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문제 정의
- 그러므로 세포 외로 분비되는 단백질 분해효소 중 하나인 콜라겐분해효소의 성질을 파악한다면 다른 독소 단백질들과의 관계를 확인할 수 있는 밑거름이 될 뿐만 아니라 궁극적으로 식중독에 원인이 되는 요소들을 밝힐 수 있을 것이라 사료된다. 본 연구실에서는 이미 V. pamhaemolgticus 가 생산하는 콜라겐분해효소에 대한 유전자를 클로닝 하였고, 이 효소의 유전적인 특성을 검토하였다[7]. 본 연구에서는 클론된 이 효소의 유전자를 발현벡터에 삽입하여 대장균에서 재조합효소를 발현시키고 분리하여 효소적 특성을 검사하였다.
- pamhaemolgticus 가 생산하는 콜라겐분해효소에 대한 유전자를 클로닝 하였고, 이 효소의 유전적인 특성을 검토하였다[7]. 본 연구에서는 클론된 이 효소의 유전자를 발현벡터에 삽입하여 대장균에서 재조합효소를 발현시키고 분리하여 효소적 특성을 검사하였다.
제안 방법
- 이러한 분해능은 대장균만을 배양했을 때는 활성이 나타나지 않는 것으로 보아 비브리오균에서 유래함을 알 수 있었다. E. coli JM109이 생산하는 효소의 수율이 그다지 높지 않았기 때문에 더 높은 수율의 효소를 얻기 위하여 강력한 T7lac 프로모터를 함유한 PET-29b 발현벡터에 콜라겐분해효소의 유전자를 클로닝 시켜서 효소의 생산능을 검토하였다. PCR로 얻어진 이 효소의 유전자부분을 위의 벡터에 삽입하여 재조합벡터인 pCOL3를 구축하고, IPTG에 의하여 조절되는 E.
- coli JM109이 생산하는 효소의 수율이 그다지 높지 않았기 때문에 더 높은 수율의 효소를 얻기 위하여 강력한 T7lac 프로모터를 함유한 PET-29b 발현벡터에 콜라겐분해효소의 유전자를 클로닝 시켜서 효소의 생산능을 검토하였다. PCR로 얻어진 이 효소의 유전자부분을 위의 벡터에 삽입하여 재조합벡터인 pCOL3를 구축하고, IPTG에 의하여 조절되는 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하여 형질전환체를 얻은 후, LB 배지를 이용하여 기질로서 type I collagen을 가지고 콜라겐 분해 정도를 측정하였고, 효소의 생산성을 검사하였다. 대부분의 효소활성이 배양 상등액에서 나타났으며, 효소의 활성은 약 5 units/M로 비브리오균의 배양 상등액에서 얻어진 0.
- 기존에 클로닝된 콜라겐분해효소의 효소활성을 대장균에서 확인하기 위하여 일차적으로 pUC19을 이용한 재조합 벡터 pCOL2에서 활성을 검사하였으며, E. coli JM109에서 gelatin을 기질로 사용하였을 때 LB 한천배지에서 투명 환을 볼 수 있었다(결과 미제시). 이러한 분해능은 대장균만을 배양했을 때는 활성이 나타나지 않는 것으로 보아 비브리오균에서 유래함을 알 수 있었다.
- 1 mM IPTG를 첨가하여 효소의 생산을 유도하였다. 생산된 효소는 원심분리한 후, 효소의 활성을 측정하였다. 배양 상등액을 유안 80%로 단백질을 24시간동안 침전시키고, 침전된 단백질을 원심분리하여 회수한 후, 50 mM Tris-HCl 용액(pH 7.
- 식중독 병원균인 장염비브리오균 (V. parahaemolyticus)의세포외 분비 효소 중 콜라겐분해효소를 발현벡터인 pET-29b에 클로닝시키고 대장균에서 발현시킨 다음, 부분 정제하여 그 특성을 조사하였다. V.
- 5 사이의 부근에서 안정성이 높았으나 pH 5 이하의 산성에서는 급격히 떨어졌다. 이 효소에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위해 20~80C까지 변화시켜 활성을 조사하였다. Fig.
