본 실험은 한국 논에서 발생하고 있는 물옥잠의 SU계 제초제에 대한 저항성 메카니즘을 구명하기 위하여 ALS 활성, $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 및 ALS 유전자의 DNA 염기서열을 분석하였다. 한국 논에서 광범위하게 사용 중인 6 종류의 SU 계 제초제들에 대하여 저항성이 확인되었는데, 저항성 생태형에 대한 생체중 50% 저해 제초제 농도 $(GR_{50})$는 감수성 생태형에 비하여 약 4배에서 64배까지 높았다. SU계 제초제들 에 대한 저항성 생태형의 ALS 활성은 감수성 생태형 보다 훨씬 덜 민감하게 반응하였으며, 저항성 생태형에 대한 SU계 제초제들의 $I_{50}$값은 감수성 생태형 보다 14배에서 76배까지 높게 나타났다. 생태형간 ALS 활성 차이의 원인을 구명하기 위하여 $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 차이를 조사한 결과 생태형간 뚜렷한 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 저항성 및 감수성 생태형의 ALS 유전자 염기서열을 분석한 결과 저항성 생태형의 ALS 유전자 아미노산 서열 중 각각 하나의 염기치환에 의하여 168번째 threonine이 serine으로, 189번째 histidine이 arginine로, 247번째 aspartic acid가 glutamic acid로 변이 된 것이 확인되었다.
본 실험은 한국 논에서 발생하고 있는 물옥잠의 SU계 제초제에 대한 저항성 메카니즘을 구명하기 위하여 ALS 활성, $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 및 ALS 유전자의 DNA 염기서열을 분석하였다. 한국 논에서 광범위하게 사용 중인 6 종류의 SU 계 제초제들에 대하여 저항성이 확인되었는데, 저항성 생태형에 대한 생체중 50% 저해 제초제 농도 $(GR_{50})$는 감수성 생태형에 비하여 약 4배에서 64배까지 높았다. SU계 제초제들 에 대한 저항성 생태형의 ALS 활성은 감수성 생태형 보다 훨씬 덜 민감하게 반응하였으며, 저항성 생태형에 대한 SU계 제초제들의 $I_{50}$값은 감수성 생태형 보다 14배에서 76배까지 높게 나타났다. 생태형간 ALS 활성 차이의 원인을 구명하기 위하여 $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 차이를 조사한 결과 생태형간 뚜렷한 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 저항성 및 감수성 생태형의 ALS 유전자 염기서열을 분석한 결과 저항성 생태형의 ALS 유전자 아미노산 서열 중 각각 하나의 염기치환에 의하여 168번째 threonine이 serine으로, 189번째 histidine이 arginine로, 247번째 aspartic acid가 glutamic acid로 변이 된 것이 확인되었다.
This experiment was carried out to study the resistant mechanism of sulfonylurea(SU) herbicides to Monochoria korsakowii occurring in the rice fields of Korea. The activity of acetolactate synthase(ALS), absorption and translocation of $[^{14C}]$bensulfuron-methyl, and DNA sequence of ALS...
This experiment was carried out to study the resistant mechanism of sulfonylurea(SU) herbicides to Monochoria korsakowii occurring in the rice fields of Korea. The activity of acetolactate synthase(ALS), absorption and translocation of $[^{14C}]$bensulfuron-methyl, and DNA sequence of ALS genes were studied. The apparent SU resiatance to Monochoria korsakowii was confirmed in greenhouse testes. Fresh weight accumulation$(GR_{50})$ in the resistant biotype was about 5- to 64-fold higher in the presence of six SU herbicides compared to the susceptible biotype. The ALS activity isolated from the resistant biotype to herbicides tested was less sensitive than that of susceptible biotype. The concentration of herbicide required for 50% inhibition of ALS activity$(I_{50})$ was 14- to 76-fold higher as compared to the susceptible biotype. No differences were observed in the rates of $[^{14C}]$bensulfuron uptake and translocation. However, the DNA sequence from the resistant biotype differed from that of the susceptible biotype by single nucleotide substitution at three amino acid each in the middle region excluding the ends of ALS genes. We found three point mutations causing substitution of serine for threonine at amino acid 168, arginine for histidine at amino acid 189, and a aspartic acid for phenylalanine at amino acid 247, respectively, in the resistant biotype.
