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문제 정의
- , 1986). 그러므로 본 연구에서는 특정 DNA를 단시간에 증폭시켜 생물 종간 또는 개체 간의 유전적 변이를 규명할 수 있는 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 분석법을 이용하여 전국적으로 분포하고 있는 우리나라 민들레류 종간의 계통적 유연관계를 밝히고자 시도하였다. 식물종의 형태적인 분석은 대단히 까다롭고 연구 결과에 대한 신뢰도도 낮을 수 있으며 특정 효소의 변이가 유전자의 변이로부터 기인된다는 이론적 배경을 지니는 동위효소 분석법도 이용 가능한 동위효소의 종류가 한정되어 있다는 점과 Band pattern이 동일개체에서도 변이가 발생할 수 있다는 단점이 지적되고 있다(Rani et al.
- , 1992). 그러므로 본 실험은 국내에 생육하는 4종의 자생 민들레와 2종의 귀화 민들레 종과의 유전적인 유연관계를 RAPD 분석법을 통해 명확히 밝혀 전국적인 민들레류의 분포 실태를 파악하고 금후 민들레를 비롯한 귀화식물 관리체계를 세우는데 기초 자료를 제 공하고자 수행하였다.
제안 방법
- 민들레 종자는 자생지에서 무작위로 성숙한 3개체 이상에서 채종하여, 각 개체간의 구분 없이 파종하여 시험하였다. 채종한 민들레류 종자들은 관행 (안영희와 최광율, 2000)에 따라 2000년 8월에 파종하여 20()1년 2월까지 관수와 제초만으로 재배 관리하며 주요형질을 조사하였다(Table 1). 2001 년 2월에 이들 종의 신선한 잎을 채취한 후 4”C의 냉 암실에 72시간 동안 보존하여 다당류를 제거한 다음 -74幻의 deep freezer에 저장한 것을 RAPD 분석 시료로 사용하였다(Williams et al.
- , 1991). 각 종들의 genomic DNA 50ng, 10X buffer 2.5/4, 2mM MgC12 2/4, 2mM dNTP 2pl, random primer 20ng, Taqpolymerase lunit를 각각 혼합한 후 최종량을 25/4 로 하여 반응하였다. DNA 증폭 조건은 95°C에서 5분간 predenaturation한 후, 95°C에 1분, 35°C에 2분, 72幻에 2분간 반응시켜 총 55 cycles를 반복한 다음 72tJ로 10분간 extension하여 특정 DNA band들을 증폭하였다.
- 5/4, 2mM MgC12 2/4, 2mM dNTP 2pl, random primer 20ng, Taqpolymerase lunit를 각각 혼합한 후 최종량을 25/4 로 하여 반응하였다. DNA 증폭 조건은 95°C에서 5분간 predenaturation한 후, 95°C에 1분, 35°C에 2분, 72幻에 2분간 반응시켜 총 55 cycles를 반복한 다음 72tJ로 10분간 extension하여 특정 DNA band들을 증폭하였다. 사용한 PCR 장치는 MWG-Biotech사의 Primus 96Plus(Germany)를 사용하였으며, mineral oil은 사용하지 않았다.
- 증폭된 DNA는 EtBrCethidium bromide)을 포함한 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 UV transilluminator로 출현한 밴드를 확인한 후, Polaroid 카메라로 촬영하였다. 증폭되어 분리된 밴드의 분자량은 A/HindHI DNA stand marker로 추정하였다.
- 5% agarose gel에서 전기영동하여 UV transilluminator로 출현한 밴드를 확인한 후, Polaroid 카메라로 촬영하였다. 증폭되어 분리된 밴드의 분자량은 A/HindHI DNA stand marker로 추정하였다. 분자량에 따른 밴드의 유무를 확인하고 기초자료 행렬을 작성한 후 이를 근거로 Treecon (Van de Peer and De Wachter, 1993)을 이용하여 Nei 와 Li(1979)의 방법에 준하여 계산하여 유사도 값을 구하고, UPGMA (Unweighted pair- group method with arithmetic average) 방법으로 phenogram을 작성하여 비교 검토하였으며 결과를 임의로 100 반복하는 Bootstrap 방법(Felsens- tein, 1985; Sneath and Sokal, 1973)으로 분석하였다.
