선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 본 실험에서는 비만형 동물 모델에 황백 추출물을 투여하여 체중, 혈당, 혈청 인슐린 농도, 인슐린 저항성, 지방조직 및 간의 무게, macrophage 발현 및 cytokine 등의 변화를 측정 관찰한 결과 대사 기능의 변화에 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 또한 최근 지질 대사와 관련된 김 등8과 당 대사와 관련된 김 등9, 그리고 염증 관련 cytokine의 수치 및 면역세포의 변화와 관한 김 등18의 연구는 있었으나, 전반적인 대사기능의 변화에 있어 황백과 대사성 질환 치료에 대한 연관성은 보고된 바가 없었다. 이에 저자는 비만이 유발된 동물 모델에 있어 황백이 염증 반응을 포함한 대사 기능에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Male C57BL/6 mouse 6마리씩을 정상군(normal), 대조군(control), 황백 투여군(Phellodendri)으로 나누었다. 정상군을 제외한 나머지 2개 군들은 60% fat diet를 12주간 섭취시켜 비만을 유발했다.
- 경구 당부하 검사는 실험 12주째 12시간 이상 금식시킨 후 공복 시 혈당을 측정한 다음, glucose (2 g/kg body weight)를 D.W.에 녹여 경구 투여시키고 30분 후, 60분 후, 90분 후, 120분 후 mouse의 tail vein에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 혈당은 strip-operated blood glucose sensor를 이용하여 측정하였다.
- 또한 ATM은 TNF- α, IL-6, MCP-1와 같은 전염증성 사이토카인을 생성하며, 이러한 사이토카인과 케모카인은 인슐린 신호 전달 단백질의 활성을 감소시켜, 인슐린 작동을 차단하고 인슐린 저항상태가 된다23. 따라서 인슐린 저항성을 평가하기 위한 방법으로 ATM의 숫자와 그 중 CD45와 반응한 macrophage를 측정하여 그 percentage를 분석하였다.
- 마지막으로 지방조직에서 macrophage 활성화 및 침윤으로 인하여 상승하는 인슐린 저항성과 대사성 질환과의 연관성을 파악하고자 cytokine 및 macrophage 활성화를 판단하기 위한 표지자를 검출, 분석하였다.
- 실험 시작 12주째 mouse를 희생시킨 후 개복하여 부고환 지방조직(epididymal fat pad) 및 간의 무게를 측정하였다.
- 2% FBS/PBS 용액으로 세척한 다음 FACS LSRII를 이용하여 분석했다. 이후 FlowJo 프로그램을 이용하여 CD45(+), CD11b(+), F4/80(+)인 macrophage의 퍼센트를 분석했다.
- 정상군을 제외한 모든 실험군에 60% fat diet (HFD, Research Diets, D12492)를 12주간 섭취시켜 비만을 유발했다.
- 체중은 실험 개시일에 최초 측정 한 후 실험 종료일에 마지막 sampling하기 전에 측정하였다. 체중 측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자 저울을 사용하여 측정하였으며, 측정 시 mouse의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 mouse을 올려놓고, mouse가 안정 상태에 이르러 나타나는 체중을 기록하였다.
대상 데이터
- 19~21 g의 male C57BL/6(중앙실험동물, Korea)을 구매하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되며 40~70%의 습도가 유지되는 stainless-steel cage에서 1주일간 사육하며 적응기를 거쳤다. 먹이와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
- 본 실험에 사용된 약재인 黃柏(Cortex Phellodendri)은 운향과에 속한 낙엽교목인 황벽나무 Phellodendron amurense Ruprecht의 주피를 벗긴 수간피로서, 경희한약에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 연쇄중합반응에 사용된 각각의 primer의 염기 서열은 TNF-α의 경우 5′-TTCTG TCTAC TGAAC TTCGG GGTGA TCGGT CC-3'과 5'-GTATG AGATA GCAAA TCGGC TGACG GTGTG GG-3′ 을, IFN-γ의 경우 5′-GGC GAC AGT TCA GCC ATC ACT T-3′과 5′-GCA TCG TTT TGG GTT CTC TTG G-3′을 housekeeping gene으로는 GAPDH의 경우 5′-AGTCCATGCCATCACTGCCACC-3′과 5′-CCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′을 각각 사용하였다. 유전자 발현 분석은 SDS Software 2.4를 이용하여 얻은 각각의 유전자에 대한 threshold cycle (CT)값을 GAPDH 기준으로 relative quantitation (RQ)값을 환산한 다음 fold change값을 계산하였다. 측정된 fold change값은 정상군을 1로 산정하여 이에 대한 값으로 환산하여 표시하였다.
- 이후 7차례 세척 후 enzyme substrate solution을 넣고 40분간 반응시킨 다음, reaction stop solution을 넣고 10분 후 ELISA reader를 이용하여 450 nM에서 분석하였다. 인슐린 저항성은 HOMA-IR을 이용하여 측정하였다. HOMA-IR은 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.
- 지방 세포의 TNF-α, IL-10 유전자의 발현 측정은 실시간 정량 역전사 연쇄중합반응(quantitative Real time-polymerase chain reaction, qRT-PCR) 이용하여 측정하였다. qRT-PCR에 앞서 cDNA의 제작은 Advantage RT for PCR Kit을 이용하였다.
