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가설 설정
- 1)Powdered yellow soybean (Danwort) was autoclaved and dried.
- 2)Powdered black soybean (Suwon 155) was autoclaved and dried.
- 2)Values are mean±SD.
- 4)Data are not significantly different.
제안 방법
- 100g 정도의 S.D계 흰쥐(n=24)를 실험동물센터(대전)에서 구입하여 고형식이로 일주일간 적응시킨 후 완전임의배 치법(completely randomized design)에 의해 평균 체중이 유사하도록 대조군(C), 노란콩 섭취군(YS), 검정콩 섭취군 (BS)으로 나누어 8주간 사육하였다. 사육기간동안 식수로 지 하수를 자유로이 섭취하도록 충분히 공급하였으며 식이 섭 취량 및 체중증가량을 측정하여 식이효율을 구하였다.
- SOD 활성 측정 : Total SOD(superoxide dismutase)활성 은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund와 Marklund의 방법 (28)을 이용하여 420 nm 에서 측정하였다. SOD 1 unit는 1분 동안 pyrogallol의 자동 산화를 50%까지 억 제하는데 요구되는 효소의 양으로 하였 고, Mn-SOD의 활성은 1 mM KCN으로 Cu, Zn-SOD 활성을 저해한 뒤 동일한 방법으로 측정되었고 Cu, Zn-SOD의 활성 은 total SOD에서 Mn-SOD활성을 뺀 값으로 계산하였다.
- 혈액은 채혈한 즉 시 원심분리하여 혈장을 취 해 -70℃에서 보관하면서 지 질과 산화 및 단백질 산화를 측정하였다. 간에서는 지질과산화, 단 백 질 산화, 항산화 효소계 활성 및 활성 산소종의 함량을 측정 하였고 심장과 눈에서 리포퓨신 생성정도를 측정하였다.
- 노란콩 및 검정콩 식이를 제조하여 S.D계 흰쥐에 8주간 섭취시킨 후 희생시켜 혈장과 간의 지질 과산화 함량을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 혈 장에서 지 질과산화 정도는 유의 적인 차이는 없었으나 노란콩 섭취군에서 0.
- 또한 검정콩 섭취 시 식후 지질대사관련 지표나 분변으로의 지질배설에 관한 연구(21)도 있으나 항산화시스템에 관련된 논문은 보고된 바 없다. 따라서 본 실험 에서는 in vivo system에서 노란콩 과 검정콩의 항산화효과를 비교하기 위해 흰쥐를 이용하여 지 질과산화 및 단백질 산화, 항산화효소계 의 활성 , 활성 산소 종 함량을 측정하여 비교하고, 리포퓨신 함량을 측정하여 콩의 항노화활성을 평가하였다.
- D계 흰쥐(n=24)를 실험동물센터(대전)에서 구입하여 고형식이로 일주일간 적응시킨 후 완전임의배 치법(completely randomized design)에 의해 평균 체중이 유사하도록 대조군(C), 노란콩 섭취군(YS), 검정콩 섭취군 (BS)으로 나누어 8주간 사육하였다. 사육기간동안 식수로 지 하수를 자유로이 섭취하도록 충분히 공급하였으며 식이 섭 취량 및 체중증가량을 측정하여 식이효율을 구하였다. 사육 실의 온도는 20~25℃를 유지하였으며 12시간 간격으로 점 등 및 소등하였다.
- 식이섭취 8주 후에 희생시킨 실험동물은 드라이아이스로마취시켜 심장에서 채혈하였고 간, 심장, 안구 등을 적출하여 0.9% 생 리 식 염 수로 세 척 한 뒤 여 과지 로 물기 를 제거 하고 -70℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 혈액은 채혈한 즉 시 원심분리하여 혈장을 취 해 -70℃에서 보관하면서 지 질과 산화 및 단백질 산화를 측정하였다.
