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문제 정의
- Vitamin E는 체내에서 다른 항산화 물질과는 다르게 매우 적은 농도만이 존재하고 있으나 지용성 성분으로 세포 지질 막에 삽입되어 있는 형태로 존재하여 ROS에 의한 지 질과 산화를 억제하는데 탁월한 효과가 있다/ 또한, vitamin C, glutathione 등 세포질 내의 다양한 수용성 항산화제들에 의하여 산화된 vitamin C는 빠른 속도로 환원되어 재활용되는 경로가 존재하여 적은 농도의 vitamin E임에도 불구하고 생체 내에서 가장 중요한 항산화제의 하나로 꼽히고 있다. m 따라서, 본 연구에서는 스트레스로 인한 뇌 조직의 산 화적 손상을 지용성 항산화제인 vitamin E의 투여로 억제함을 확인하여 vitamin E의 항 스트레스 효능을 확인하고자 하였다. '
제안 방법
- 4주간 사육한 쥐를 희생 전 12시간 절식시킨 다음 decapitation 법에 의해 희생시킨 후 뇌 조직을 즉시 적출하여 생리식염수로 씻어 내고 무게를 측정하였으며 Potter-El- vejhem homogenizer를 사용하여 균질화하여 조직 시료액 으로 사용하였다. 또한, 혈액 시료는 5 unit/ml heparine이 들어 있는 tube에 받아 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈장과 혈구로 분리하여 실험에 이용하였다.
- 스트레스 군과 vitamin E 투여군은 매일 noise와 immobilization stress를 주었다. Noise는 85 dB로 고정하였고 immobilizatione 원통형 병에서 직립형으로 서 있게 하는 방법을 택하였다(2)
- 스트레스를 4주간 가한 후 뇌 조직에서 효소적 방어 시스템인 SOD 및 비효소적 방어 시스템의 중요 물질인 glu- tathione 의 함량 변화를 통하여 스트레스로 인한 생체내의 항산화 방어 기작의 변화를 살펴보았다.
- 스트레스의 지표로 사용되는 5-hydroxyindole acetic acid (5-HIAA), 유리 지방산 및 혈당의 분석은 다음과 같은 방법을 사용하였다.
- 0) 을 혼합하여 강하게 교반한 후 원심분리하여 얻은 하층 액을 시료로서 사용하였다. 얻어진 시료를 동일 양을 각각 A, B 시험관에 분주한 후 A 시험관에는 1% cysteine 용액을 첨가한 뒤 A, B 시험관 모두에 10 M HC1 을 첨가한 다음 A 시험관에 만 0.1% o-phthalaldehyde (OPT) 용액을 넣었다. 30분 후에 B 시험관에 1% cysteine 용액과 OPT 용액을 넣고 95℃에서 10분간 반응시킨 후 냉각시켰다.
- 30분 후에 B 시험관에 1% cysteine 용액과 OPT 용액을 넣고 95℃에서 10분간 반응시킨 후 냉각시켰다. 이 반응액의 형 광도를 excitation 360 nm, emission 470 nm에서 형광 광 도계 (Hitachi, Japan)로 측정하고, A, B 시험관의 차를 이용하여 표준시료와 비교하여 정량 분석하였다.
- ). 이때 상층액인 hexane층을 취해 excitation 286 nm, emmission 330 nm의 spectrofluoro- meter에서 형광 도를 측정하여 표준 용액 (lμg dl-a- tocopherol) 의 값과 비교 정량하였다.
- 지질 과산화의 지표 물질인 과산화지질의 정량은 Yagi 법을 이용호} 여 thiobarbituric acid (TBA)와 반응하는 물질 (thiobarbuturic acid—reactvie substance, TBARS) 을 정 량함으로서 간접 측정하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 140~160 g의 체중을 가지는 웅성 SD rat 를 대한 실험동물 센터로부터 분양받아 사용하였다 실험동물은 난괴 법으로 대조군 (No stress, NS), 스트레스군 (Stress, SNE) vitamin E 식이군 (Stress + vitamin E, SE)으로 분류하였다 (N = 7).
