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문제 정의
- 본 연구는 최근 수요가 늘어나고 있는 녹즙의 생리활성효능에 대한 검증의 한 방법으로 녹즙시료들의 항산화능을 측정 비교하고, 그들의 DNA 손상 보호효과에 대해 살펴보았다. 케일, 명일엽, 돌미나리, 당근 중, 항산화능이 가장 좋은 식품소재는 케일이었으며, 역시 DNA 손상의 보호효과에서도 케일이 가장 우수한 것으로 나타났다.
- 본 연구는 케일(kale), 명일엽(혹은 신선초, Angelica keishei), 당근(carrot), 돌미나리 (small water dropwort) 녹즙의 항산화능을 측정하여 비교해 보고, 여러 녹즙의 산화적 DNA 손상 보호효과를 comet assay를 이용한 CHL 세포 배양실험을 통하여 관찰하여 비교해 보려는 목적으로 시도되었다.
- 的 당근에 들어있는 대표적인 항산화 물질인 6-carotene에 대한 연구는 상당히 많은데 비해, 당근 자체의 생리활성에 관한 연구는 많지 않다. 본 연구에서는 당근의 생리활성 연구의 하나로 당근녹즙에 DNA 손상 억제 효과가 있음을 관찰하였으며, 이는 당근에 함유된 bioactive molecule이 세포 내로 흡수되어 DNA 손상 억제의 생리활성을 보인 것을 생각된다. 이와 같은 결과는 앞으로 인체 영양 중재 연구를 계획할 때, 6-carotene 등 단일 항산화제 보충보다는 식품으로의 보충섭취를 권장하는데 사용될 수 있으리라 생각된다.
제안 방법
- Comet image 분석을 위해 20 “g/ml 농도의 ethidium bromide로 nucleotides# 염색하여 형광현미경 (Leica DMLB, Germany) 에서 관찰하고 CCD camera를 통해 보내진 각각의 세포핵 image는 comet image analyzing system이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 임파구의 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리 (tail length, TL) 또는 tail length에 tail내 함유된 DNA%를 곱해준 tail moment (TM) 값을 측정하여 나타내었으며 각처리구 당 2개의 slide를 만들어 그 중에서 각각 100개 세포를 관찰하여, HQ?에 의한 DNA 손상 및 녹즙에 의한 DNA 손상 억제정도를 측정하였고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- 이 방법의 원리는 각 시료를 6분 동안 300에서 배양한 후 UV/VIS spectrophotometer로 740 nm의 파장에서 absorbance를 측정하면, 그 absorbance 의 억제 정도는 시료에 들어있는 antioxidant capacity에 비례하게 되는 것에 기초를 두고 있다. TRAP 농도는 trolox의 calibration curve를 이용하여 계산하였으며 TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity, mM)으로 표현하였다.
- 동결 건조한 녹즙 시료의 농도 범위 (25-250 “g/mD 는, 예비실험을 거쳐 효과가 거의 나타나지 않는 저농도와, 독성이 나타나기 시작하는 고농도를 제외한 후 선정하였으며, 시료의 DNA 손상정도는 positive control과 negative control의 범주 내에 속하였다. 따라서, 본 실험에서는 녹즙 시료를 25~250 “g/ml의 농도가 되게 PBS로 희석한 후 CHL cell이 배양되어있는 각각의 well에 처리하였고, 각 녹즙 처리 세포를 PBS 처리 세포 (control) 와 함께 37℃ CO2 incubator에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 범주 내에 속하였다. 따라서, 본 실험에서는 녹즙 시료를 25~250 “g/ml의 농도가 되게 PBS로 희석한 후 CHL cell이 배양되어있는 각각의 well에 처리하였고, 각 녹즙 처리 세포를 PBS 처리 세포 (control) 와 함께 37℃ CO2 incubator에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후에는 PBS로 두 번 세척한 다음, 0.