- 자생 민들레속 식물로, 민들레를 비롯하여 산민들레, 좀민들레, 흰민들레 등의 4종과 귀화종인 서양 민들레 및 붉은씨서양민들레 2종의 종자를 2000년 8월에 파종하고 20()1년 2월까지 관수와 제초만으로 재배 관리하면서 주요형질 및 RAPD에 의한 유전적 유연관계를 조사하였다(Table 1). 또한 자생민들레의 대조구로 몽고에서 채집한 민들레 (Taraxacum mongiicum)와 서양민들레의 대조 구로 영국의 Kew Garden과 미국 아놀드 식물원에서 각각 분양받은 서양민들레의 종자를 파종하여 동일한 방법으로 형태적인 특성 및 유전적인 유연관계를 조사하였다.
- 유연관계를 조사하였다(Table 1). 또한 자생민들레의 대조구로 몽고에서 채집한 민들레 (Taraxacum mongiicum)와 서양민들레의 대조 구로 영국의 Kew Garden과 미국 아놀드 식물원에서 각각 분양받은 서양민들레의 종자를 파종하여 동일한 방법으로 형태적인 특성 및 유전적인 유연관계를 조사하였다. 민들레속 식물의 개화기는 봄철 (4~6 월)에만 개화하는 그룹과 봄에서 가을철(3~9월)에 걸쳐 장기간 개화하는 그룹으로 구분되며, 화색은 흰색, 황색 등 2가지로 구분되었다.
- 민들레속 식물 9종(대조구 3종 포함)의 유전적 유연관계를 분석하기 위하여 RAPD를 통한 poly- morphism을 나타내는 primer들을 찾기 위하여 대략 100여 개의 Operon사의 10-mer random primers를 사용하여 primer screening을 실시하였다. Primer screening통해 선발된 30개의 primer(Table 2)를 이용하여 RAPD를 행한 결과, 9종의 민들레로부터 총141개 다양한 polymorphic band가 나타나 민들레 종간의 유전적인 차이 분석이 가능하였다.
- 특히 OPS8 은 대략 560bp에서 귀화종인 서양민들레 종에서만 나타나는 특이 밴드가 나타났다. 각 민들레 종들 간 Band의 유무를 분석하여 작성한 dendrogram에의한 민들레속 식물들의 거리지수의 결과를 이용해서 Phenogram을 작성하였다(Figure 2).
대상 데이터
- 같다. 전국에서 채종한 자생종 민들레(평택), 산민들레(광능), 좀민들레(제주도), 흰민들레(안성)와 귀화종인서 양민들레 , 붉은씨서양민들레 등 분석 하고자 하는 시료 6종을 비롯하여 대조구 시료로 몽고에서 채집해온 민들레(Taraxacum mongolkum)와 영국의 Kew Garden과 미국 아놀드 식물원에서 각각 분양받은 서 양민들레 (T. officinale) 종자를 시료로 사용하였다. 민들레 종자는 자생지에서 무작위로 성숙한 3개체 이상에서 채종하여, 각 개체간의 구분 없이 파종하여 시험하였다.
- officinale) 종자를 시료로 사용하였다. 민들레 종자는 자생지에서 무작위로 성숙한 3개체 이상에서 채종하여, 각 개체간의 구분 없이 파종하여 시험하였다. 채종한 민들레류 종자들은 관행 (안영희와 최광율, 2000)에 따라 2000년 8월에 파종하여 20()1년 2월까지 관수와 제초만으로 재배 관리하며 주요형질을 조사하였다(Table 1).
