성의 측정에 사용한 acetyl-CoA, malonyl- CoA, NADPH는 Sigma(St. Louis, US A)에서, pancreatic lipase assay에 사용한 tributyrin은 Fluka(St. Gallen, Switzer- land)에서 gum arabic은 Sigma에서 구입하였다. 세포배양에 사용한 시약 중 Dulbecco^ modified Eagle's medium (DMEM), Oil red O, dexamethasone(DEXA), insulin, 3- isobutyl-l-methylxanthine(IBMX), phosphate buffered saline (PBS)은 Sigma에서, fetal bovine serum(FBS)은 Hyelone (Logan, USA)에서, trypsin, penicillin, streptomycin은 Gibco (Grand Island, USA)에서 구입하였다.
- . 화학적 특성은 Table 1에서 나타난 바와 같이 노란색의 분말 형태로 메탄올, DMSO, 물에는 잘 녹았으나 클로로포름, 헥산에서는 전혀 녹지 않았다. 메탄올을 용매로 UV 최대 흡수치를 조사한 결과 222, 265, 349, 429nm에서 최대의 UV 흡수치를 보였으며 산이나 알카리 조건에서 최대 흡수치의 변화가 관찰되지 않았다.
- 활성 물질 분리 및 확인에 사용된 silica gel(Kiesegel 60, particle size: 0.040〜0.063 nm)은 Merck사(Damistadt, Germany) 로부터, ODS RP-18(ODS-A, 120A, S-150㎛) 은 YMC-GEL사(Tokyo, Japan)로부터 구입하였고, TLC에 이용된 precoated silica gel plates F254(0.25 mm and 0.5 mm in thickness) 와 ODS RP-18 F254S(25DC-Platten 5 × 10 cm) 는 Merck사(Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 각 분리단계에 이용된 유기용매는 덕산약품공업(주)의 고순도 제품을 이용하였고, HPLC 용매는 Burdick & Jackson(Muskegon, USA)제품을 사용하였다.
이론/모형
- PC-4의 화학구조를 동정하기 위하여 여러 가지 NMR spectroscopy 기술을 이용하였다. PC-4를 DMSO에 녹여 'H- NMR spectrum(300 MHz)을 측정한 결과 6개의 aromatic methine(7~10 ppm), 2개의 aromatic methylene(3.
- 지방산 생합성효소는 Tracy 등(17)의 방법에 따라 분리하였다. 중량 250 g인 수컷 SD(Sprague-Dewley)쥐를 2일간 굶긴 후, 지방을 뺀 고탄수화물 식이를 3일간 실시한 후 간을 분리하여 분쇄 후 buffer로 씻어내고 polyethylene glycerol (PEG) 용액과 원심분리 등을 이용하여 지방산 생합성 효소를 분리하였다.
성능/효과
- (3) 전구 지방세포(preadipocyte)에서 지빙세포 (adipocyte)로의 분화는 성장과정 중 특정 호르몬의 급작스러운 양적 변화와 과잉 영양공급에 의해 유발될 수 있으며, 이들 지방세포 분화 유도인자에 의해 신체 내 특정부위에서 지방세포 분화가 일어날 수 있다. 또한, 지방세포의 크기는 한계가 있으므로 과잉 에너지를 섭취할 때 에너지를 신속히 저장하기 위해서 지방세포수의 증가가 일어나게 된다.
- 1 ppm)을 확인하였다. 13C- NMR spectrum(50 MHz)을 즉정한 결과 2개의 methylene carbon(26, 55 ppm), 2개 의 methoxy carbon(57, 62 ppm), aromatic ring에서 유래된 methine 및 4급 탄소 signal(100~ 150 ppm)이 확인되었다. PC-4의 NMR spectrum의 signal을 정리한 결과는 Table 2와 같았으며 이 결과는 이미 보고된(19,20) berberine의 NMR data와 일치하여 분리된 PC-4를 berberine 으로 동정하였다(Fig.
