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제안 방법
- 16S 리보좀 DNA의 중합효소 연쇄 반응을 위한 프라이머는 NCBI (www.ncbi.rMm.nih.gov)에 등재된 myxobacteria의 16S 리보좀 DNA상의 상동성 검색 및 프라이머 디자인을 통해 forward (5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGG-3), reverse (5'-ATCCAGCC GCAGGTTCCCCTA-3') 프라이머를 고안하였다. Myxobacteria의 16S 리보좀 DNA 서열의 제한효소 작용 부위를 검색하여 RFLP 분석을 위한 제한효소로서 HaelH, EcoRl 및 EcoRV를 선정하였다.
- 5 g을 현탁한 후 이를 멸균된 생리식염수로 100~1, 000배 희석하였다. Coli-spot 배지의 먹이균 위에 토양 희석액을 5~10μl씩 점적한 후 30°C 항온 배양기에 배양하면서 먹이균의 분해환이 생성되는지의 여부를 확인하고, myxobacteria의 swarm과 자실체의 출현 여부를 관찰하였다. 먹이균이 분해되어 형성된 반투명한 용균 부위에서 형성된 swarm과 자실체는 멸균된 바늘을 이용하여 일부를 채취한 다음 VY/2 고체배지에 접종하고 30°C에서 5일 이상 배양하였다.
- 먹이균이 분해되어 형성된 반투명한 용균 부위에서 형성된 swarm과 자실체는 멸균된 바늘을 이용하여 일부를 채취한 다음 VY/2 고체배지에 접종하고 30°C에서 5일 이상 배양하였다. VY/2 고체배지 상에서 투명환을 형성한 균들을 대상으로 광학현미경을 통해 영양세포와 포자의 형태를 관찰하였다.
- 5 kb의 DNA 크기를 확인하였으며, Haem, EcoRI 및 EcoRV (Roche)로, 37°C 에서 1시간 동안 제한효소로 처리하였다. 낮은 농도의 DNA 검출을 위해 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 12% 겔) 분리 후 실버 염색을 하여 DNA 단편을 확인한 다음, Image master2D Elite 프로그램 (Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 스캔한 겔에서의 DNA 분자량을 비교하였다.
- 5%, cyclohexamide(50mg/L))를 사용하였다. 배지 제조 후 먹이균을 멸균된 생리 식염수에 현탁하여 이를 50~100|11씩 배지 표면에 점적하여 건조시킨 다음 myxobacteria 분리에 사용하였다. Myxobacteria의 순수분리, 계대용 배지로는 VY/2 agar (baker's yeast 0.
- 본 연구에서는 토양으로부터 대장균을 먹이균으로 사용한 선택적 분리법으로 용균성 myxobacteria를 분리하고, 여러 myxobacteria 의 16S 리보좀 DNA에 공통적으로 존재하는 염기서열을 조사하여 프라이머를 합성한 후 중합효소 연쇄 반응을 실시하였다. 증폭된 유전자를 제한효소인 HaeHI, EcoRI, EcoRV로 절단한 후 RFLP 양상을 비교하여 분리한 균주의 myxobacteria Family를 확인하였다.
- 대조 균주는 세균 분류학적인 고찰에 근거하여 myxobacteria와 유연관계가 가까운 Proteobaderia (gamma-proteobacteria) 및 유연관계가 먼 균주들을 선별하였다. 선별한 균주들에 대해서는 'Genamics Expression' 프로그램(http://genamics.com)에 의한 분석을 통해 제한효소 인지부위 검색을 실시하였는데, 표준 균주에서 나타난 420 bp 정도의 DNA 단편은 확인할 수 없었다. 선별한 대조 균주에서 16S 리보좀 DNA를 증폭하여, PAGE를 통한 RFLP 분석을 실시한 결과에서도 420 bp 부근의 DNA 단편은 확인되지 않았다(Fig.