데이터처리
- 각 실험 결과는 평균±표준편차의 형태로 표시하였으며, 각 군 간의 유의성 검증은 student t-test를 통하여 검증하였고, 유의성 있는 결과에 한하여 도시하였다.
이론/모형
- Glutathione 측정은 환원형 (redueced 이utathione, GSH) 와 산화형 (oxidized glutathione, GSSG) 를 분리하여 측정하는 Hissin 방법'”을 사용하여 측정하였다.
- SOD 활성도는 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동 산화 에 의한 발색을 이용한 Marklund 등'»의 방법에 따라 측정하였다.
- Vitamin E의 정량은 Desai 방법20)에 따라 혈장 0.5 ml 를 pyrogallol (2% in EtOH) 1.0 ml를 넣어 혼합한 후 70℃ water bath에서 2분 동안 incubation 시켰다. 여기에 saturated KOH 0.
- 단백질의 산화적 손상의 지표인 단백질 카르보닐화합물 (protein carbonlytion) 과 단백질 분해도 (protein degradation) 2] 측정은 각기 2, 4—dinitrophenyl hydrazine을 이용한 Levine 등의 방법⑹과 fluoroscamine을 사용한 Davies 등의 방법'”을 이용하여 정량하였다.
- 또한 혈액 중 유리지방산의 분석은 Smith 방법17)에 의해 정랑하였다.
성능/효과
- 4주간 vitamin E 식이를 섭취한 vitamin E 투여군에서 혈장 vitamin E의 농도는 다른 두 군에 비하여 약 2배 정도 높은 값을 나타내었으며 통계적 유의성을 나타내었다 (p< 0.05). 이 결과는 vitamin E가 정상적으로 체내로 흡수되었음을 나타내는 결과이다.
- 또한, vitamin E 투여군의 경우 혈청 내에서의 vitamin E 농도가 유의적으로 증가하여 정상적인 vitamin E의 투여도 이루어졌음을 확인하였다. Vitamin E의 투여는 스트레스로 인한 체중 증가량의 감소를 억제하였으며, 또한 뇌 조직의 단백질 및 지질의 산화적 손상을 억제하는 효능을 보였으며, SOD의 활성 또한 증가시키는 효능을 나타냈다. 따라서, vitamin E 투여는 스트레스로 인하여 발생하는 뇌조직의 산화적 손상을 억제함으로서 스트레스에 대한 방어효능이 일부 있는 것으로 생각된다.
- 이 결과는 vitamin E가 정상적으로 체내로 흡수되었음을 나타내는 결과이다. 그러나 스트레스 군과 대조군간의 vitamin E 농도에는 차이가 나타나지 않아 스트레스에 의한 직접적인 vitamin E의 감소는 없는 것으로 추측되었다.
- 2%가 증가하는 결과를 나타내어 스트레스를 정상적으로 받고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, vitamin E 투여군 (SE)에서 유리 지방산의 함량은 스트레스군 (SNE) 에 대비하여 약 8.3% 감소하는 결과가 나타났으며, 5-HIAA에 대해서는 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 볼 때 스트레스에 의해서 생체 내에서는 스트레스 호르몬의 변화가 관찰되었고 이러한 변화가 성장에 따른 체중 증가량의 감소로 나타나는 것으로 추측되었다.
- 이것은 스트레스를 받았을 때 거식증과 체중 감소가 일어난다는 Morley 등의 보고加와 일치하는 결과로 스트레스가 정상적으로 실험 동물에게 가해졌음을 나타내는 결과이다. 또한, vitamin E 투여군 (SE)에서 체중증가량의 감소 폭은 비록 통계적 유 의성은 나타나지 않았으나 스트레스군 (SNE) 에서보다 적은 것으로 나타나 vitamin E의 투여가 체내에 가해지는 스트레스를 일부 감소시키는 효과가 있는 것으로 추측되었다. 체중 증가량 결과에서 나타난 vitamin E의 항 스트레스 효과를 생화학적인 변화에서 관찰하기 위해서 스트레스 지 표 호르몬인 serotonin의 최종 대사 산물인 5-HIAA를 뇌 조직에서 정량한 결과와 혈장에서 유리지방산 (free fatty acid) 을 정량한 결과는 Fig.