-
PC-4.
4) Cerulenin (an inhibitor of fatty acid synthesis) was used as a positive control of FAS inhibitory activity
. - PC-4는 노란색의 분말형태로 메탄올을 용매로 UV 최대흡수치를 조사한 결과, 222, 265, 349, 429nm에서 최대의 UV의 흡수치를 보였으며 산이나 알카리조건에서 최대 흡수치의 변화가 관찰되지 않았다. El-mass spectrum을 측정한 결과, 분자량이 336.1로 예상되었으며 'H- NMR, 13C-NMR, DEPT, 'H-'H COSY; HMQC, HMBC NMR spectrum을 통해, PC-4는 isoquionoline alkaloide계열의 berberine으로 동정되었다. PC-4는 지방의 대사에 관여하는 중요한 효소인 fatty acid synthase와 pancreatic lipase에 대한 저해활성은 나타나지 않았으나, 지방세포 분화 저해활성은 1㎍/mL의 낮은 농도에서도 관찰되었다.
- 5). Lipid droplet 형성정도를 측정하기 위하여, Oil red O로 염색하여 isopropanol로 용출시켜 흡광도를 측정한 결과, PC-4는 대조군에 비해 10Rg/mL에서는 85% 저해하였고 iRg/mL에서는 26% 정도의 저해활성을 보여(Table 3) PC-4가 지방세포의 분화의 지표로 사용되는 lipid droplet의 형성을 저해하는 것을통해 지방세포의 분화를 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
- 황백을 메탄올로 추출한 후, silica gel column chromatography, ODS RP-18 column chromatogra phy, HPLC 등을 수행하여 지방세포 분화 저해활성을 갖는화합물 PC-4를 분리하였다. PC-4는 노란색의 분말형태로 메탄올을 용매로 UV 최대흡수치를 조사한 결과, 222, 265, 349, 429nm에서 최대의 UV의 흡수치를 보였으며 산이나 알카리조건에서 최대 흡수치의 변화가 관찰되지 않았다. El-mass spectrum을 측정한 결과, 분자량이 336.
- 기술을 이용하였다. PC-4를 DMSO에 녹여 'H- NMR spectrum(300 MHz)을 측정한 결과 6개의 aromatic methine(7~10 ppm), 2개의 aromatic methylene(3.2, 4.9 ppm), 2개의 aromatic methoxyl groups(4.1 ppm)을 확인하였다. 13C- NMR spectrum(50 MHz)을 즉정한 결과 2개의 methylene carbon(26, 55 ppm), 2개 의 methoxy carbon(57, 62 ppm), aromatic ring에서 유래된 methine 및 4급 탄소 signal(100~ 150 ppm)이 확인되었다.
- 반면 방사선 동위원소를 이용한 FAS 저해활성을 측정한 결과, 선택적인 지방산 생합성효소 저해제로 알려진 cerulenin 이 확실하게 저해활성을 나타낸 반면, 황백 활성분획은 분광학적 방법에서의 저해활성과 달리 농도에 관계없이 대조시료와 비슷한 값으로 나타나 FAS에 대한 저해활성은 없는 것으로 확인되었다. 따라서 황백에서 분리한 활성분획 PC-4는 지방산 대사과정 중 지방산 생합성에 관여하는 지방산 생합성효소에 대한 저해활성은 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
- 화학적 특성은 Table 1에서 나타난 바와 같이 노란색의 분말 형태로 메탄올, DMSO, 물에는 잘 녹았으나 클로로포름, 헥산에서는 전혀 녹지 않았다. 메탄올을 용매로 UV 최대 흡수치를 조사한 결과 222, 265, 349, 429nm에서 최대의 UV 흡수치를 보였으며 산이나 알카리 조건에서 최대 흡수치의 변화가 관찰되지 않았다. 또한 분자량을 측정하기 위한 El-mass spectrum에서는 336.
