사람 간 배양세포 유래 HePG2 세포에 영양성분을 이용하여 실험적으로 중성지질을 축적시킨 상태에서 한방 황련해독탕(HT)의 약리적 효과를 검토하였다. 간세포는 1 mM oleate, 0.2% BSA, glucose 4.5 mg/mL 및 HT 무첨가(대조구) 또는 첨가한(0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지에서 6시간 및 24시간 배양하였으며(실험 I), 이때 황련해독탕을 첨가한 배양액에는 ［$^{14}$ C］-oleate (0.5 $\mu$Ci/mL medium)를 동시에 첨가하여 중성지질 획분에의 동위원소 추적실험을 하였다. 또한, 간세포에 2 mM oleate, 0.5% BSA, glucose 4.2mg/mL 및 HT 무첨가(대조구) 또는 첨가한(0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지에서 6, 24및 48시간 배양(실험 II) 또는 1 및 3시간 배양(실험 III)하였다. 실험 I에서 세포내 중성지질 농도는 HT첨가 6 및 24시간 배양에서 약물농도첨가 의존적으로 감소하였다. 이때 HT첨가시 ［$^{14}$ C］-oleate 동위원소는 세포내 중성지질 획분의 추적량과 세포외 분비량이 현저하게 감소하였다. 실험 I조건에 비해 고농도의 영양성분을 첨가시킨 실험 II 및 III 조건에서 세포내 중성지질 축적이 확인되었으며, 이 때 HT 첨가 24 및 48시간 배양에서는 세포내 중성지질 축적이 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 본 실험에 사용된 한방 황련해독탕은 사람 간배 양 HePG2 세포내 중성 지질 합성을 저하시켜 중성지질 축적을 억제시킴으로써 지방간 개선효과를 발휘한 것으로 시사되었다.
사람 간 배양세포 유래 HePG2 세포에 영양성분을 이용하여 실험적으로 중성지질을 축적시킨 상태에서 한방 황련해독탕(HT)의 약리적 효과를 검토하였다. 간세포는 1 mM oleate, 0.2% BSA, glucose 4.5 mg/mL 및 HT 무첨가(대조구) 또는 첨가한(0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지에서 6시간 및 24시간 배양하였으며(실험 I), 이때 황련해독탕을 첨가한 배양액에는 ［$^{14}$ C］-oleate (0.5 $\mu$Ci/mL medium)를 동시에 첨가하여 중성지질 획분에의 동위원소 추적실험을 하였다. 또한, 간세포에 2 mM oleate, 0.5% BSA, glucose 4.2mg/mL 및 HT 무첨가(대조구) 또는 첨가한(0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지에서 6, 24및 48시간 배양(실험 II) 또는 1 및 3시간 배양(실험 III)하였다. 실험 I에서 세포내 중성지질 농도는 HT첨가 6 및 24시간 배양에서 약물농도첨가 의존적으로 감소하였다. 이때 HT첨가시 ［$^{14}$ C］-oleate 동위원소는 세포내 중성지질 획분의 추적량과 세포외 분비량이 현저하게 감소하였다. 실험 I조건에 비해 고농도의 영양성분을 첨가시킨 실험 II 및 III 조건에서 세포내 중성지질 축적이 확인되었으며, 이 때 HT 첨가 24 및 48시간 배양에서는 세포내 중성지질 축적이 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 본 실험에 사용된 한방 황련해독탕은 사람 간배 양 HePG2 세포내 중성 지질 합성을 저하시켜 중성지질 축적을 억제시킴으로써 지방간 개선효과를 발휘한 것으로 시사되었다.
The pharmacological effect of Korean-Chinese traditional herbal medicine, Hawangyeonhaedoktang (HT) on experimentally induced-triglyceride accumulation in cultured human hepatocyte HepG2 cells was studied. HePG2 cells were cultured in the Dulbecco's modified Eagle's (DME) medium without (Control med...