- 또한 in vittv 세포배양 실험을 위해서는 위의 과정을 거친 후 milipore filter (0.45 “m)로 여과 멸균하여 나온 녹즙 액을 동결 건조시킨 후 멸균한 PBS (phosphate-buffered saline) 에 적당한 농도로 녹여 eppendorf tube에 옮겨 -80℃ 냉동고에 보관하면서 comet assay실험에 사용하였다.
- 05 수준에서 평가하였다. 또한 각 시료들의 농도별 DNA 손상값들을 이용하여 linear regression analysis를 한 후, positive control에 비해 DNA 손상을 50% 감소시킬 수 있는 녹즙의 농도를 계산하여 EDs의 값을 계산하였으며 이 값으로 각 녹즙의 DNA 손상 보호효과를 비교하였다.
- 산화 스트레스에 의한 DNA 손상을 유발시키기 위해, 200 “M HQ를 준비하여 상층액을 제거한 CHL cell에 처리한 후 4℃ 냉장고에서 5분 동안 반응시킨 다음 PBS 로 세척하였다. Positive control을 위해 녹즙을 처리하지 않고 PBS만 처리된 cell에 200 “M 压。2를 처리하였으며, negative control인 PBS 처리세포에는 H2O2를 처리하지 않았다.
- 관찰하여, HQ?에 의한 DNA 손상 및 녹즙에 의한 DNA 손상 억제정도를 측정하였고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- 위에 제시한 일련의 과정을 마친 cell의 DNA 손상을 측정하기 위해 comet assay를 실시하였다. Normal melting agarose (NMA)가 precoating된 fully frosted slide 위로 CHL 세포와 75 “1의 0.
- 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 임파구의 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리 (tail length, TL) 또는 tail length에 tail내 함유된 DNA%를 곱해준 tail moment (TM) 값을 측정하여 나타내었으며 각처리구 당 2개의 slide를 만들어 그 중에서 각각 100개 세포를 관찰하여, HQ?에 의한 DNA 손상 및 녹즙에 의한 DNA 손상 억제정도를 측정하였고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
대상 데이터
- 녹즙은 (주)풀무원에서 제조, 판매되고 있는 100% 케일 (Brassica oleracea van acephala), 명일엽 (Angelica keiskei), 당근 (Daucus carta L), 돌미나리 (Small water dropwort, Oenanthe stolonifera DC) 녹즙을 제공받아 즉시 4℃, 9, 000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후 항산화능 측정을 위해 별도의 시험관에 분주하였다. 또한 in vittv 세포배양 실험을 위해서는 위의 과정을 거친 후 milipore filter (0.
- 많이 入용되는 세포이다. 본 실험에서 入卜용한 CHL celle 한국화학연구원 안전성 평가연구소 독성유전체 연구팀으로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS) 과 Eagle1 s minimum essential medium을 사용하여, 포화습도 하에서 5% CO2t 공급흐}는 37℃의 incubator에서 배양하였다. 계대 배양은 cell을 75 cm2 tissue culture flask 에 60X104 cell이 되도록 파종하여 2~3일간 배양한 후 시행하였고, 시험물질 처리 시에는 6—well plate에 well당 2X104 cell이 되도록 파종하여 48시간 배양한 후 실험하였다.
데이터처리
- 처리하였다. 각 처리구별로 100개의 세포에서 측정한 DNA 손상도(TL, TM, % DNA in tafl) 의 평균값과 표준오차를 구하였으며, 각 녹즙의 DNA 손상 억제 정도를 비교하기 위해 농도별로 one-way 분산분석 (AN0 VA)을 시행하였고, 두 군간의 차이는 LSD로 사후 검증하였으며, 모든 통계적 유의성은 p< 0.05 수준에서 평가하였다. 또한 각 시료들의 농도별 DNA 손상값들을 이용하여 linear regression analysis를 한 후, positive control에 비해 DNA 손상을 50% 감소시킬 수 있는 녹즙의 농도를 계산하여 EDs의 값을 계산하였으며 이 값으로 각 녹즙의 DNA 손상 보호효과를 비교하였다.