This experiment was carried out to study the resistant mechanism of sulfonylurea(SU) herbicides to Monochoria korsakowii occurring in the rice fields of Korea. The activity of acetolactate synthase(ALS), absorption and translocation of $[^{14C}]$bensulfuron-methyl, and DNA sequence of ALS genes were studied. The apparent SU resiatance to Monochoria korsakowii was confirmed in greenhouse testes. Fresh weight accumulation$(GR_{50})$ in the resistant biotype was about 5- to 64-fold higher in the presence of six SU herbicides compared to the susceptible biotype. The ALS activity isolated from the resistant biotype to herbicides tested was less sensitive than that of susceptible biotype. The concentration of herbicide required for 50% inhibition of ALS activity$(I_{50})$ was 14- to 76-fold higher as compared to the susceptible biotype. No differences were observed in the rates of $[^{14C}]$bensulfuron uptake and translocation. However, the DNA sequence from the resistant biotype differed from that of the susceptible biotype by single nucleotide substitution at three amino acid each in the middle region excluding the ends of ALS genes. We found three point mutations causing substitution of serine for threonine at amino acid 168, arginine for histidine at amino acid 189, and a aspartic acid for phenylalanine at amino acid 247, respectively, in the resistant biotype.
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문제 정의
그러나 이들초종에 대한 저항성 생태형의 생물적 및 생화학적 반응, ALS 유전 염기서열이 채집된 지역에 따라서 서로 상이 하였을 뿐만 아니라 같은 SIM] 저항성 잡초인 Salsola iberica의 저항성 생태형은 ALS 유전자에서 어떠한 돌연변이도 발생되지 않았다고 보고되어지는 등 현재까지 SU계 제초제에 대한 저항성 잡초의 작용기작은 명백히 밝혀지지 않고 있는 실정이다(Guttieri 등, 1995). 따라서 본 연구는 우리나라 논에서 SU계 제초제에 대한 저항성 잡초로 가장 먼저 확인되어 확산되고 있는 물옥잠을 대상으로 저항성 정도를 조사한 다음 저항성 작용기작을 구명하기 위하여 생태형간 ALS 활성반응, 'tcMnsulfimm의 체내 흡수이행, 그리고 ALS 유전자의 염기서열 분석을 하였다.
제안 방법
Degenerate 및 generate primer는 유전자 은행에 등록된 12개의 ALS 유전자 염기서열을 multiple alignment 한 다음 공통 염기서열을 탐색하여 primer를 합성하였다. ALS 유전자의 cDNA 합성은 물옥잠으로부터 분리한 total DNA와 기존에 알려진 다른 잡초 초종들에 대한 ALS 유전자의 공통 염기서열로부터 설계한 primer를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 실시하였다. PCR로 증폭한 cDNA는 direct sequencing에 사용하기 위하여 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN Co.
ALS 유전자의 염기서열을 위한 DNA는 cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)< 사용하여 유리 온실에서 생육된 6~7 엽기의 감수성 및 저항성 생태형 물옥잠으로부터 분리하였다 . 물옥잠의 ALS 유전자에 대한 primer 의 설계는 National Center for Bio- technology Information (NCBI) 유전자은행 (GenBank)에 등록된 ALS 유전자 염기서열을 이용하였다.
효소 활성은 Westerfield(1945)의 방법에 따라 생성된 acetoin 의 양을 측정하였으며, 효소활성은 aoetoin에 대한 표준 곡선을 이용하였으며, 단위 시간 당 생성되는 단백질에 대한 acetoin 양으로 표시하였다. ALS 활성 50% 를 억제하는 제초제 농도인 I50을 계산하였다.