The pharmacological effect of Korean-Chinese traditional herbal medicine, Hawangyeonhaedoktang (HT) on experimentally induced-triglyceride accumulation in cultured human hepatocyte HepG2 cells was studied. HePG2 cells were cultured in the Dulbecco's modified Eagle's (DME) medium without (Control medium) or with HT (0.5 mg/mL and 5.0 mg/mL) containing 1 mM oleate, 0.2% bovine serum albumin (BSA), and glucose 4.5 mg/mL for 6 and 24 hours in experiment I and 2 mM oleate, 0.5% BSA, and glucose 4.5 mg/mL for 6, 24 and in hours in Experiment II or 1 and 3 hours in Experiment III. Oleate ［$^{14}$ C］(0.5 $\mu$Ci/mL medium) added as a radioactive lipid precursor in the experiment I. In the experiment I, the intracellular triglyceride concentration was decreased remarkably during incubation for 6 and 24 hours, in a dose-dependent manner. At the same time, HT caused a decrease in the incorporation of ［$^{14}$ C］ oleate into intracellular triglyceride fraction and the secretion of triglyceride labeled with ［$^{14}$ C］ oleate into medium. In the experiment II and III compared to experiment I, the triglyceride accumulation in HepG2 cells was occurred, and HT prevented the accumulation of triglyceride during incubation for 24 and 48 hours. This result suggest that HT prevent the triglyceride accumulation in human hepatocytes by its inhibiting action on the intercellular triglyceride biosynthesis.
The pharmacological effect of Korean-Chinese traditional herbal medicine, Hawangyeonhaedoktang (HT) on experimentally induced-triglyceride accumulation in cultured human hepatocyte HepG2 cells was studied. HePG2 cells were cultured in the Dulbecco's modified Eagle's (DME) medium without (Control medium) or with HT (0.5 mg/mL and 5.0 mg/mL) containing 1 mM oleate, 0.2% bovine serum albumin (BSA), and glucose 4.5 mg/mL for 6 and 24 hours in experiment I and 2 mM oleate, 0.5% BSA, and glucose 4.5 mg/mL for 6, 24 and in hours in Experiment II or 1 and 3 hours in Experiment III. Oleate ［$^{14}$ C］(0.5 $\mu$Ci/mL medium) added as a radioactive lipid precursor in the experiment I. In the experiment I, the intracellular triglyceride concentration was decreased remarkably during incubation for 6 and 24 hours, in a dose-dependent manner. At the same time, HT caused a decrease in the incorporation of ［$^{14}$ C］ oleate into intracellular triglyceride fraction and the secretion of triglyceride labeled with ［$^{14}$ C］ oleate into medium. In the experiment II and III compared to experiment I, the triglyceride accumulation in HepG2 cells was occurred, and HT prevented the accumulation of triglyceride during incubation for 24 and 48 hours. This result suggest that HT prevent the triglyceride accumulation in human hepatocytes by its inhibiting action on the intercellular triglyceride biosynthesis.
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문제 정의
한방 HT에 의한 세포 내 중성지질 농도의 감소가 인정되었다. 따라서 동위 원소 추적에 의한 중성지질 생합성 능력을 검토하기 위하여 [14C]-oleatee 세포 내 축적량 및 배지 중에 분비된 방사능 활성을 측정하였다. 그 결과, Table 6과 같이 HT 0.
이러한 지방간은 고지혈증에 동반하여 유발되는 사례가 많기 때문에 HT는 인체에 있어서 중성지질 대사와 깊은 관련을 가지고 있어 특히 지방간 개선에 한방 성분의 효과가 기 대된다(4, 8). 본 실험에서는 사람 간종양 유래 HepG2 세포를 이용하여 영 양성분인 oleate, BSA 및 glucose 을 배양액 중에 고농도로 첨가하여 세포 내의 지질농도를 증가시킨 상태에서 중성지질 대사에 미치는 약리적 효과를 검토하였다. 실험 I에서 한방성분의 첨가에 의한 세포 내 중성 지 질 농도는 6시간 배 양에서 0.
가설 설정
3)Values not sharing the same letter are significantly different at p<0.05.
제안 방법
본 실험에 사용된 한방 황련해독탕(Hawangyeonhaedo- ktang: HT)의 조성과 화학적 성분은 Table 1과 같다(4). HT에 사生-된 비율로 각각의 생약 수용성 추출물을 동결건조 시 킨 혼賴 분말 1 g을 DMEM(-FCS) 40 mL에 용해 시 켜 2시간 동안 진탕한 후 원심분리 (1,500 g, 15분)어】 의해 얻어진 상층을 회스하였다. 회수된 상층 액을 0.
이때 각 실험의 대조 구는 한방 HT를 함유하지 않은 DMEM 만을 사용하였다. 각 실험에서 회수한 배양세포는 초음파 발 생기 (Sonifier 250, Bronson)를 이용하여 지질분석용 세포 현탁액을 조제하였다.