이론/모형
- TRAPe Rice-Evans & Millere의 inhibition assay 법에 따라 분석하였다. 이 방법은 ABTS (2, 2Z -azinobis (3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonate), 150 “M)와 metmyoglobin (2.
성능/효과
- 이상의 결과를 regression analysis를 통해 ED50 (50%의 DNA 손상 보호효과를 보이는 녹즙의 농도)을 계산하여 DNA 손상 억제효과에 대한 순위를 알아본 결과, 케일 (39.4 “g/mL), 명일엽(60.1 “g/mL), 돌미나리 (74.0 "g/mL), 당근 (85.9 “g/mL)의 순으로 나타났다(Fig. 5). 각 녹즙의 이와 같은 생리활성 기능은 선행연구에서 보고된 식품내 항산화 영양소의 함량이 높은 것, 그리고 본 연구에서 TRAP 분석법을 이용하여 측정한 바 총 항산화 능이 높은 것 (Table 1)과 관련이 있는 것으로 볼 수 있다.
- Comet assay의 image 분석 결과, 각 시료들의 DNA 손상의 억제효과는 Fig. 1 - 4에서 볼 수 있으며 모든 녹즙 시료에서 positive control에 비해 DNA 손상 억제효과가 나타났다. 각 녹즙의 농도별 DNA 손상 억제 효과를 살펴보면, 먼저 케일은 낮은 농도 (25 “g/ml)에서 positive control와 비교하여 50%의 높은 DNA 손상 감소를 볼 수있었고, 농도가 증가함에 따라 그 억제효과가 더 나타나 250 “g/ml에서는 70%의 억제효과를 보였다 (Fig.
- 如 이 외에도, 항암 활성이 있는 플라보노이드인 quercetin (110 ㎎/㎏) 과 kaempferol (211 ㎎/㎏) 의 함량이 다른 채소들보다 다량 포함되어 있다고 보고되어 있다.刼 따라서, 본 연구에서 TRAP 분석법을 이용한 항산화능이 케일에서 가장 높았던 것은 케일의 항산화 영양소 함량이 높은 것과 관련되어 있다고 볼 수 있다. 국내외를 막론하고 녹즙의 항산화 영양소 함량 보고는 많으나, 총 항산화능을 보고한 연구는 아직 없다.
- 5). 각 녹즙의 이와 같은 생리활성 기능은 선행연구에서 보고된 식품내 항산화 영양소의 함량이 높은 것, 그리고 본 연구에서 TRAP 분석법을 이용하여 측정한 바 총 항산화 능이 높은 것 (Table 1)과 관련이 있는 것으로 볼 수 있다.
- 녹즙 시료들의 총 항산화능을 측정한 결과, 케일 (kale)에서 가장 높고, 명일엽, 돌미나리 그리고 당근의 순으로 나타났다 (Table 1). 즉, 녹색채소들의 TRAP 값이 황색채소인 당근보다 전반적으로 높음이 확인되었다.
- 3). 돌미나리의 경우도 당근과 마찬가지 경향으로 저 농도인 25, 50 “g/ml에서 각각 32%, 40%의 억제효과가 나타났고, 농도가 증가함에 따라 DNA 손상 억제효과가 농도 의존적으로 증가하여 100 “g/ml에서 60%, 250 “g/m】에서 63%를 보였다 (Fig. 4).
