96-well plate를 이용한 DPPH free radical 소거활성 측정과 그 응용 Application and High Throughput Screening of DPPH Free Radical Scavenging Activity by Using 96-Well Plate원문보기
96-well plate를 사용해서 DPPH free radical 소거활성의 고효율검정 (high throughput screening)방법을 확립하였고, 이 방법을 이용하여 107개의 식물특정 효소저해제와 다양한 식물 추출물의 항산화활성을 조사하였다. DPPH free radical 소거활성 측정 측정을 위한 적정 시험조건은 총 반응액이 $250{\mu}L$일 경우 $100{\mu}M$의 DPPH(pH 7.8), 20 분의 반응시간이었고, 이 조건하에서 ascorbate와 a-tocopherol 은 농도 의존적인 항산화활성을 나타내었다. 107개의 식물 특정효소저해제 중에서 11개의 화학물질이 $100{\mu}M$ 농도에서 70% 이상의 항산화활성이 있었는데, 특히 ampicillin과 gallic acid는 각각 90.2% 와 92.6% 의 나타냈다. 또한 100개의 식물 추출물은 $50{\mu}g/mL$ 농도에서 70% 이상의 활성을 보이는 추출물이 11개이었는데, 그 중에서 AT-407의 활성이 90.1%로 가장 높게 나타났다. 따라서 96-well plate를 이용한 DPPH free ra 이때 소거활성 측정방법은 여러가지 합성물질이나 다양한 천연물질에 대하여 보다 간편하고 신속하게 항산화활성을 측정할 수 있을 것으로 사료되었다.
96-well plate를 사용해서 DPPH free radical 소거활성의 고효율검정 (high throughput screening)방법을 확립하였고, 이 방법을 이용하여 107개의 식물특정 효소저해제와 다양한 식물 추출물의 항산화활성을 조사하였다. DPPH free radical 소거활성 측정 측정을 위한 적정 시험조건은 총 반응액이 $250{\mu}L$일 경우 $100{\mu}M$의 DPPH(pH 7.8), 20 분의 반응시간이었고, 이 조건하에서 ascorbate와 a-tocopherol 은 농도 의존적인 항산화활성을 나타내었다. 107개의 식물 특정효소저해제 중에서 11개의 화학물질이 $100{\mu}M$ 농도에서 70% 이상의 항산화활성이 있었는데, 특히 ampicillin과 gallic acid는 각각 90.2% 와 92.6% 의 나타냈다. 또한 100개의 식물 추출물은 $50{\mu}g/mL$ 농도에서 70% 이상의 활성을 보이는 추출물이 11개이었는데, 그 중에서 AT-407의 활성이 90.1%로 가장 높게 나타났다. 따라서 96-well plate를 이용한 DPPH free ra 이때 소거활성 측정방법은 여러가지 합성물질이나 다양한 천연물질에 대하여 보다 간편하고 신속하게 항산화활성을 측정할 수 있을 것으로 사료되었다.
A 96-well plate was applied to determine the DPPH free radical scavenging activity using 107 plant-specific enzyme inhibitors and 100 unknown plant-originated extracts. The final optimum volume was $250{\mu}L$ containing $100{\mu}M$ DPPH ethanolic solution at pH 7.8. In this co...
A 96-well plate was applied to determine the DPPH free radical scavenging activity using 107 plant-specific enzyme inhibitors and 100 unknown plant-originated extracts. The final optimum volume was $250{\mu}L$ containing $100{\mu}M$ DPPH ethanolic solution at pH 7.8. In this condition, the radical scavenging activities were significantly increased by two known antioxidants consisting of ascorbate and a-tocopherol in a concentration-dependent manner. Among the 107 inhibitors, ampicillin and gallic acid showed 90.2% and 92.6% antioxidant activity at $100{\mu}M$, respectively, and these results were consisted with previous findings. In the tested 100 natural materials at $50{\mu}g/mL$, antioxidant activity of AT-407 resulted in the highest of 90.1%, and 10 extracts including AT-388 and AT-443 showed over 70%. Our results suggest that the use of 96-well plate for determining DPPH free radical scavenging activity would be a suitable method to select antioxidant-like substances of both synthetic compounds and natural products.