물옥잠의 ALS 유전자에 대한 primer 의 설계는 National Center for Bio- technology Information (NCBI) 유전자은행 (GenBank)에 등록된 ALS 유전자 염기서열을 이용하였다. Degenerate 및 generate primer는 유전자 은행에 등록된 12개의 ALS 유전자 염기서열을 multiple alignment 한 다음 공통 염기서열을 탐색하여 primer를 합성하였다. ALS 유전자의 cDNA 합성은 물옥잠으로부터 분리한 total DNA와 기존에 알려진 다른 잡초 초종들에 대한 ALS 유전자의 공통 염기서열로부터 설계한 primer를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 실시하였다.
ALS 유전자의 cDNA 합성은 물옥잠으로부터 분리한 total DNA와 기존에 알려진 다른 잡초 초종들에 대한 ALS 유전자의 공통 염기서열로부터 설계한 primer를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 실시하였다. PCR로 증폭한 cDNA는 direct sequencing에 사용하기 위하여 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN Co.)를 이용하여 정제하였다. 정제한 cycle suquencing product 는 denaturing시킨 다음 얼음에 냉각시켜 ABI Prism 310에 loading 하였다.
국내 논에서 널리 사용 중인 azimsulfiiTon, bensul- furon, cinosulfuron, ethoxysulfuron, imazosulfuron 그리고 pyrazosulfuron 입제를 물옥잠 2~3 엽기에 처리하였다. 처리 약량은 표 1과 같이 약종별 국내 논에서 사용 중인 표준량 대비 0.
물옥잠을 사용하였다. 균일하고 건전 한식 물체를 흐르는 물에 세척 후 방사능이 약 50, 000 dpm/mL가 되도록 희석된 수도용 배양액에 생태형별로 각각 15주씩 1, 3, 6, 12 및 24시간 동안 근부를침지 흡수시킨 다음 흐르는 물에 다시 세척하여 근부와 경엽부를 분리 채취하였다. 분리 채취된 식물체는 진공상태의 동결건조기(일신 BONDIRO)에 완전히 건조시킨 다음 뿌리와 줄기 무게를 각각 평량하여 미세하게 마쇄된 시료를 일정량씩 분취하여 표 2와 같은 조건에서 sample oxidizer(Packard model 307)로 연소 시켜 cocktail buff&에 포집된 방사선 동위원소를 liquid scintillation counter(LSC, Packard model 1600TR) 로 방사선 동위원소의 양을 측정하였다.
2, 1, 5 그리고 10 배량을 입제로 처리하여 3반복으로 완전임의 배치하였다. 물옥잠 생태형별 생존율 및 생체중은 처리 후 20일에 조사하였으며, 생체중 50%를 억제하는 제초제 농도인 GRso값을 계산하였다.
균일하고 건전 한식 물체를 흐르는 물에 세척 후 방사능이 약 50, 000 dpm/mL가 되도록 희석된 수도용 배양액에 생태형별로 각각 15주씩 1, 3, 6, 12 및 24시간 동안 근부를침지 흡수시킨 다음 흐르는 물에 다시 세척하여 근부와 경엽부를 분리 채취하였다. 분리 채취된 식물체는 진공상태의 동결건조기(일신 BONDIRO)에 완전히 건조시킨 다음 뿌리와 줄기 무게를 각각 평량하여 미세하게 마쇄된 시료를 일정량씩 분취하여 표 2와 같은 조건에서 sample oxidizer(Packard model 307)로 연소 시켜 cocktail buff&에 포집된 방사선 동위원소를 liquid scintillation counter(LSC, Packard model 1600TR) 로 방사선 동위원소의 양을 측정하였다.
처리 약량은 표 1과 같이 약종별 국내 논에서 사용 중인 표준량 대비 0.02, 0.04, 0.2, 1, 5 그리고 10 배량을 입제로 처리하여 3반복으로 완전임의 배치하였다. 물옥잠 생태형별 생존율 및 생체중은 처리 후 20일에 조사하였으며, 생체중 50%를 억제하는 제초제 농도인 GRso값을 계산하였다.