- 본 연구 결과를 요약하여 보면, 첫째, 각 녹즙들의 항산화능을 측정비교한 결과 케일, 명일엽, 돌미나리, 당근 모두에게서 항산화능을 관찰할 수 있었으며, 항산화능의 순서는 케일 > 명일엽 > 돌미나리 > 당근으로 나타났다. 둘째, 녹즙의 항돌연변이 효과로서 DNA 손상 억제효과를 통해 살펴본 결과, 본 실험에서 사용한 녹즙 4종류 모두에서 DNA 손상억제 효과가 나타났으며 DNA 손상 억제효과가 가장 큰 순서로 보면, 케일 > 명일엽 > 돌미나리 > 당근의 순으로 항산화능의 순서와 일치하였다. 본 연구 결과 나타난 녹즙의 항산화 능력 및 DNA 손상 억제 효과를 이용하여, 앞으로 동물이나 인체를 이용한 in vivo 생리활성효과 연구, 특히 흡연자나 환자 등 DNA가 많이 손상되어 있는 대상자들의 DNA 손상 회복을 위한 녹즙 보충섭취 영양중재연구 등이 더 깊게 이루어져야 하리라고 본다.
- 본 연구 결과, TRAP으로 측정한 총 항산화능이나, DNA 손상 억제효과에 있어서 여러 녹즙 중 케일 녹즙이 가장 탁월한 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 몇 연구자들이 in vitro 세포실험을 통해 케일 녹즙에 항 돌연변이 생리활성이 있음을 보고한 결과들32"과 일치한다.
- 케일, 명일엽, 돌미나리, 당근 중, 항산화능이 가장 좋은 식품소재는 케일이었으며, 역시 DNA 손상의 보호효과에서도 케일이 가장 우수한 것으로 나타났다. 본 연구 결과를 요약하여 보면, 첫째, 각 녹즙들의 항산화능을 측정비교한 결과 케일, 명일엽, 돌미나리, 당근 모두에게서 항산화능을 관찰할 수 있었으며, 항산화능의 순서는 케일 > 명일엽 > 돌미나리 > 당근으로 나타났다. 둘째, 녹즙의 항돌연변이 효과로서 DNA 손상 억제효과를 통해 살펴본 결과, 본 실험에서 사용한 녹즙 4종류 모두에서 DNA 손상억제 효과가 나타났으며 DNA 손상 억제효과가 가장 큰 순서로 보면, 케일 > 명일엽 > 돌미나리 > 당근의 순으로 항산화능의 순서와 일치하였다.
- 최근 명일엽 녹즙의 동물실험을 통한 in vivo 생리활성기능에 관한 연구가 몇 편 보고 되었는데, 정 등"은 명일엽 녹즙이 간 손상을 유발한 흰쥐의 간기능 개선에 미치는 영향을 살펴보아 간 기능 보호 기능의 가능성을 제시하였으며, 박 등", 은 명일엽이 흰쥐의 지질대사에 미치는 영향을 살펴보아, 혈장 콜레스테롤감소 효과를 보고하였다. 본 연구 결과에서도 명일엽 녹즙이 비교적 높은 총 항산화능과, DNA 손상 억제효과를 보여, 명일엽 녹즙의 항 돌연변이 효과를 확인할 수 있었다.
- "' 널리 알려진 ATBC (alphatocopherol and beta-carotene) 종단연구에서 흡연자에게 伊-carotene을 supplement로 주고 폐암 발생율을 관찰한 결과, 기대와는 달리 B-carotene 투여가 오히려 발암을 촉진하는 결과가 가져오는 것이 보고된'” 반면, carotene이 많이 함유되어 있는 녹황색채소 및 과일, 고구마 등의 섭취량이 높은 사람이 일반적으로는 위암, 대장암, 유방암 발생이 낮은 것이 보고되어⑫ 식품의 특정성분을 분리하여 섭취하는 것보다 식품 자체를 섭취하는 것이 암예방에 보다 더 유리할 수 있다는 사실이 입증되고 있다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 연구에서도 8-carotene 함량이 가장 높은 당근 (5.9 ± 0.5 “g/100g) 이 항산화능과 DNA 손상 감소 효과가 비교적 높을 것으로 예상하였지만, 》실제로 TRAP 값이나, DNA 손상 보호 효과의 정도또한 모든 녹즙들 중에서 가장 낮은 것으로 나타났다. 이는 아마도 8-carotene을 식품의 일부로 섭취하였을 때의 bioavailability7]- 정제된 6-carotene의 bioavailability보다 저하되었다는 연구결과로부터 설명될 수 있을 것이다尸
- 2). 이에 비해 당근은 25, 50 “g/ml에서 각각 38%, 32%의 억제효과가 나타났고, 농도가 증가함에 따라 DNA 손상 억제효과가 증가하여 100 “g/ml에서 50%, 250 “g/ml에서 70%를 보였다 (Fig. 3). 돌미나리의 경우도 당근과 마찬가지 경향으로 저 농도인 25, 50 “g/ml에서 각각 32%, 40%의 억제효과가 나타났고, 농도가 증가함에 따라 DNA 손상 억제효과가 농도 의존적으로 증가하여 100 “g/ml에서 60%, 250 “g/m】에서 63%를 보였다 (Fig.