A 96-well plate was applied to determine the DPPH free radical scavenging activity using 107 plant-specific enzyme inhibitors and 100 unknown plant-originated extracts. The final optimum volume was $250{\mu}L$ containing $100{\mu}M$ DPPH ethanolic solution at pH 7.8. In this condition, the radical scavenging activities were significantly increased by two known antioxidants consisting of ascorbate and a-tocopherol in a concentration-dependent manner. Among the 107 inhibitors, ampicillin and gallic acid showed 90.2% and 92.6% antioxidant activity at $100{\mu}M$, respectively, and these results were consisted with previous findings. In the tested 100 natural materials at $50{\mu}g/mL$, antioxidant activity of AT-407 resulted in the highest of 90.1%, and 10 extracts including AT-388 and AT-443 showed over 70%. Our results suggest that the use of 96-well plate for determining DPPH free radical scavenging activity would be a suitable method to select antioxidant-like substances of both synthetic compounds and natural products.
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문제 정의
따라서, 본 실험은 기존의 DPPH free radical 소거 활 성 측정방법을 기본으로 하여보다 간편하고 효율적인 탐색체제 (high throughput screening, HTS)를 개발하기 위하여 96-well plate를 이용한 DPPH free radical 소거 활성 측정방법을 실험실 조건에서 확립하고, 이를 식물특정 효소저해제와 다양한 천연물로부터 새로운 항산화물질을 탐색하는 데 적용해보고자 하였다.
제안 방법
Free radical 소거활성측정을 위한 적정 반응 시간을 파악하기 위하여 DPPH 농도를 100 7.8)로 고정한 후 ascorbate 농도를 10, 30, 50 “M로 처리하고, 경시적으로 40분까지 반응시키면서 5분 간격으로 흡광도의 변화를 조사하였다. 또한, DPPH 용액의 적정 농도를 조사하기 위해 pH 7.
8, 반응시간 20분으로 고정하고 10, 20, 30, 40 및 50 uM의 ascorbate와 10, 20, 30, 40, 50 및 100 pM의 a-tocopherol을 처리하였다. 또한, 107개의 효소 저해제들(HIT-series)은 최종 농도가 100 uM이 되도록 희석조제하여 처리하였고, 한국 천연물은행으로부터 확보한 10。개의 메탄올 추출물(AT-seiies)은 500 Rg/mL로 처리하고 이들 중에서 효과가 우수한 추출물들은 50 ng/mL로 재처리하여 free radical 소거능력이 우수한 화학물질 및 식물 추출 물을 선발하였다.
8)로 고정한 후 ascorbate 농도를 10, 30, 50 “M로 처리하고, 경시적으로 40분까지 반응시키면서 5분 간격으로 흡광도의 변화를 조사하였다. 또한, DPPH 용액의 적정 농도를 조사하기 위해 pH 7.8, 반응시간 20분, ascorbate 농도를 50 uM로 고정하고 DPPH 농도를 300, 100 및 25 11M로 처리하였으며, DPPH 100 11M, 반응시간 20분, ascorbate 농도 50 pN일 때 용액의 pH 를 2, 4, 6, 8 및 10으로 조절하여 적정pH를 조사하 였다
시험조건을 DPPH 100 jlM, pH 7.8, 반응시간 20분으로 고정하고 10, 20, 30, 40 및 50 uM의 ascorbate와 10, 20, 30, 40, 50 및 100 pM의 a-tocopherol을 처리하였다. 또한, 107개의 효소 저해제들(HIT-series)은 최종 농도가 100 uM이 되도록 희석조제하여 처리하였고, 한국 천연물은행으로부터 확보한 10。개의 메탄올 추출물(AT-seiies)은 500 Rg/mL로 처리하고 이들 중에서 효과가 우수한 추출물들은 50 ng/mL로 재처리하여 free radical 소거능력이 우수한 화학물질 및 식물 추출 물을 선발하였다.