- 수분은 상압가열건조법, 조지방은 Soxhiet 추출법, 조단백질은 Kj이dahl법, 조회분은 회화법 (23), 식이 섬 유는 Prosky 등에 의해 개발 수정 된 AOAC법 (24)으로 측 정하였고 그 결과는 Table 1에 나타내었다. 이 함량을 바탕으로 단백질, 지질, 식이섬유 함량이 동일하도록 casein, soybean oil, c이Elose의 양을 조정하였고 노란콩 및 검정콩의 무기질 함량이 대조군 식이와 동일하도록 부족한 무기질을 보충하여 식이를 제조하였다(Table 2).
- 2% TBA 333 UL를 첨가하여 30분간 가열하여 반응시 킨 뒤 532 nm에서 흡고도를 측정하였다. 이때 standard로는 TEP(1, 1, 3, 3- tetraetlloxypropaneX 사용하였으며 측정된 값을 표준곡선 에 대입 시켜 malondialdehyde(MDA)의 양으로 환산하였다.
- 간과 혈장에서 단백질 carbonyl 함량은 DNF*H(2, 4-dinitrophenyl hydrazine) 를 이용한 Oliver 등(27)의 방법에 준하여 측정하였다. 침전된 단백질에 2, 4-DNPH시약을 가해 반응시 킨 후에 타놀과 에 틸아세 테 이 트의 혼합액으로 세 척 하고 6 M guanidine-HC1 용액을 가해 용해시켜 370nm에서 흡광도의 차를 측정 하고 흡광계수(22 X 10* mo「'cmT)를 이용하여 환 산하였다.
- 즉 클로로포름 : 메탄올(2 :1, v/v)을 첨가하겨 균질화한 뒤 증류수를 가해 혼합하고 3, 000 rpm에서 2분 간 원심 분리시켰다. 클로로포름층을 취해 메탄올과 혼합한 뒤 excitation 365 nm, emission 450 nm에서 형 광스 펙트럼 을 측정하였고 대조군의 형광도와 비교하여 상대적 인 형광도로 나타내었다.
- 9% 생 리 식 염 수로 세 척 한 뒤 여 과지 로 물기 를 제거 하고 -70℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 혈액은 채혈한 즉 시 원심분리하여 혈장을 취 해 -70℃에서 보관하면서 지 질과 산화 및 단백질 산화를 측정하였다. 간에서는 지질과산화, 단 백 질 산화, 항산화 효소계 활성 및 활성 산소종의 함량을 측정 하였고 심장과 눈에서 리포퓨신 생성정도를 측정하였다.
- 흰쥐에게 콩 식이를 섭취시켜 노화와 더불어 축적되는 리 포퓨신 함량을 측정하였다. 리포퓨신은 퇴화에 따른 고지방 물질의 외부 또는 내부 라이소좀 과산화교체의 결과로 형성 되는 물질로서 이것이 세포에 축적되면 세포퇴화가 일어나 고 세 포가 죽게 되 므로 리 포퓨신 함량은 노화측정의 좋은 지 표가 돈다(40, 41).
대상 데이터
- 단원콩(영남작물시험장에서 분양) 및 검정콩(수원 155 호)을 분쇄 한 후 trypsin inhibitor의 활성을 저 해 시 키 기 위 해(22) 12TC에서 15분간 가압증자하여 건조시킨 뒤 식이 제조 에 사용하였다. 수분은 상압가열건조법, 조지방은 Soxhiet 추출법, 조단백질은 Kj이dahl법, 조회분은 회화법 (23), 식이 섬 유는 Prosky 등에 의해 개발 수정 된 AOAC법 (24)으로 측 정하였고 그 결과는 Table 1에 나타내었다.
데이터처리
- 실험결과는 평균士표준편차로 표시하였고, SPSS program 을 이용하여 one-way ANOVA로 처리한 뒤 유의 차가 나타 날 경우 Turkey test로 각 군간의 유의성을 사후 검정하였다.