- 채종한 민들레류 종자들은 관행 (안영희와 최광율, 2000)에 따라 2000년 8월에 파종하여 20()1년 2월까지 관수와 제초만으로 재배 관리하며 주요형질을 조사하였다(Table 1). 2001 년 2월에 이들 종의 신선한 잎을 채취한 후 4”C의 냉 암실에 72시간 동안 보존하여 다당류를 제거한 다음 -74幻의 deep freezer에 저장한 것을 RAPD 분석 시료로 사용하였다(Williams et al., 1993).
- DNA 증폭 조건은 95°C에서 5분간 predenaturation한 후, 95°C에 1분, 35°C에 2분, 72幻에 2분간 반응시켜 총 55 cycles를 반복한 다음 72tJ로 10분간 extension하여 특정 DNA band들을 증폭하였다. 사용한 PCR 장치는 MWG-Biotech사의 Primus 96Plus(Germany)를 사용하였으며, mineral oil은 사용하지 않았다.
이론/모형
- 증폭되어 분리된 밴드의 분자량은 A/HindHI DNA stand marker로 추정하였다. 분자량에 따른 밴드의 유무를 확인하고 기초자료 행렬을 작성한 후 이를 근거로 Treecon (Van de Peer and De Wachter, 1993)을 이용하여 Nei 와 Li(1979)의 방법에 준하여 계산하여 유사도 값을 구하고, UPGMA (Unweighted pair- group method with arithmetic average) 방법으로 phenogram을 작성하여 비교 검토하였으며 결과를 임의로 100 반복하는 Bootstrap 방법(Felsens- tein, 1985; Sneath and Sokal, 1973)으로 분석하였다.
성능/효과
- 9〜7cm, 총포외편의 돌기는 민들레와 흰민들레 2종에서만 나타나며 나머지 4종에서는 존재하지 않았다. 4종의 자생종 민들레의 잎에는 털이 나타났으나 귀화종에는 존재하지 않았다. 총포의 방향은 자생종 민들레는 수평인 반면, 귀화종은 하향 방향이었으며, 총포의 색깔은 연한 녹색, 녹색, 짙은 녹색 또는 검푸른색으로 조사되었다.
- 4종의 자생종 민들레의 잎에는 털이 나타났으나 귀화종에는 존재하지 않았다. 총포의 방향은 자생종 민들레는 수평인 반면, 귀화종은 하향 방향이었으며, 총포의 색깔은 연한 녹색, 녹색, 짙은 녹색 또는 검푸른색으로 조사되었다. 특히 미국 및 영국의 서양민들레를 비롯하여 몽고의 민들레는 국내에서 생육하는 개체들과 큰 차이가 나타나지 않았다.
- Primer screening통해 선발된 30개의 primer(Table 2)를 이용하여 RAPD를 행한 결과, 9종의 민들레로부터 총141개 다양한 polymorphic band가 나타나 민들레 종간의 유전적인 차이 분석이 가능하였다. 증폭된 DNA 단편들의 크기는 대략 125~2300bp 사이의 범위에서 다양하게 나타났으며 125bp 보다 낮은 DNA 절편의 크기는 재현성에 문제가 있을 수 있으므로 최종 결과에서 제외시켰다 (Figure 1).
- 증폭된 DNA 단편들의 크기는 대략 125~2300bp 사이의 범위에서 다양하게 나타났으며 125bp 보다 낮은 DNA 절편의 크기는 재현성에 문제가 있을 수 있으므로 최종 결과에서 제외시켰다 (Figure 1). Primer OPC12, OPD16, OPK16, OPK17, OPK20, OPS1 과 OPS8에서는 각 종마다 특정밴드가 있는 것으로 조사되었다. 특히 OPS8 은 대략 560bp에서 귀화종인 서양민들레 종에서만 나타나는 특이 밴드가 나타났다.
- 1979). 민들레속 식물 9종의 유전 적의 유연관계를 알아보기 비유사 값을 분석한 결과 자생종 중에는 민들레의 원종이 라 사료되는 몽고 민들레 (T1)와 한국 민들레 인 T2의 비 유사 값이 11.111로 나타나서 유전적 거리가 매우 가깝다는 것을 알 수 있었으며, 국내에서 채집한 자생종 민들레 중에서는 산민들레(T3)와 좀민들레(T4)간의 비유사 값이 12.195로 나타나서 유전적 거리가 가장 가깝게 나타났고, 민들레 (T2)와 흰민들레 (T5) 간의비유사 값이 26.316으로 나타나 유전적 거리가 가장 멀다는 것을 알 수 있었다.