- 신규 생리활성 물질을 도출할 수 있는 대상 균주로서, 토양에 존재하는 다양한 종류의 myxobacteria 균주를 분리하고, 분리균이 myxobacteria 인지 여부를 확인하기 위하여 RFLP 분석을 실시하였다. Myxobacteria의 확인을 위해 16S 리보좀 DNA의 제한효소 인지부위 검색 및 RFLP 분석을 통해 myxobacteria를 구분할 수 있음을 확인하였다.
- 용균성 myxobacteria를 분리하기 위해, 멸균된 생 리식염수 5 ml에 토양시료 0.5 g을 현탁한 후 이를 멸균된 생리식염수로 100~1, 000배 희석하였다. Coli-spot 배지의 먹이균 위에 토양 희석액을 5~10μl씩 점적한 후 30°C 항온 배양기에 배양하면서 먹이균의 분해환이 생성되는지의 여부를 확인하고, myxobacteria의 swarm과 자실체의 출현 여부를 관찰하였다.
- Swarm 형성 후 일정기간이 경과하면 swarm 의 옆부분이나 swarm 전체에서 자실체 형성이 관찰되었다. 자실체의 형태는 돌기를 형성하거나 둥근 형태, 둥근 형태가 연속적으로 연결 또는 뭉쳐진 형태 등이었으며, 이 자실체의 일부를 취하여 VY72 한천배지에서 순차적으로 계대배양하여 myxobacteria로 추정되는 균주를 순수분리한 후 16S 리보좀 DNA의 RFLP 분석을 실시하였다.
- 중합효소 연쇄 반응은 DNA 증폭기 (Techgene)를 사용하여 pre-denaturation 94°C 5분, denaturation 94°C 1분, annealing 56°C 1분, extension 72°C 2분을 1 사이클로 하여 30 사이클을 실시하였다. 중합효소 연쇄 반응 후 전기영동하여 1.5 kb의 DNA 크기를 확인하였으며, Haem, EcoRI 및 EcoRV (Roche)로, 37°C 에서 1시간 동안 제한효소로 처리하였다. 낮은 농도의 DNA 검출을 위해 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 12% 겔) 분리 후 실버 염색을 하여 DNA 단편을 확인한 다음, Image master2D Elite 프로그램 (Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 스캔한 겔에서의 DNA 분자량을 비교하였다.
- Myxobacteria의 16S 리보좀 DNA 서열의 제한효소 작용 부위를 검색하여 RFLP 분석을 위한 제한효소로서 HaelH, EcoRl 및 EcoRV를 선정하였다. 중합효소 연쇄 반응은 DNA 증폭기 (Techgene)를 사용하여 pre-denaturation 94°C 5분, denaturation 94°C 1분, annealing 56°C 1분, extension 72°C 2분을 1 사이클로 하여 30 사이클을 실시하였다. 중합효소 연쇄 반응 후 전기영동하여 1.
- 증폭된 유전자를 제한효소인 HaeHI, EcoRI, EcoRV로 절단한 후 RFLP 양상을 비교하여 분리한 균주의 myxobacteria Family를 확인하였다.
- 토양으로부터 분리한 균들 중 swarm 및 자실체를 형성하는 18 균주를 대상으로 Haelll와 EcoRI에 의한 RFLP 분석을 실시하였다(Fig. 5).
- 표준 균주들을 VY/2 고체배지에 배양한 결과, 모든 표준 균주가 대장균에 대해 분해환을 형성하는 것으로 확인되었는데, 이는 용균성 myxobacteria가 다른 미생물을 분해하여 영양원으로 하는 특성과 연관이 있는 것으로 추정되었다. 표준 균주 및 토양 분리균들을 VY/2 고체배지에서 배양 후, swarm 및 자실체를 관찰하고(Fig. 1), 광학현미경(X1, 000)으로 관찰하여 간균 형태의 균주만 선별하였다.