5 J1L씩 첨가하여 최종 반응용액이 250 uL가 되도록 하였다. 이를 일정 시간 동안 반응시킨 후 micro-plate reader(Bio-Rad)를 사용하여 517nm에서의 흡광도 변화를 측정하였고, 무처리구와 처리구의 값을 비교하여 free radical 소거 활성을 결정하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 107개의 HIT-화합물은 여러 참고문헌을 통하여 식물에서 특정 효소를 저해한다고 보고되어 있는 화합물로써 일부 저해제를 제외하고는 항산화 작용에 대한 보고가 없는 화합물들이다. 이 107개의 HIT-화합물을 100 μM로 처리하였을 때 (자료 미제시) 11개의 저해제는 70% 이상 free radical을 소거하는 것으로 나타났다(그림 5-A).
시험에 사용한 l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), ascorbate 및 a-tocopherole Sigma(USA)사로부터 구입하였는데, 지용성 항산화제인 a-tocopherole water- soluble type(Trolox)을 사용하였다. 새로운 항산화 활성 측정은 식물 특정 효소저해 제 107개와 식물 추출물 100개를 대상으로 수행하였는데, 식물특정 효소저해제들은 문헌조사를 통하여 선정하고 이를 Sigma와 Aldrich chemical(USA)사로부터 구입하였고 (황 등, 2001), 식물 추출물은 한국 천연 물은행으로부터 확보하였다. 이들은 알파벳 순으로 정리한 HIT-일련번호와 AT-일련번호 로 간편하게 하였다.
시험에 사용한 l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), ascorbate 및 a-tocopherole Sigma(USA)사로부터 구입하였는데, 지용성 항산화제인 a-tocopherole water- soluble type(Trolox)을 사용하였다. 새로운 항산화 활성 측정은 식물 특정 효소저해 제 107개와 식물 추출물 100개를 대상으로 수행하였는데, 식물특정 효소저해제들은 문헌조사를 통하여 선정하고 이를 Sigma와 Aldrich chemical(USA)사로부터 구입하였고 (황 등, 2001), 식물 추출물은 한국 천연 물은행으로부터 확보하였다.
성능/효과
100 UM로 조제한 DPPH 용액의 pH를 HC1 및 NaOH를 사용하여 2, 4, 6, 8 및 10으로 조정한 다음 ascorbate 농도 50 J1M, 반응시간 20분의 조건에서 free radical 소거 활성을 측정한 결과, DPPH 용액의 pH 2에서 8까지는 free radical 소거활성에 별다른 영향이 없었으며, pH 10에서만 소거 활성에 영향을 미치는 것으로 나타났다(그림 3).
100개의 식물 추출물을 500 lig/mL 농도로 처리하였을 때 30여개의 추출물들이 free radical 소거 활성을 보여(자료 미저}시) 50 Ug/mL 농도로 재처리하였는데, 이 농도에서 11개의 추출물들은 70% 이상의 free radical 소거활성을 나타내었다 (그림 5-B).
8, 반응시간 20분, ascorbate 농도 50 11M의 시험조건에서 DPPH 농도를 달리하였을 경우, free radical 의 소거 활성 정도는 DPPH 농도가 100 J1M일 때 free radical 소거반응이 직선적으로 증가하였으며, 20분 후에는 90% 이상이 소거되었으므로 가장 적합한 것으로 사료되었다 (그림 2). DPPH 300 pM 처리에서는 free radical 소거 활성이 증가되었지만 반응 20분 후에도 그 활성은 50% 이하였으며, DPPH 농도가 25 J1M인 경우 ascorbate의 첨가에 의해 8분 이내에 free radical 소거반응이 종료되었지만, 그 정도는 80% 이하로 나타나 상호간의 농도 조합이 적합하지 않았다. 그러나, DPPH 농도 또한 실험자에 따라서 다양하게 보고되어 (Abe 등, 1998b; Martin 등, 2000; Kikuzaki 등, 2002; Ogata 등, 2002) 있으므로, 각각의 검색 시료에 따라 적당한 DPPH 농도를 선정해야 할 것으로 생각되었다.
반응액의 pH에 따라 검색하고자 하는 시료의 물리적인 성질이 변할 수 있으므로 검색 시료가 가지고 있는 항산화능도 달라질 수 있기 때문에 DPPH 용액 의 pH는 상당히 중요한 역할을 할 것으로 생각할 수 있다. 그러나 본 실험에서는 강산~약알칼리까지 free radical 소거활성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 DPPH 용액의 pH는 크게 고려하지 않아도 될 것으로 생각되었다. 왜냐하면 실제로 에탄올에 용해시킨 100 pM DPPH 용액은 pH가 7.