- 콜라겐분해효소의 유전자가 pUC19 벡터에 삽입된 pOOL2를 Ndel primer (5'-AGGACCCATATGGAACTGAAAACCC-3') 와 Xhol primer (S-TCTCCGCTCGAGGTCTCGGCAAGCT-3, ) 를 사용하여 PCR을 수행하고, 두 제한효소로 절단한 다음 동일 제한효소로 절단된 pET-29b에 클로닝하였다. PCRe 95℃ 에서 2분간 반응시키고, 95℃ 에서 1분, 55℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2분간 반응을 30번 반복한 후, 최종적으로 72℃ 에서 7분간 반응하여 완성하였다.
- 얼음물로 반응액을 식힌 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성 (specific activity)은 1 ml rtf을 이용하여 1분당 생성된 leucine의 1 μmole에 상응하는 양으로 정하였다. 펩타이드 기질인 Z-GPGGPA의 분해능에 대한 방법은 다음과 같다.
대상 데이터
- 각각의 시료는 3% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol을 함유한 0.0625 M Tris buffer(pH 6.8)에 가하여 100℃에서 5 분간 변성시킨 후, 사용하였다. 이 시료를 4.
- 발현벡터인 pCOL3는 E. coli BL21(DE3) 세포에 형질 전환하여 30 μg/ml의 kanamycin에 대한 저항성이 있는 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 여러번 계대배양하며 벡터의 안정화를 꾀하였다.
- coli는 LB 배지에서 37℃로 배양시켰으며, 필요에 따라 kanamycin을 30 /zg/nU의 농도로 첨가하였다. 비브리오균은 tryptic soy broth에서 유지시키거나 1.5% NaCl이 첨가된 brain heart infusion 배지를 사용하였다. 배양온도는 30 ~37℃ 에서 진탕배양 하였다.
- 장염 비브리오균인 Vibrio parahaemolyticus 04 (sero type-National Institute of Infectious Disease, Japan)은 부산대학교 주진우 교수님 연구실에서 분양받았고, 대장균은 발현 숙주로 E. coli JM109과 E. coli BL21(DE3)를 각각 사용하였다. 대장균에서 발현벡터로 pET-29b가 사용되었다.
이론/모형
- 각 정제단계에서의 단백질의 순도는 Laemmli법[11]에의한 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 시행하여 확인하였다. 각각의 시료는 3% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol을 함유한 0.
- 1 N acetic acid 1 ml을 이용하여 반응을 정지시켰다. 생성된 free alpha-amino acid의 증가를 ninhydrin 방법으로 측정하였다[20]. 반응 혼합물은 10분간 원심분리 후, 0.
- 5 ㎖을 이용하여 반응을 정지시켰다. 생성된 free alpha-amino acid의 증가의 초기속도를 ninhydrin 방법으로 측정하였다.
- 1% Coomassie brilliant blue R-250으로 염색한 후 탈색하였다. 시료중 단백질의 농도는 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Lowry법 [13]을 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- E. coli에서 대량 발현된 효소를 정제하기 위해 Hi-Trap chelating과 gel filtration 크로마토그래피법을 사용하였고,부분정제된 효소의 전체 단백질의 양은 0.5 mg정도로 73% 의 수율과 43.7배의 농축효과를 나타내는 것으로 판명되었다 (Table 2). Gel filtration을 통해 모아진 효소액을 12% SDS-polyacrylamide gel 을 수행하여 Fig.
- 이 효소에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위해 20~80C까지 변화시켜 활성을 조사하였다. Fig. 3과 같이 35℃ 에서 최적활성을 보였고, 효소를 각 온도별에서 15분간 열처리한 후 잔존활성을 실험한 결과 55℃까지는 90% 잔존 활성을 유지하며 안정성을 유지하였으나 60C에서는 약 50%의 잔존활성을 나타내었고, 그 이상의 온도에서는 효소활성이 거의 실활되는 것으로 나타났다.
- 7배의 농축효과를 나타내는 것으로 판명되었다 (Table 2). Gel filtration을 통해 모아진 효소액을 12% SDS-polyacrylamide gel 을 수행하여 Fig. 1에 나타난 바와 같이 밴드를 확인할 수 있었으며, 표준단백질과 비교한 결과 약 35 kDa으로 추정되었다. 이러한 콜라겐분해효소의분자량은 기존에 연구된 Clostridium histolyticuni[1]과 V.