이론/모형
- Catalase 활성 측정 : 간의 catalase활성 의 측정 은 Aebi의 방법 (29)에 의해 50 mM Na-K 인산 완충액 (pH 7.0), 기 질로 30 mM H2O2용액과 시 료액을 취 해 240 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 효소의 활성은 1분동안 1 Umol의 H2O2를 분해시키는 효소의 양을 1 unit로 하였다.
- 즉 효소 활성 은 GSH-px가 H2O2를 제 거하면서 소비된 GSH를 환원형으로 전환시키는데 필요한 NADPH의 양을 340 nm에서 측정하였고 GSH-px 1 unit는 1분간 1 Umol NADPH-t- 산화시키는 효소의 양으로 정의하였다. Feterson(31)의 방법에 의해 bovine serum albumin (BSA)縛 표준단백질로 사용하여 단백질량을 측정하였다.
- Fletcher 등(33)의 방법을 이용하여 심장과 눈에서 리포퓨 신 함라을 측정하였다. 즉 클로로포름 : 메탄올(2 :1, v/v)을 첨가하겨 균질화한 뒤 증류수를 가해 혼합하고 3, 000 rpm에서 2분 간 원심 분리시켰다.
- Glutathione peroxidase 활성 측정 : 간의 glutathione peroxidase(GSH-px)활성은 Lawrence와 Burk(30)의 방법에 의해 측정하였다. 즉 효소 활성 은 GSH-px가 H2O2를 제 거하면서 소비된 GSH를 환원형으로 전환시키는데 필요한 NADPH의 양을 340 nm에서 측정하였고 GSH-px 1 unit는 1분간 1 Umol NADPH-t- 산화시키는 효소의 양으로 정의하였다.
- SOD 활성 측정 : Total SOD(superoxide dismutase)활성 은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund와 Marklund의 방법 (28)을 이용하여 420 nm 에서 측정하였다. SOD 1 unit는 1분 동안 pyrogallol의 자동 산화를 50%까지 억 제하는데 요구되는 효소의 양으로 하였 고, Mn-SOD의 활성은 1 mM KCN으로 Cu, Zn-SOD 활성을 저해한 뒤 동일한 방법으로 측정되었고 Cu, Zn-SOD의 활성 은 total SOD에서 Mn-SOD활성을 뺀 값으로 계산하였다.
- 간과 혈장에서 단백질 carbonyl 함량은 DNF*H(2, 4-dinitrophenyl hydrazine) 를 이용한 Oliver 등(27)의 방법에 준하여 측정하였다. 침전된 단백질에 2, 4-DNPH시약을 가해 반응시 킨 후에 타놀과 에 틸아세 테 이 트의 혼합액으로 세 척 하고 6 M guanidine-HC1 용액을 가해 용해시켜 370nm에서 흡광도의 차를 측정 하고 흡광계수(22 X 10* mo「'cmT)를 이용하여 환 산하였다.
- 단원콩(영남작물시험장에서 분양) 및 검정콩(수원 155 호)을 분쇄 한 후 trypsin inhibitor의 활성을 저 해 시 키 기 위 해(22) 12TC에서 15분간 가압증자하여 건조시킨 뒤 식이 제조 에 사용하였다. 수분은 상압가열건조법, 조지방은 Soxhiet 추출법, 조단백질은 Kj이dahl법, 조회분은 회화법 (23), 식이 섬 유는 Prosky 등에 의해 개발 수정 된 AOAC법 (24)으로 측 정하였고 그 결과는 Table 1에 나타내었다. 이 함량을 바탕으로 단백질, 지질, 식이섬유 함량이 동일하도록 casein, soybean oil, c이Elose의 양을 조정하였고 노란콩 및 검정콩의 무기질 함량이 대조군 식이와 동일하도록 부족한 무기질을 보충하여 식이를 제조하였다(Table 2).