사람 간 배양세포 유래 HepG2 세포에 영양성분을 이용하여 실험적으로 중성지질을 축적시킨 상태에서 한방황련해 독탕(HT)의 약리적 효과를 검토하였다. 간세포는 1 mM oleate, 0.2% BSA, glucose 4.5 mg/mL 및 HT 무첨가(대조구) 또는 첨가한 (0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지 에서 6시간 및 24시간 배양하였으며(실험I), 이때 황련해 독탕을 첨가한 배양액에는 [, 4C]-oleate (0.5 uCi/mL medium)를 동시에 첨가하여 중성지질 획분에 의동위원소 추적 실험을 하였다. 또한, 간세포에 2 mM oleate, 0.
본 실험에 사용된 HepG2 세포는 사람 간세 포 유래의 배양세포로서, 분화한 대사기능을 가지고 있고, LDL 수용체, 리포단백질 분비, 아포단백질 합성, 간성 중성 지질 리파제 합성 및 분비 등의 지질대사, 약물과 영양성분에 대하여 사람 간세포에서 이루어지고 있는 것과 동일한 양상을 나타내는 많은 보고가 있어서(4, 8, 10-12), 현재 사람 간장에서 지질대사를 연구하는데 있어서 적절한 모델 세포로서 다양하게 연구가 진행되고 있다. 따라서 본 실험에서의 지방간 모델은 사람 간 유래의 배양세포인 HepG2 세포를 이용하여, 세포 배양 시 영 양성분인 oleate, albumin 및 glucose를 배지 중에 고농도로 첨가하여 세포 내 특히 중성지질 농도를 증가시킨 지방축적 세포의 상태에서 한방 황련해독탕 (HT) 의 지방간 개선의 약리적 효과를 검토하였다.
5 uCi/mL medium)를 동시에 첨가하여 중성지질 획분에 의동위원소 추적 실험을 하였다. 또한, 간세포에 2 mM oleate, 0.5% BSA, glucose 4.2 mg/mL 및 HT 무첨가(대 조구) 또는 첨가한(0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지 에서 6, 24 및 48 시간 배양(실험 U) 또는 1 및 3시간 배양(실험 田)하였다. 실험 I에서 세포 내 중성지질농도는 HT 첨가 6 및 24시간 배양에서 약물 농도 첨 가 의존적으로 감소하였다.
세포의 중성 지질 농도는 시 판 효소법 (Wako Junyaku, Osaka, Japan)으로 측정하였다. 배양세포 및 배지 중의 [14C]- oleate 동위원소 추적에 의한 중성지질 합성 능을 검토하기 위하여, 박층크로마토 그래 피 법(TLC)으로 지질을 분획한 후 방사능 활성은 액체 sintillation counter(WALLAC 1410, Pharmacia, Sweden)로 측정하였다.
사람 간 배양세포 유래 HepG2 세포에 영양성분을 이용하여 실험적으로 중성지질을 축적시킨 상태에서 한방황련해 독탕(HT)의 약리적 효과를 검토하였다. 간세포는 1 mM oleate, 0.
세포 단백질량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 한방 성분과 함께 6시간 및 24시간 배양한 세포의 단백질 농도를 Ug/dish로 나타내 었다(Table 2). 세포 내 단백질 농도는 첨가한 HT 농도에 의한 현저한 영향은 관찰되지 않았다.
세포배양 조건을 실험 II에서와 동일하게 한 실험 m에서 는 배양시간을 1 및 3시간의 단기간에 의한 효과를 조사하였다. HT는 0.
5 uCi [I4C]-oleate(56 mCi/mmol)의 동위원소 추적실험을 하여 지질 합성 능을 조사하였다. 실험 2에서는, 최종 농도 2 mM oleate, 0.5% BSA, glucose 4.5 mg/mL 및 日T의 최종 농도를 0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL을 DMEM에 첨가하여 6, 24 및 48시간 간세포를 배양한 후 경시적으로 회수하였다. 한편, 실험 3 에서는, 실험 2와 동일한 조건하에서 간세포 배양 시간을 1 및 3시간으로 실시하였다.
세포 배양액 중에 영양성분인 지방산, 알부민 및 glucose 등을 고농도로 첨가할 때 세포 내 중성지질 농도를 증가 시 키 는 것으로 알려져 있다(12). 실험 I 조건에서보다 고농도의 영 양성 분을 배지 중에 첨가하여 세포 내 지질농도를 증가 시 킨 실험 Ⅱ의 조건에서 동일 약제에 의한 지질대사에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과, Table 4와 같이 HT 0.
01 mg/mL streptomycine을 함유한 DMEM(기 본배지 )을 이 용 하여 3”℃, 5% CO% 95% 공기의 조건하에서 3 cm Falcon dish로 실험에 제공될 세포 수가 되기까지 약 1주일간 배양하고, 이떠 배지는 2~3일에 한 번씩 교환해 주었다. 실험 개시 전 세 포를 90 X15 mm petri dish에 2X1O*5개씩 접 종하여 세 포성 장기 배양기 표면의 70~80% 정도 되었을 때 DMEM으 로 세포를 2회 씻어준 다음 실험 배지를 첨가하여 실험을 시작하였다.