대상 데이터
물옥잠 생태형간 ["C]bensulfim)n의 흡수이행 정도를 알아보기 위하여 25±5℃ 유리 온실에서 생육된 6~7엽기의 물옥잠을 사용하였다. 균일하고 건전 한식 물체를 흐르는 물에 세척 후 방사능이 약 50, 000 dpm/mL가 되도록 희석된 수도용 배양액에 생태형별로 각각 15주씩 1, 3, 6, 12 및 24시간 동안 근부를침지 흡수시킨 다음 흐르는 물에 다시 세척하여 근부와 경엽부를 분리 채취하였다.
식물생육상(Conviron's E-15, Canada) 내에서 4~5 엽기까지 생육된 물옥잠 지상부를 수확한 후 즉시 액체질소에 동결하여 사용하였다. 액체질소에 동결된 물옥잠 50 g을 Ray(1984)방법에 의하여 1 mM sodium pyruvate, 0.
이 실험에 사용된 물옥잠의 저항성 생태형은 다년간 SU계 혼합 제초제 사용으로 물옥잠이 우점화된 충남 서산 간척지 논에서 종자를 채종하였으며, 감수성 생태형은 제초제 접촉이 전혀 없었을 것으로 추측되는 경기도 수원시 저수지에서 채종된 것을 사용하였다.
이론/모형
분리하였다 . 물옥잠의 ALS 유전자에 대한 primer 의 설계는 National Center for Bio- technology Information (NCBI) 유전자은행 (GenBank)에 등록된 ALS 유전자 염기서열을 이용하였다. Degenerate 및 generate primer는 유전자 은행에 등록된 12개의 ALS 유전자 염기서열을 multiple alignment 한 다음 공통 염기서열을 탐색하여 primer를 합성하였다.
동결하여 사용하였다. 액체질소에 동결된 물옥잠 50 g을 Ray(1984)방법에 의하여 1 mM sodium pyruvate, 0.5 mM thiamine pyrophosphate(TPP), 10 flavine adenine dinucleotide(FAD), 0.5 mM MgCL 와 10% glycerolo] 용해된 0.1 M K2HPC)4(pH7.5)의 완충용액 150 mL에 넣고 homogenazer(SMT-PA)로 마쇄한 다음 8겹의 cheesecloth로 여과한 액을 27, 000g에서 20 분 동안 원심분리하여 상등액을 이용하였다. 효소 활성은 Westerfield(1945)의 방법에 따라 생성된 acetoin 의 양을 측정하였으며, 효소활성은 aoetoin에 대한 표준 곡선을 이용하였으며, 단위 시간 당 생성되는 단백질에 대한 acetoin 양으로 표시하였다.
전기영동은 50℃ 15 kV, Laser power 10m 서 실행하였으며 sequence는 ABI 310 automatic sequencer를 사용하여 결정하였다. 염기서열분석은 DNASTAR package (version 1.02, DNASTAR) 프로그램를 사용하였다.
5)의 완충용액 150 mL에 넣고 homogenazer(SMT-PA)로 마쇄한 다음 8겹의 cheesecloth로 여과한 액을 27, 000g에서 20 분 동안 원심분리하여 상등액을 이용하였다. 효소 활성은 Westerfield(1945)의 방법에 따라 생성된 acetoin 의 양을 측정하였으며, 효소활성은 aoetoin에 대한 표준 곡선을 이용하였으며, 단위 시간 당 생성되는 단백질에 대한 acetoin 양으로 표시하였다. ALS 활성 50% 를 억제하는 제초제 농도인 I50을 계산하였다.