성능/효과
- 총량 1000 g의 황백(Cortex Phellodendri)을 1,500 ml의 증류수에 넣어 4시간 동안 가열추출하고 여과한 여액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조기로 건조시켰다. 동결 건조된 각 약제 1차 추출물 1 g씩을 10 ml의 증류수로 용해시킨 후 95 ℃수조에서 2시간 동안 재차 가열 추출하였고, 이들 추출물을 원심분리용 시험관에 담아 14,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상청액을 수거하였다. 이 상청액을 직경 0.
- 이 상청액을 직경 0.2 μm의 여과지를 통과시켜 여과 멸균하였으며, 사용할 때까지 -70 ℃에 보관하였다. 황백의 최종 수거율은 4.
- 역전사를 통해 얻어진 각각의 complementary DNA(cDNA)에 2× SYBR Reaction buffer, primers, dH2O를 혼합하여 7900HT Fast Real-Time PCR System를 이용하여 연쇄중합반응을 시행하였다. 연쇄중합반응에 사용된 각각의 primer의 염기 서열은 TNF-α의 경우 5′-TTCTG TCTAC TGAAC TTCGG GGTGA TCGGT CC-3'과 5'-GTATG AGATA GCAAA TCGGC TGACG GTGTG GG-3′ 을, IFN-γ의 경우 5′-GGC GAC AGT TCA GCC ATC ACT T-3′과 5′-GCA TCG TTT TGG GTT CTC TTG G-3′을 housekeeping gene으로는 GAPDH의 경우 5′-AGTCCATGCCATCACTGCCACC-3′과 5′-CCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′을 각각 사용하였다. 유전자 발현 분석은 SDS Software 2.
- 공복 시 혈당 및 혈청 인슐린 농도 측정을 위해 고지방 식이 투여 12주째에 12시간 이상 금식시킨 후 실험쥐의 tail vein에서 혈액을 채취한 다음, 4 ℃에서 2,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 인슐린은 ultra sensitive mouse insulin ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
- 정상군을 제외한 나머지 2개 군들은 60% fat diet를 12주간 섭취시켜 비만을 유발했다. 황백 투여군은 60% fat diet에 황백을 5%의 비율로 섞어 12주간 섭취했다.
- 3. 黃柏은 Adipose tissue macrophage(ATM)의 숫자를 유의하게 감소시켰다.
- 2. 黃柏은 경구 당부하 혈당 수치를 투하 직후, 60분 후, 90분 후, 120분 후 유의하게 감소시켰다.
- 1. 黃柏은 공복 시 혈당을 유의하게 감소시켰다.
- 5. 黃柏은 지방세포의 IL-10 유전자 발현을 유의하게 증가시켰다.
- 4. 黃柏은 지방세포의 TNF-α 유전자 발현을 유의하게 감소시켰다.
- 이는 황백이 항염증성 cytokine인 IL-10의 발현을 증가시키며, 인슐린 저항성을 높이는 cytokine인 TNF-α가 대식세포에서 분비되는 것을 억제함으로써, 대식세포의 활동 및 염증 반응의 억제에 유의하다는 결론을 얻을 수 있었다.
- 이번 연구를 종합하면, 비만이 유발된 동물모델에서 황백은 체중감소 및 비만 자체를 개선시키지는 못하였으나, 혈당 상승을 억제하였고, 항염증 작용이 있음이 나타났다.
후속연구
- 염증 상태의 관리는 지방 세포에서의 염증 매개 인자 정상화를 통한 인슐린 저항성의 개선을 가져올 수 있으며, 이는 비만의 원인인 혈당 대사기능의 저하를 막는 치료법인 동시에, 만성 염증상태의 비만 양상의 개선에 영향을 준다는 점에 비추어 볼 때, 황백의 항염증 작용과 인슐린 저항성 개선 효과가 비만의 생성 억제 뿐 아니라 비만 상태의 개선에 유의하다는 본 연구의 결과는 향후 대사 질환의 예방 및 치료에 중요하게 활용될 수 있을 것으로 생각한다. 다만 대사성 질환의 치료 및 비만 개선에 있어 황백의 장기적인 투여와 황백이 포함된 처방 등을 통한 다양한 임상연구는 추가적으로 필요하리라 생각한다.
- 항산화 작용과 혈당 감소라는 기존 연구들15-18의 연장선상에서, 황백의 혈당 감소 효과 역시 본 실험에서도 입증되었다. 염증 상태의 관리는 지방 세포에서의 염증 매개 인자 정상화를 통한 인슐린 저항성의 개선을 가져올 수 있으며, 이는 비만의 원인인 혈당 대사기능의 저하를 막는 치료법인 동시에, 만성 염증상태의 비만 양상의 개선에 영향을 준다는 점에 비추어 볼 때, 황백의 항염증 작용과 인슐린 저항성 개선 효과가 비만의 생성 억제 뿐 아니라 비만 상태의 개선에 유의하다는 본 연구의 결과는 향후 대사 질환의 예방 및 치료에 중요하게 활용될 수 있을 것으로 생각한다. 다만 대사성 질환의 치료 및 비만 개선에 있어 황백의 장기적인 투여와 황백이 포함된 처방 등을 통한 다양한 임상연구는 추가적으로 필요하리라 생각한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.