- 귀화종의 경우 서양민들레의 원종이라 사료되어지는 영국 서양민들레(T8)와 미국 서양민들레(T9) 간의 비유사 값이 3.448로 나타나 유전적으로 구분하기가 매우 어려워 동일한 식물이라 할 수 있었으며 국내에 자생하는 귀화종 서양민들레(T7)와 이들두 서양민들레간의 비유사 값이 8.889-9.890으로 나타나 유전적으로 매우 가깝게 나타나 유전적 변이가 많이 일어나지 않았음을 알 수 있었다. 우리나라에 자생하는 6종의 민들레속 식물(T2~T7) 중에서는 붉은씨서양민들레(T6)와 산민들레(T3)간의 유전적 거리가 가장 먼 31.
- 890으로 나타나 유전적으로 매우 가깝게 나타나 유전적 변이가 많이 일어나지 않았음을 알 수 있었다. 우리나라에 자생하는 6종의 민들레속 식물(T2~T7) 중에서는 붉은씨서양민들레(T6)와 산민들레(T3)간의 유전적 거리가 가장 먼 31.579로 나타났다. 붉은씨서양민들레는 귀화종이 면서도 서양민들레와는 비유 사 값이 대략 19-25의 차이를 나타내며 유전적으로도 멀게 나타났으며 , 또한 국내 자생 민들레류와도 유전적으로 멀게 나타났다.
- 579로 나타났다. 붉은씨서양민들레는 귀화종이 면서도 서양민들레와는 비유 사 값이 대략 19-25의 차이를 나타내며 유전적으로도 멀게 나타났으며 , 또한 국내 자생 민들레류와도 유전적으로 멀게 나타났다.
- Figure 2에서 나타난 것처럼 Bootstrap방법으로 분석한 결과 국내에 자생하는 민들레 6종이 모두 독립적으로 분리되어 있음을 알 수 있었다(Data not shown). Bootstrap분석 결과 자생 민들레 4종간의 유전적 유사성이 T1 과 T2는 87%로 나타났으며, T3과 T4는 76%, Tl, T2와 T3, T4 두 집단간에는 72%로 나타났다. 서양 민들레의 경우 T8과 T9의 두 종간에는 99%로 나타났으며, T9, T8과 T7은 90%, T6과 T7, 8, 9간에는 66%로 나타났다.
- 우리나라에서 자생하는 민들레속 6종의 주요형질을 조사한 결과 I군에 속하는 것은 II군에 비해 개화일수가 길고, 총포의 방향이 다르며 . 털의 유무 또한 달랐다.
- 털의 유무 또한 달랐다. II군에 속하는 흰민들레 (T5)는 다른 민들레종과는 화색에서 확연한 차이를 보였으며 자생종들 속에서도 잎의 방향 및 색, 발아의 생리적 특성 등 여러 다른 점이 복합되어서 II군내에서도 유전적 거리가 가장 먼 것으로 분류되어졌다. 그러나 그밖에 조사되지 않은 외부형태와 대사 작용 등에 특이적으로 작용하는 형질의 발현에 직 .
후속연구
- 그러나 그밖에 조사되지 않은 외부형태와 대사 작용 등에 특이적으로 작용하는 형질의 발현에 직 . 간접적으로 관여하는 단편일 가능성이 있으므로 생물체의 형태적 차이는 유전자를 구성하고 있는 DNA의 염기서열의 차이와 밀접한 관련이 있으므로 보다 정확한 유연관계를 밝히기 위해서는 RFLP방법이나 Fragment sequence를 통해 분자유전학적 계통분류에 의한 분석 이 요구된다고 사료되 는 바이다.
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