성능/효과
두 생태형 모두 뿌리 침지 1시간 후에는 주로 근부에서만 흡수되었다. 3시간 이후부터 경엽 부위가 어느 정도 나타나기 시작하여 12 시간 후에는 근부와 경엽부에서 뚜렷하게 나타나 24시간 경과 후에는 경엽부로 이행량이 증가되고 있음을 볼 수 있었으나 생태형간 뚜렷한 차이는 구별할 수가 없었다. 따라서 물옥잠 생태형간 ALS 활성 차이의 원인은 SU계 제초제의 흡수이행 차이 때문이 아닌 것으로 생각된다.
따라서 SU계 제초제가 연용되어 우점화된 물옥잠은 조사된 모든 제초제들에 저항성이 발현되는 교차 저항성이 있었으며, 반응 정도는 제초제들 간에 서로 다르게 나타났다.
물옥잠 생태형간 ALS 유전자 영역을 포함하는 cDNA의 염기서열을 분석한 결과 그림 3과 같이 ALS 유전자 중간 영역에 염기서열을 확인할 수가 있었다. 저항성 생태형의 ALS 유전자 감수성 생태형과 다른 3개의 아미노산 서열이 존재하였는데, 168번째 threonine이 serine으로, 189번째 histidine이 arginine로, 그리고 247번째 phenylalanine이 aspartic acid으로 변이되었기 때문에 저항성을 나타내는 단백질 구조의 변형에 결정적 역할을 했을 가능성이 높다.
뚜렷한 차이가 없었다. 생태형간 이행율은 처리 후 시간이 경과할 수록 높게 나타났으며, 처리 후 3 시간까지는 감수성 생태형의 이행율이 다소 높게 나타났으나 그 이후부터 12시간까지는 저항성 생태형이다소 높았고, 24시간 후에는 감수성 생태형이 조금 높게 나타나 생태형간 뚜렷한 차이를 구별할 수 없었다.
농도인 GR50값을 나타낸 것이다. 저항성 생태형 물옥잠에 처리한 모든 제초제들의 GR50값은 감수성 생태형 보다 훨씬 높게 나타났다.
저항성 생태형에 대한 bensulfuron, cinosulfuron 그리고 pyrazosulfiiron의 GR50값은 감수성 생태형 보다 각각 40.3배, 41.6배 그리고 63.5배 높게 나타났으나 azimsulforon과 ethoxysulfUron에서는 각각 8.6배 및 4.6배 정도 높게 나타나 다른 제초제들에 비해 상대적으로 낮았다.
처리 후 6시간까지는 감수성 생태형의 흡수율이 다소 많았으나 12시간 이후부터는 오히려 저항성 생태형이 다소 높게 나타났고, 24시간 경과 후에는 생태형간 거의 차이가 없었다. 전체적으로 볼 때 식물체 뿌리에 의한 [14C]bensulfiiron의 흡수율은 생태형 간 뚜렷한 차이가 없었다.
뿌리에 의한 생태형 간 ["C]bensulfiiron의 흡수율은 처리 후 시간이 경과할 수록 증가하였으나 생태형간 일정한 차이는 없었다. 처리 후 6시간까지는 감수성 생태형의 흡수율이 다소 많았으나 12시간 이후부터는 오히려 저항성 생태형이 다소 높게 나타났고, 24시간 경과 후에는 생태형간 거의 차이가 없었다. 전체적으로 볼 때 식물체 뿌리에 의한 [14C]bensulfiiron의 흡수율은 생태형 간 뚜렷한 차이가 없었다.
표 4는 물옥잠 생태형간 ALS 활성을 측정 후 생태형 간 I50을 나타낸 것으로서 저항성 생태형의 150 값은 감수성 생태형 보다 bensulfuron, imazosulfuron 그리고 pyrassulfurcm이 각각 76배, 66배 그리고 62배 높게 나타났으며, azimsulhmm과 ethoxysulfhEe 각각 14배 및 27배 높게 나타났다. 따라서 SU계 제초제들에 대한 잡초의 생태형간 생물적 반응 차이는 이들 제초제들의 작용점인 ALS의 활성반응 차이 때문이라고 생각되어 진다.
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