0 mg/mL로 배지에 첨가하여 6시간 및 24시간 배양한 간세포를 경시적으로 회수하였다. 이때 HT의 첨가실험에서는 0.5 uCi [I4C]-oleate(56 mCi/mmol)의 동위원소 추적실험을 하여 지질 합성 능을 조사하였다. 실험 2에서는, 최종 농도 2 mM oleate, 0.
HT에 사生-된 비율로 각각의 생약 수용성 추출물을 동결건조 시 킨 혼賴 분말 1 g을 DMEM(-FCS) 40 mL에 용해 시 켜 2시간 동안 진탕한 후 원심분리 (1,500 g, 15분)어】 의해 얻어진 상층을 회스하였다. 회수된 상층 액을 0.45 Um 필터(Millex-HD, Millipc ire Co.)를 이용하여 제균 시켜 DMEM에 0.5 mg/mL 및 5.0 0g/mL로 각각 희석시켜 실험에 사용하였다. 실험 1에 서는, 실험용 기본 배지로서 최종농도 1 mM oleate, 0.
대상 데이터
Louis, USA)에서, Fetal bovine se- rum(FES) 및 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 은 Gibco Co.(Grand Island, New York, USA)에서 각각 구 입 하였다. [14C]-oleic acide Amersham International(Amer- sham, England)에서 구입하였다.
(Grand Island, New York, USA)에서 각각 구 입 하였다. [14C]-oleic acide Amersham International(Amer- sham, England)에서 구입하였다.
본 실험에 사용된 한방 황련해독탕(Hawangyeonhaedo- ktang: HT)의 조성과 화학적 성분은 Table 1과 같다(4). HT에 사生-된 비율로 각각의 생약 수용성 추출물을 동결건조 시 킨 혼賴 분말 1 g을 DMEM(-FCS) 40 mL에 용해 시 켜 2시간 동안 진탕한 후 원심분리 (1,500 g, 15분)어】 의해 얻어진 상층을 회스하였다.
사람 간세포 유래의 배양세포인 HepG2 세포는 Wister 연구소呈부터 제공받았다. BSA(bovine serum albumin)은 Sigma Chemical Co.
0 0g/mL로 각각 희석시켜 실험에 사용하였다. 실험 1에 서는, 실험용 기본 배지로서 최종농도 1 mM oleate, 0.2% BSA 및 glu:ose 4.5 mg/mL를 함유한 배지를 이용하였다. HT는 최 종농 도 0.
한편, 실험 3 에서는, 실험 2와 동일한 조건하에서 간세포 배양 시간을 1 및 3시간으로 실시하였다. 이때 각 실험의 대조 구는 한방 HT를 함유하지 않은 DMEM 만을 사용하였다. 각 실험에서 회수한 배양세포는 초음파 발 생기 (Sonifier 250, Bronson)를 이용하여 지질분석용 세포 현탁액을 조제하였다.
데이터처리
실험으로부터 얻어진 결과치는 SAS program을 이용하여 one-way ANOVA로 검정하여 평균치 土표준오차로 나타내 었 으며, 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다 (15).
이론/모형
회수한 세포 현탁액의 총 지질은 Bligh와 Dyer 방법(13)으로 추출하고, 단백질량은 Lowry 등의 방법(14)으로 측정하였다. 세포의 중성 지질 농도는 시 판 효소법 (Wako Junyaku, Osaka, Japan)으로 측정하였다. 배양세포 및 배지 중의 [14C]- oleate 동위원소 추적에 의한 중성지질 합성 능을 검토하기 위하여, 박층크로마토 그래 피 법(TLC)으로 지질을 분획한 후 방사능 활성은 액체 sintillation counter(WALLAC 1410, Pharmacia, Sweden)로 측정하였다.
회수한 세포 현탁액의 총 지질은 Bligh와 Dyer 방법(13)으로 추출하고, 단백질량은 Lowry 등의 방법(14)으로 측정하였다. 세포의 중성 지질 농도는 시 판 효소법 (Wako Junyaku, Osaka, Japan)으로 측정하였다.