- 혈장에서의 지질과산화물 함량은 Buege와 Aust(25)의 방법으로 측정하였고 간조직에서의 지질과산화물 함량은 Ohkawa 등(26)의 방법에 따라 측정하였다. 이때 standard로 는 l, l, 3, 3-tetramethoxypropane(TMP)를 사용하였으며 측 정된 값을 표준곡선에 대입시켜 malondialdehyde(MDA)-2] 양으로 환산하였다.
- 활성 산소종의 함량을 측정 흐卜기 위해 간 subcellular frac- tion을 분리 하여 세포질 획 분에서 superoxide anion(O2 -) 을, 미토콘드리아 획분에서 hydroxyl radical( - OH)을 Choi 등(32)의 변형된 방법에 의해 측정하였다. 세포질 획분에서 의 superoxide anion함량은 시 료에 0.
성능/효과
- Orr와 Sohal(39)은 초파리 의 Cu, Zn-SOD와 cata- lase의 과발현은 수명을 연장시키고 노화와 관련된 생화학 적, 기능적 변화를 지연시 켰으며 또한 항산화효소계를 과발 현시킨 군은 대조군에 비해 단백질 카르보닐 함량도 상대적으로 적었음을 보고하였다. GSH-px의 활성 또한 나이, 성, 환경적인 요인, 그리고 과산화된 지질의 섭취 등 여러가지 인자에 의해 영향을 받는 것으로 보고되어 있으며 (30), 본 연구에서 생 체내에서 과산화를 유발하는 극심한 산화적 스트 레스가 존재하지 않는 상황에서 노란콩 및 검정콩의 섭취는 항산화 효소계의 induction 없이 지질과산화나 단백질의 산 화를 억 제하였고 이들 중에 풍부하게 존재하는 항산화 물질 들이 작용하여 생 체를 효과적으로 보호하였다고 보아진다.
- D계 흰쥐에게 8주간 섭취시킨 후 지질 및 단백질 산화를 측정한 결과 실험군은 대조군에 비해 산화를 억제하는 경향을 나타내었고 특히 검정콩의 경우 혈장에서 단백질 산화를 유의 적 으로 억 제 하였다. SOD 및 catalase 활성은 대 조군과 실험군간에 유의 적 인 차이가 나타나지 않았고, GSHpx의 경우 대조군에 비해 노란콩 및 검정콩 섭취군에서 유 의적으로 활성이 감소하였다. 간의 세포질에서 활성산소인 superoxide anion 함량을 측정한 결과 대조군에 비해 실험군 모두 superoxide anion 함량이 유의적으로 감소하였고 hydroxyl radical의 경우는 유의적인 차이는 없었으나 콩 섭취 군에서 약간 감소하였다.
- 노란콩 및 검정콩 섭취군의 항산화 효소계 활성을 측정한 결과를 Table 4에 나타내 었 다. SOD 활성 및 catalase 활성은 세 군간에 유의 적 인 차이가 나타나지 않았고 GSH-px의 경우에 있어서는 대조군에 비해 콩섭취군의 경우 유의적으로 그 활성이 낮았는데 대조군과 비교해서 50% 이상 낮아졌다. 콩 섭 취 군에서 이들 효소계가 induction되 지 않은 것은 고혈 압 유발쥐(SHR)에 콩을 7주간 섭취 시키고 지질과산화나 항 산화 효소계의 활성을 측정한 결과 SOD와 catalase는 유의 적 인 차이가 없었던 반면 GSH-px의 활성은 콩 섭 취군에서 유의적으로 낮아진 결과를 얻은 Yang의 결과(37)와 일치하였다.
- 25 nmole MDA/mg protein)과 유사한 것으로 나타났다. 간에서 의 지 질과산화 정도는 대조군(0.91 ±0.23 nmole MDA/mg protein)에 비해 노란콩 섭 취 군(0.72 ±0.20 nmole MDA/mg protein) 및 검정콩 섭취군(0.70±0.11 nmole MDA/mg protein)에서 는 유의적인 차이는 없었으나 약간 감소하는 것으로 나타났다. 생 체 내 지 질과산화 반응은 노화나 동맥경 화를 비롯한 많은 퇴행성 질환의 중요한 위험인자이다(35).