- 이런 효능을 확인하기 위하여 실험용 흰 쥐에게 4주간의 noise 및 고정화 스트레스를 가한 결과, 스트레스를 가함으로서 체중 증가량 을 감소시켰으며, 스트레스 지표물질인 5-HIAA와 혈청 내 유리지방산의 증가 및 뇌조직의 산화적 손상이 증가되어 정상적으로 스트레스가 가해졌음을 확인할 수 있었다. 또한, vitamin E 투여군의 경우 혈청 내에서의 vitamin E 농도가 유의적으로 증가하여 정상적인 vitamin E의 투여도 이루어졌음을 확인하였다. Vitamin E의 투여는 스트레스로 인한 체중 증가량의 감소를 억제하였으며, 또한 뇌 조직의 단백질 및 지질의 산화적 손상을 억제하는 효능을 보였으며, SOD의 활성 또한 증가시키는 효능을 나타냈다.
- 본 실험 결과에서는 스트레스를 가한 군에 있어서 5- HIAA 및 유리지방산의 농도가 대조군에 대비하여 통계적 유의성은 나타나지 않았으나 각기 약 20.5%와 7.2%가 증가하는 결과를 나타내어 스트레스를 정상적으로 받고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, vitamin E 투여군 (SE)에서 유리 지방산의 함량은 스트레스군 (SNE) 에 대비하여 약 8.
- 7과 같이 나타났다. 스트레스를 가함으로서 총 glutathione 함량 및 GSH/GSSG의 비율에는 큰 영향을 나타내지 않았으며, vitamin E의 투여 역시 이들의 함량 및 비율의 변화에 중요한 변화를 야기하지는 않은 것으로 나타났다.
- 실험 기간 동안 식이를 자유 섭취하게 하였음에도 불구하고 스트레스를 가한 군에서의 체중 증가량은 대조군과 비교할 때 모두 감소하는 것으로 나타났다. 이것은 스트레스를 받았을 때 거식증과 체중 감소가 일어난다는 Morley 등의 보고加와 일치하는 결과로 스트레스가 정상적으로 실험 동물에게 가해졌음을 나타내는 결과이다.
- 실험동물의 뇌 조직에서 TBARS를 측정한 결과에서 스트레스를 가한 군 (SNE) 에서의 지질 과산화는 대조군 (CON)에 대비하여 증가하였으며, 혈장에서도 지질과산화물이 증가하고 있음을 나타내었다. 지질뿐 아니라 단백질 분해도의 결과에서도 스트레스 군은 대조군에 대비하여 단백질 분해 도가 증가하고 있는 모습을 보였다.
- 3% 감소하는 결과가 나타났으며, 5-HIAA에 대해서는 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 볼 때 스트레스에 의해서 생체 내에서는 스트레스 호르몬의 변화가 관찰되었고 이러한 변화가 성장에 따른 체중 증가량의 감소로 나타나는 것으로 추측되었다. Vitamin E 투여에 의해서 비록 통계적 유 의성은 나타나지 않았으나 체중 증가량 감소 폭을 축소시켰 으며, 유리지방산을 감소시킨 결과로 볼 때 vitamin E의 투여가 스트레스로 인한 체내의 항상성 변화를 방어함에 있어서 유리한 점을 제공할 것으로 사료된다.