그러나 ascorbate 50 J1M 농도에서는 free radical의 소거 활성이 급격하게 증가하여, 20분 후에는 90% 이상의 높은 소거 활성을 나타내었다. 따라서, 본 실험 조건에 서의 적합한 ascorbate의 농도는 50 11M 인 것으로 사료 되었다
반응용액의 pH 7.8, 반응시간 20분, ascorbate 농도 50 11M의 시험조건에서 DPPH 농도를 달리하였을 경우, free radical 의 소거 활성 정도는 DPPH 농도가 100 J1M일 때 free radical 소거반응이 직선적으로 증가하였으며, 20분 후에는 90% 이상이 소거되었으므로 가장 적합한 것으로 사료되었다 (그림 2). DPPH 300 pM 처리에서는 free radical 소거 활성이 증가되었지만 반응 20분 후에도 그 활성은 50% 이하였으며, DPPH 농도가 25 J1M인 경우 ascorbate의 첨가에 의해 8분 이내에 free radical 소거반응이 종료되었지만, 그 정도는 80% 이하로 나타나 상호간의 농도 조합이 적합하지 않았다.
생물체는 이러한 ascorbate의 항산화 작용에 의해 각종 효소 활성의 저중}, 색소체 및 생체막의 파괴 등과 같은 산화스트레스로부터 생체를 보호할 수 있게 된다 (Foyer 와 Halliwell, 1976; Gorden 과 Beck, 1979; Nakano와 Asada, 1980).본 실험 방법을 적용하여 측정한 ascorbate의 항산화 활성은 농도의존적인 반응을 보였는데(그림 4-A), DPPH 용액 100 μM, pH 7.8, 반응시간 20분의 시험조건에서 ascorbate 농도를 10, 20, 30, 40 및 50 pM로 처리하였을 때 free radical 소거 활 성은 각각 24.6, 46.7, 70.0, 89.8 및 95.2%로 증가하였다. 또한 이 결과는 DPPH free radical 소거에 관련된 기존의 연구결고eMartin 등, 2000; Kikuzaki 등, 2002; Ogata 등 20Q2)와도 유사한 경향이었다.
후속연구
이 중에서 D-alanine carboxypeptidase I 저해제인 HIT-17 (ampicillin) 고} phenylalanine ammonia lyase 저주〕] 제인 HlT-28(chlorogenic acid), HIT-5 l(ferulic acid) 및 HIT-52(gallic acid) 등은 90% 이상의 free radical 소거 활성을 보였고, phenylalanine ammonia lyase 저해제인 HIT-24(caffeic acid), polyphenol oxidase 저해제인 HIT-65(kojic acid), lipoxygenase 저해제인 HIT-75 (nordihydroguaiaretic acid) 와 amine oxidase 저해제인 HIT-84(phenylhydrazine) 등은 85% 이상의 소거 활성을 발휘하는 것2로 나타냈으며, 이들에 대한 선행 연구 결과(Cuvelier 등 , 1992; Carrer 등, 1998; No 등, 1999;Burdock등, 2001; Kikuzaki 등, 2002; Kweon 등, 2001; Bhasin 등, 2002; Imai 등, 2002) 와도 유사한 경향을 나타냈다. 그러나, HIT-74(niclosamide), HIT-92 (pyridoxal), HIT- 104(tranylcypromine) 등에 대한 항산화관련 연구보고는 발견할 수 없었으며, 이물질들의 활용가치는 추가적으로 검토되어야 할 것이다.
3%로 나타나 다른 연구결고KMartin 등, 2000; Kikuzaki 등, 2002)와 유사한 경향을 나타냈다. 따라서 96-well plate를 이용한 free radical 소거 활성 측정방법은 ascorbate 와 a -twopherol에 대한 다른 연구 결과와 유사하기 때문에 보다 효과적으로 많은 화학물질들의 항산화 활성을 측정할 수 있을 것으로 사료된다.
한편, AT-407은 조추출물(crude extract)임에도 불구하고 50 llg/mL에서도 free radical 소거 활성이 90.1%로 높게 나타나 천연물 유래의 새로운 항산화제로서의 가능성에 대한 검토가 필요할 것으로 생각되었다.
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