- 간의 세포질 에서 superoxide anion radical의 함량을 측정한 결과 대조군이 2.13±0.38 nmole/mg protein인 것 에 비 흥H 노란콩 및 검정콩 섭 취군은 1.37±0.40 nmole/mg protein과1.27±0.35 nmole/mg protein으로 대조군에 비해 유의적으 로 낮아짐을 알 수 있었다(Fig. 3). 미 토콘드리 아 획분에 있는 hydrox/1 radical 함량은 개체간의 차이가 커서 유의적이지 는 않为.
- SOD 및 catalase 활성은 대 조군과 실험군간에 유의 적 인 차이가 나타나지 않았고, GSHpx의 경우 대조군에 비해 노란콩 및 검정콩 섭취군에서 유 의적으로 활성이 감소하였다. 간의 세포질에서 활성산소인 superoxide anion 함량을 측정한 결과 대조군에 비해 실험군 모두 superoxide anion 함량이 유의적으로 감소하였고 hydroxyl radical의 경우는 유의적인 차이는 없었으나 콩 섭취 군에서 약간 감소하였다. 심장과 눈의 리포퓨신 함량을 측정한 결과 심장에서 대조군에 비해 실험군 모두 리포퓨신 축적 을 유의적으로 억제하였고 눈에서도 대조군에 비해 검정콩 섭취군의 경우 유의적으로 리포퓨신 생성을 억제하였다.
- 노란콩과 검정콩의 항산화효과를 생 체 시스템에서 살펴보기 위해 S.D계 흰쥐에게 8주간 섭취시킨 후 지질 및 단백질 산화를 측정한 결과 실험군은 대조군에 비해 산화를 억제하는 경향을 나타내었고 특히 검정콩의 경우 혈장에서 단백질 산화를 유의 적 으로 억 제 하였다. SOD 및 catalase 활성은 대 조군과 실험군간에 유의 적 인 차이가 나타나지 않았고, GSHpx의 경우 대조군에 비해 노란콩 및 검정콩 섭취군에서 유 의적으로 활성이 감소하였다.
- 심 장에서 대조군에 비해 유의적으로 리포퓨신의 축적이 낮아졌으며 상대적인 형광도가노란콩 섭취군의 경우58%, 검정 콩 섭취군에서는 69%로 콩의 섭취가 리포퓨신의 축적을 억 제하는 것으로 나타났다. 눈에서도 대조군에 비해 리포퓨신 의 축적이 낮아졌으며 노란콩 섭취군은 70%, 검정콩 섭취군 은 50%로 검정콩의 효과가 더 우수한 것으로 나타났다. 동의 보감에 의하면 검정콩의 종피(黑大豆皮)가 혈액을 자양(慈 養)하고, 풍을 소통(疏通시키며, 시력 증진 및 뇌를 맑게 하고 두통치료에 효과가 있다고 하였다.
- Protein carbonyl법 은 대사과정 중 생성된 활성산소나 지질의 과산화물이 지니고 있는 유리 라디칼에 의한 생체내 단백질 손상을 민감하게 측 정할 수 있는 방법이다(35). 본 실험에서 검정콩의 섭취는 혈 장의 단백질 산화를 유의적으로 억제하였고 이는 검정콩이 체내 활성 라디 칼을 소거 한 것으로 여 겨 진다. Ramirez-Tortosa 등(36)은 비 타민 E 결핍쥐 에 게 안토시 아닌이 풍부한 추출물 을 섭취시킨 결과 지질과산화 및 DNA 손상이 감소하였다고 보고하면서 안토시 아닌의 생 체내 항산화작용을 확인하였다.