- 즉, TBARS의 측정값에서 vita- min E의 투여는 뇌 조직과 혈장 모두에서 스트레스 군에 대 비하여 낮은 값을 나타내어 vitamin E의 투여가 스트레스로 인하여 발생하는 뇌 조직의 산화적 손상을 억제할 수 있는 것으로 판명되었다. 이런 결과는 단백질 분해도에 있어 서도 vitamin E의 투여로 인하여 감소하는 것으로 나타나 vitamin E의 투여가 뇌 조직에서 스트레스로 인하여 유도되는 지질 및 단백질의 산화적 손상으로부터 보호흐)는 효과가 있음을 알 수 있었다. 그러나 단백질 카르보닐화에서는 스트레스 및 vitamin E에 의한 특별한 변화가 관찰되지는 않았다.
- 이런 ROS에 대해서 높은 소거능을 지닌 vitamin E의 투여는 스트레스로 인한 생체내 산화적 손상을 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 이런 효능을 확인하기 위하여 실험용 흰 쥐에게 4주간의 noise 및 고정화 스트레스를 가한 결과, 스트레스를 가함으로서 체중 증가량 을 감소시켰으며, 스트레스 지표물질인 5-HIAA와 혈청 내 유리지방산의 증가 및 뇌조직의 산화적 손상이 증가되어 정상적으로 스트레스가 가해졌음을 확인할 수 있었다. 또한, vitamin E 투여군의 경우 혈청 내에서의 vitamin E 농도가 유의적으로 증가하여 정상적인 vitamin E의 투여도 이루어졌음을 확인하였다.
- 이상의 결과를 살펴볼 때, 스트레스로 인한 뇌 조직의 산 화적 손상에서 vitamin E 투여는 항산화 방어계를 보강하여 산화적 손상을 억제하는 효능이 있는 것으로 나타났다.
- 스트레스를 가하면서 동시에 vitamin E를 섭취시킨 vitamin E 투여군 (SE) 의 경우 뇌 조직 내에서 산화적 손상이 경 감되는 것으로 나타났다. 즉, TBARS의 측정값에서 vita- min E의 투여는 뇌 조직과 혈장 모두에서 스트레스 군에 대 비하여 낮은 값을 나타내어 vitamin E의 투여가 스트레스로 인하여 발생하는 뇌 조직의 산화적 손상을 억제할 수 있는 것으로 판명되었다. 이런 결과는 단백질 분해도에 있어 서도 vitamin E의 투여로 인하여 감소하는 것으로 나타나 vitamin E의 투여가 뇌 조직에서 스트레스로 인하여 유도되는 지질 및 단백질의 산화적 손상으로부터 보호흐)는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 실험동물의 뇌 조직에서 TBARS를 측정한 결과에서 스트레스를 가한 군 (SNE) 에서의 지질 과산화는 대조군 (CON)에 대비하여 증가하였으며, 혈장에서도 지질과산화물이 증가하고 있음을 나타내었다. 지질뿐 아니라 단백질 분해도의 결과에서도 스트레스 군은 대조군에 대비하여 단백질 분해 도가 증가하고 있는 모습을 보였다. Noise와 고정화 스트레스는 모두 정신적 스트레스로 구분되고 있어 뇌 조직이 스트레스에 의해 가장 큰 영향을 받는 조직일 뿐 아니라 뇌 조직은 타 조직에 비해서 항산화 방어체계의 활성이 낮고, 몸 전체 산소 소모량의 15% 이상을 소모할 정도로 많은 산소를 소비하기에 더욱 산화적 손상에 민감한 조직이라 할 수 있다.
후속연구
- 이러한 결과를 볼 때 스트레스에 의해서 생체 내에서는 스트레스 호르몬의 변화가 관찰되었고 이러한 변화가 성장에 따른 체중 증가량의 감소로 나타나는 것으로 추측되었다. Vitamin E 투여에 의해서 비록 통계적 유 의성은 나타나지 않았으나 체중 증가량 감소 폭을 축소시켰 으며, 유리지방산을 감소시킨 결과로 볼 때 vitamin E의 투여가 스트레스로 인한 체내의 항상성 변화를 방어함에 있어서 유리한 점을 제공할 것으로 사료된다.
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