- 이 효소의 최적 pH 및 온도는 6~12와 35℃이었고, 온도 안정성 조사에서 55℃ 까지는 90% 잔존 활성을 유지하였으나 60℃이상에서는 급격하게 효소활성이 실활되었다. 기질특이성 조사에서 type I collagen과 콜라겐분해효소의 합성 기질로 알려진 Z-GPGGPA에서 gelatin과 casein에 비해 높은 활성을 보이는 것으로 보아 이 효소가 진정한 콜라겐분해효소라는 것을 알 수 있었다.
- coli BL21(DE3)에 형질전환하여 형질전환체를 얻은 후, LB 배지를 이용하여 기질로서 type I collagen을 가지고 콜라겐 분해 정도를 측정하였고, 효소의 생산성을 검사하였다. 대부분의 효소활성이 배양 상등액에서 나타났으며, 효소의 활성은 약 5 units/M로 비브리오균의 배양 상등액에서 얻어진 0.15 units/iM보다 약 50 배정도 높아짐을 알 수 있었다 (Table 1). 그러나 생산된 효소는 부분 정제하는 중에 변성에 의하여 상당량의 효소의 실활이 일어남을 알 수 있었다.
- 0까지 넓은 범위에서 최적활성을 보였다. 또한 pH의 안정성을 조사하기 위해 4℃ 에서 각기 다른 pH 완충액에서 1시간 반응시킨 후, 잔존활성을 측정한 결과 pH 5.5에서 11.5 사이의 부근에서 안정성이 높았으나 pH 5 이하의 산성에서는 급격히 떨어졌다. 이 효소에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위해 20~80C까지 변화시켜 활성을 조사하였다.
- 부분정제된 콜라겐분해효소가 기질인 type I 콜라겐 외에도 어떠한 기질을 이용하는지를 조사하기 위하여 gelatin, casein, elastin, 그리고 합성기질인 Z-GPGGPA를 사용하여 기질 특이성을 조사한 결과, Fig. 4와 같이 gelatin, casein, 그리고 Z-GPGGPA에는 반응을 보인 반면, elastin 에는 전혀 반응을 나타내지 않았다. 활성의 정도도 type I collagen과 콜라겐분해효소의 합성기질로 알려진 Z-GPGGPA 에는 높은 활성을 보였다.
- 7의 정제 도를 나타내었으며, 전기영동시 분자량은 약 35 kDa로 나타났다. 이 효소의 최적 pH 및 온도는 6~12와 35℃이었고, 온도 안정성 조사에서 55℃ 까지는 90% 잔존 활성을 유지하였으나 60℃이상에서는 급격하게 효소활성이 실활되었다. 기질특이성 조사에서 type I collagen과 콜라겐분해효소의 합성 기질로 알려진 Z-GPGGPA에서 gelatin과 casein에 비해 높은 활성을 보이는 것으로 보아 이 효소가 진정한 콜라겐분해효소라는 것을 알 수 있었다.
- coli JM109에서 gelatin을 기질로 사용하였을 때 LB 한천배지에서 투명 환을 볼 수 있었다(결과 미제시). 이러한 분해능은 대장균만을 배양했을 때는 활성이 나타나지 않는 것으로 보아 비브리오균에서 유래함을 알 수 있었다. E.
- 정제효소의 pH의 영향을 조사하기 위해 100 mM acetate buffer(pH 3-5.5), phosphate buffer(pH 5.5-7), Tris-HCl(pH 7-9), boric acid/NaOH buffer(pH 9-10.5), Na2HPO4/NaOH buffer(pH 10.5-12)를 사용하여 35℃ 에서 각 pH 별로 30 분간 반응시켜 활성도를 측정한 결과 효소의 반응 최적 pH는 Fig. 2와 같이 약 6.0에서 12.0까지 넓은 범위에서 최적활성을 보였다. 또한 pH의 안정성을 조사하기 위해 4℃ 에서 각기 다른 pH 완충액에서 1시간 반응시킨 후, 잔존활성을 측정한 결과 pH 5.
후속연구
- 이때 우선적으로 숙주세포의 표면 단백질층을 분해하여야 하는데 이때 세포외 효소들이 그 역할을 직접 또는 간접적으로 관여한다고 추측된다. 그러므로 세포 외로 분비되는 단백질 분해효소 중 하나인 콜라겐분해효소의 성질을 파악한다면 다른 독소 단백질들과의 관계를 확인할 수 있는 밑거름이 될 뿐만 아니라 궁극적으로 식중독에 원인이 되는 요소들을 밝힐 수 있을 것이라 사료된다. 본 연구실에서는 이미 V.
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