- Shin과 Han(15) 의 연구에 따르면 고지방과 고콜레스테롤 식이를 급여한 고 지혈증 흰쥐 에 있어 검정콩 추출물의 섭취는 lipid profile의 개선효과를 나타내었다. 본 연구에서 사용되어진 식이는 지 방이 많이 함유되어 있지 않았고 따라서 8주간의 섭 취동안 지 질과산화를 과격 하게 유발하지 않아 콩의 지 질과산화 억 제효과가 뚜렷하지는 않은 것으로 사료된다.
- 4와 같았다. 심 장에서 대조군에 비해 유의적으로 리포퓨신의 축적이 낮아졌으며 상대적인 형광도가노란콩 섭취군의 경우58%, 검정 콩 섭취군에서는 69%로 콩의 섭취가 리포퓨신의 축적을 억 제하는 것으로 나타났다. 눈에서도 대조군에 비해 리포퓨신 의 축적이 낮아졌으며 노란콩 섭취군은 70%, 검정콩 섭취군 은 50%로 검정콩의 효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
- 간의 세포질에서 활성산소인 superoxide anion 함량을 측정한 결과 대조군에 비해 실험군 모두 superoxide anion 함량이 유의적으로 감소하였고 hydroxyl radical의 경우는 유의적인 차이는 없었으나 콩 섭취 군에서 약간 감소하였다. 심장과 눈의 리포퓨신 함량을 측정한 결과 심장에서 대조군에 비해 실험군 모두 리포퓨신 축적 을 유의적으로 억제하였고 눈에서도 대조군에 비해 검정콩 섭취군의 경우 유의적으로 리포퓨신 생성을 억제하였다. 전 체적으로 생 체 내에서 노란콩 및 검정콩의 항산화효과는 인 정되었으며 종피 색의 차이는 크지 않은 것으로 나타났다.
- 미 토콘드리 아 획분에 있는 hydrox/1 radical 함량은 개체간의 차이가 커서 유의적이지 는 않为.으나 대조군(3.05士L20 nmole/mg protein)에 비해 노란콩 섭 취군(2.33± 1.21 nmole/mg protein)은 24% 감소되 었고, 검정콩 섭취군(257±0.95 nmole/mg protein)도 16% 감소되었다 (Fig. 3).
- 심장과 눈의 리포퓨신 함량을 측정한 결과 심장에서 대조군에 비해 실험군 모두 리포퓨신 축적 을 유의적으로 억제하였고 눈에서도 대조군에 비해 검정콩 섭취군의 경우 유의적으로 리포퓨신 생성을 억제하였다. 전 체적으로 생 체 내에서 노란콩 및 검정콩의 항산화효과는 인 정되었으며 종피 색의 차이는 크지 않은 것으로 나타났다.
후속연구
- Ramirez-Tortosa 등(36)은 비 타민 E 결핍쥐 에 게 안토시 아닌이 풍부한 추출물 을 섭취시킨 결과 지질과산화 및 DNA 손상이 감소하였다고 보고하면서 안토시 아닌의 생 체내 항산화작용을 확인하였다. 그러나 이 추출물에는 다른 성분이 같이 함유되어 있었으므 로 안토시아닌 만의 작용으로 단정지을 수 없으며 실제로 섭취시 어떤 경로로 대사되는지 에 관한 연구가 더 필요하다 고 여겨진다.
- 그러나 본 연구에서 정상식이에 노란콩 및 검정콩을 첨가시켜 8주간 섭취시켰을 때 검정콩과 노란콩은 유사한 정도의 항산화효과를 나타내었다. 안토시아닌 색소 는 매우 불안정 한 특성을 가지고 있으므로 식 이 제조시 가열 처 리하는 과정 이나 소화과정에서 안토시아닌 일부가 파괴 된 것으로 보이므로 이에 관련된 연구가 더 진행되어야 한다. 고 여겨진다.
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