성능/효과
0% 감소하였다. 0.5 mg/mL 첨 가구 에서는 6시간 및 24시간 배양에 의한 큰 차이는 없었으나, 이보다 고농도인 5.0 mg/mL 첨 가구에서 는 한방성 분 첨가에 의한 배양 시간이 길어짐에 따라 더욱 감소하는 경향을 나타내었으며 , 첨가농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 세포 배양액 중에 영양성분인 지방산, 알부민 및 glucose 등을 고농도로 첨가할 때 세포 내 중성지질 농도를 증가 시 키 는 것으로 알려져 있다(12).
세포배양 조건을 실험 II에서와 동일하게 한 실험 m에서 는 배양시간을 1 및 3시간의 단기간에 의한 효과를 조사하였다. HT는 0.5 mg/mL 농도 첨 가구의 배 양 1시간 및 3시간의 극히 단시간에서는 중성지질 농도의 현저한 저하 현상이 나타나지 않았으나, HT 5.0 mg/mL 농도 첨 가구의 배 양 1시간 및 3시간 배 양에서는 각각 3.0% 및 16.9% 감소하는 경향을 나타내었다(Table 5). 본 실험의 조건에서 세포 내 중성지질 농도의 감소는 약제 첨가 후 3시간 정도에서부터 시작되는 것을 나타내었다.
실험 I 조건에서보다 고농도의 영 양성 분을 배지 중에 첨가하여 세포 내 지질농도를 증가 시 킨 실험 Ⅱ의 조건에서 동일 약제에 의한 지질대사에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과, Table 4와 같이 HT 0.5 mg/mL 첨 가구의 6 및 24시간 배양에서 중성지질 농도가 통계상의 유의차 없이 각각 2.4% 및 19.6% 낮게 나타났고, 48시간 배 양에서는 27% 유의적으로 감소하였다. 또한 5.
따라서 본 실험에 사용된 한방성분인 황련해독탕은 세포 내의 중성지질 합성을 감소 시켜 중성지질 농도를 낮춤으로써 중성지질의 축적과 관련한 지방간 개선작용을 나타낸 것으로 시사되었다.
6% 낮게 나타났고, 48시간 배 양에서는 27% 유의적으로 감소하였다. 또한 5.0 mg/mL 첨가 구에서도 6 및 24시간 배 양에서 중성 지 질 농도가 유의차 없이 각각 12.0% 및 21.4% 감소하였고, 48시간 배양에서는 37.5% 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과는 한방성분의 첨가에 의해 배양 시간이 길어질수록 또는 첨가농도가 증가할수록 세포 내 중성지질 농도가 감소하는 경향을 보여주고 있다.
9% 감소하는 경향을 나타내었다(Table 5). 본 실험의 조건에서 세포 내 중성지질 농도의 감소는 약제 첨가 후 3시간 정도에서부터 시작되는 것을 나타내었다. 본 실험에서 간세포 배양어】 첨가된 한방 성분의 양은 매일 7.
이때 HT 첨 가시 [14C]-oleate동위원소는 세포 내 중성지질 획분의 추적량과 세포 외 분비량이 현저하게 감소하였다. 실험 I 조건에 비해 고농도의 영양성분을 첨가시킨 실험 II 및 m 조건에서 세포 내 중성지질 축적이 확인되었으며 , 이때 HT 첨 가 24 및 48시간 배양에서 는 세포 내 중성지질 축적이 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 본 실험에 사용된 한방 황련해독탕은 사람 간배 양 HepG2 세포 내 중성 지질합성을 저 하시 켜 중성지질 축적을 억제시킴으로써 지방간 개선효과를 발휘한 것으로 시사되었다.
본 실험에서는 사람 간종양 유래 HepG2 세포를 이용하여 영 양성분인 oleate, BSA 및 glucose 을 배양액 중에 고농도로 첨가하여 세포 내의 지질농도를 증가시킨 상태에서 중성지질 대사에 미치는 약리적 효과를 검토하였다. 실험 I에서 한방성분의 첨가에 의한 세포 내 중성 지 질 농도는 6시간 배 양에서 0.5 mg/mL 첨 가구에서 20.3% 및 5.0 mg/mL 첨가 구에서 29.2% 감소하였다(Table 3). 또한 24시간 배양에서도 0.
실험 I 조건에 비해 고농도의 영양성분을 첨가시킨 실험 II 및 m 조건에서 세포 내 중성지질 축적이 확인되었으며 , 이때 HT 첨 가 24 및 48시간 배양에서 는 세포 내 중성지질 축적이 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 본 실험에 사용된 한방 황련해독탕은 사람 간배 양 HepG2 세포 내 중성 지질합성을 저 하시 켜 중성지질 축적을 억제시킴으로써 지방간 개선효과를 발휘한 것으로 시사되었다.
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