- (Table 1). 즉, 녹색채소들의 TRAP 값이 황색채소인 당근보다 전반적으로 높음이 확인되었다. 케일은 십자화가 채소들 중의 하나로서 다량의 엽록소와 양질의 단백질을 함유하고 있으며 비타민 C, B-carotene 및 무기질 함량이 높아 영양적으로 가치가 있는 식품소재로 알려져 있다29.
- 케일, 명일엽, 돌미나리, 당근 중, 항산화능이 가장 좋은 식품소재는 케일이었으며, 역시 DNA 손상의 보호효과에서도 케일이 가장 우수한 것으로 나타났다. 본 연구 결과를 요약하여 보면, 첫째, 각 녹즙들의 항산화능을 측정비교한 결과 케일, 명일엽, 돌미나리, 당근 모두에게서 항산화능을 관찰할 수 있었으며, 항산화능의 순서는 케일 > 명일엽 > 돌미나리 > 당근으로 나타났다.
후속연구
- 둘째, 녹즙의 항돌연변이 효과로서 DNA 손상 억제효과를 통해 살펴본 결과, 본 실험에서 사용한 녹즙 4종류 모두에서 DNA 손상억제 효과가 나타났으며 DNA 손상 억제효과가 가장 큰 순서로 보면, 케일 > 명일엽 > 돌미나리 > 당근의 순으로 항산화능의 순서와 일치하였다. 본 연구 결과 나타난 녹즙의 항산화 능력 및 DNA 손상 억제 효과를 이용하여, 앞으로 동물이나 인체를 이용한 in vivo 생리활성효과 연구, 특히 흡연자나 환자 등 DNA가 많이 손상되어 있는 대상자들의 DNA 손상 회복을 위한 녹즙 보충섭취 영양중재연구 등이 더 깊게 이루어져야 하리라고 본다.
- 여러 종류의 phytoestrogen의 DNA 손상 억제효과를 comet assay로 살펴 본 Sierens 등1'"은 genistein, equol, vitamin C 등의 DNA 손상 억제 효과를 각각 농도별로 분석하였을 뿐, 각 물질의 효능을 EI爲와 같은 지표를 구하여 비교하지는 않았는데, 이는 각 화합물이 세포 내로 흡수되는 시간이 다르거나, 각 화합물이 처리되는 세포의 종류, 혹은 그 세포가 암세포인지 정상세포인지의 여부에 따라 그 결과가 일관성 없이 나타나기 때문이라고 하였다. 앞으로 여러 항산화 식품들의 DNA 손상 억제 효과를 비교하는 방법 및 지표 개발에 대한 다양한 연구가 심도있게 이루어져야 하리라고 본다.
- 본 연구에서는 당근의 생리활성 연구의 하나로 당근녹즙에 DNA 손상 억제 효과가 있음을 관찰하였으며, 이는 당근에 함유된 bioactive molecule이 세포 내로 흡수되어 DNA 손상 억제의 생리활성을 보인 것을 생각된다. 이와 같은 결과는 앞으로 인체 영양 중재 연구를 계획할 때, 6-carotene 등 단일 항산화제 보충보다는 식품으로의 보충섭취를 권장하는데 사용될 수 있으리라 생각된다.
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