- Table 4에서 보는바와 같이 황백 활성분획을 분광학적으로 FAS 저해활성을 측정한 결과 10㎍/mL에서도 약간의 저해활성을 보이고 이러한 저해활성은 농도의존적으로 나타남을 관찰할 수 있었다. 반면 방사선 동위원소를 이용한 FAS 저해활성을 측정한 결과, 선택적인 지방산 생합성효소 저해제로 알려진 cerulenin 이 확실하게 저해활성을 나타낸 반면, 황백 활성분획은 분광학적 방법에서의 저해활성과 달리 농도에 관계없이 대조시료와 비슷한 값으로 나타나 FAS에 대한 저해활성은 없는 것으로 확인되었다. 따라서 황백에서 분리한 활성분획 PC-4는 지방산 대사과정 중 지방산 생합성에 관여하는 지방산 생합성효소에 대한 저해활성은 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
- 5mM dexamethasone, 10 ㎍/mL insulin, 1 ㎍ 3-isobutyl-l- methylxanthine을 처리하여 2일간 배양한 후 지방세포 분화저해물질의 첨가 없이 또는 첨가 하에 6일간 배양하였다. 배양 후 황백 추출물 처리에 의한 영향을 조사한 결과 Fig. 1 에서 보는바와 같이 10㎍/mL 농도에서 대조군에 비해 유의성 있게 지방세포의 분화를 억제하였다.
- 본 연구에서 분리한 PC-4는 지방대사에 관여하는 효소에 대한 저해활성은 보이지 않고 지방세포 분화 저해활성은 보여 PC-4가 지방조직 분화에 관련된 전사인자나 지방세포 특이적 유전인자, 아니면 지방조직의 내분비 역할과 연관된 호르몬 등에 작용하여 지방세포 분화 저해활성을 나타내는 것으로 추정된다.
- Table 5에서 보는바와 같이 증류수만 처리한 것과 lipase 억제제인 orlistat를 처리한 것은 투명환(clear zone)이 생성되지 않은 반면 lipase만 처리한 것과 시료를 처리한 경우에서는 투명환을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, PC-4는 pancreatic lipase에 대한 저해 활성은 없는 것으로 관찰되었다.
- 황백 (Phellodendri Cortex)으로부터 분리한 PC-4는 지방의대사에 관여하는 중요한 효소인 FAS와 pancreatic lipase에 대한 저해활성은 없었으나, 비만의 중요한 원인인 지방세포 분화에 대한 저해활성은 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서도 관찰되었으며 항균활성도 확인할 수 있었다(결과 생략). 최근 지방조직을 구성하는 지방세포의 분화와 조절기전에 대한 분자생물학적 연구가 활발하게 진행되어(3)CCAAT/enhancer binding protein-a(C/EBPa), peroxisome proliferator activated recep- tor-y(PPARy)/retinoid X receptor-a(RXRa), adipocyte deter mination and differentiation factor-1 (ADD 1)5] 전사인자 (transcription factor)가 지방세포 분화에 중추적 역할을 한다는 사실이 알려져 있다.
- 황백으로부터 최종적으로 분리한 활성물질 PC-4의 미분화상태 전구 지방세포인 NIH-3T3 L1 세포의 지방세포로의 분화에 대한 영향을 조사한 결과, PC-4 처리농도 1 ㎍/mL에서까지 지방세포 분화 저해활성을 나타내었다(Fig. 5). Lipid droplet 형성정도를 측정하기 위하여, Oil red O로 염색하여 isopropanol로 용출시켜 흡광도를 측정한 결과, PC-4는 대조군에 비해 10Rg/mL에서는 85% 저해하였고 iRg/mL에서는 26% 정도의 저해활성을 보여(Table 3) PC-4가 지방세포의 분화의 지표로 사용되는 lipid droplet의 형성을 저해하는 것을통해 지방세포의 분화를 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
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