대상 데이터
- 5%)을 사용하였으며, Myxobacteria 분리용 배지로는 Coli-spot 한천 배지 (CaCl? . 2H2O 0.1%, agar 1.5%, cyclohexamide(50mg/L))를 사용하였다. 배지 제조 후 먹이균을 멸균된 생리 식염수에 현탁하여 이를 50~100|11씩 배지 표면에 점적하여 건조시킨 다음 myxobacteria 분리에 사용하였다.
- HaelH/EcoRI의 조합에 의한 RFLP 분석을 myxobacteria에 적용할 수 있는지 알아보기 위해 대조 균주를 선정하였다. 대조 균주는 세균 분류학적인 고찰에 근거하여 myxobacteria와 유연관계가 가까운 Proteobaderia (gamma-proteobacteria) 및 유연관계가 먼 균주들을 선별하였다.
- gov)에 등재된 myxobacteria의 16S 리보좀 DNA상의 상동성 검색 및 프라이머 디자인을 통해 forward (5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGG-3), reverse (5'-ATCCAGCC GCAGGTTCCCCTA-3') 프라이머를 고안하였다. Myxobacteria의 16S 리보좀 DNA 서열의 제한효소 작용 부위를 검색하여 RFLP 분석을 위한 제한효소로서 HaelH, EcoRl 및 EcoRV를 선정하였다. 중합효소 연쇄 반응은 DNA 증폭기 (Techgene)를 사용하여 pre-denaturation 94°C 5분, denaturation 94°C 1분, annealing 56°C 1분, extension 72°C 2분을 1 사이클로 하여 30 사이클을 실시하였다.
- 배지 제조 후 먹이균을 멸균된 생리 식염수에 현탁하여 이를 50~100|11씩 배지 표면에 점적하여 건조시킨 다음 myxobacteria 분리에 사용하였다. Myxobacteria의 순수분리, 계대용 배지로는 VY/2 agar (baker's yeast 0.5%, CaCl2 . 2H2O 0.1%, agar 1.5%, cyanocobalamin 0.5 mg/L)를 사용하였으며, 표준균주 및 토양 분리 균주는 3(rc에서 배양하였다.
- Myxobacteria의 표준 균주로서 Myxococcus xanthus ATCC 25232, Myxococcus Julvus ATCC 25199, Cystobacter fuscus ATCC 25194, Mellitangium lichenicola ATCC 25944, Stigmatella aurentiaca ATCC 25190, Polyangium cellulosum ATCC 25531, Archangium gephyra DSM 2261, Chondromyces apiculatus DSM 436, Nannocystis exedens DSM 기의 9종 균주를 American Type Culture Collection (ATCC) 및 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)에서 구입하여 사용하였다. 용균성 myxobacteria의 분리를 위한 먹이균으로 E.
- coli DH5a를 사용하였다. RFLP 분석에 사용한 시약은 Takara, Roche 사에서, 배지 제조를 위한 시약은 Difco, Sigma 사에서 구입하였다. 먹이균 배양배지는 Luria-Bertani (LB) 배지(tryprone 1%, yeast extract 0.
- 수 있는지 알아보기 위해 대조 균주를 선정하였다. 대조 균주는 세균 분류학적인 고찰에 근거하여 myxobacteria와 유연관계가 가까운 Proteobaderia (gamma-proteobacteria) 및 유연관계가 먼 균주들을 선별하였다. 선별한 균주들에 대해서는 'Genamics Expression' 프로그램(http://genamics.
- RFLP 분석에 사용한 시약은 Takara, Roche 사에서, 배지 제조를 위한 시약은 Difco, Sigma 사에서 구입하였다. 먹이균 배양배지는 Luria-Bertani (LB) 배지(tryprone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, agar 1.5%)을 사용하였으며, Myxobacteria 분리용 배지로는 Coli-spot 한천 배지 (CaCl? . 2H2O 0.
- 용균성 myxobacteria의 분리를 위한 먹이균으로 E.coli DH5a를 사용하였다. RFLP 분석에 사용한 시약은 Takara, Roche 사에서, 배지 제조를 위한 시약은 Difco, Sigma 사에서 구입하였다.
- 토양 미생물의 분리를 위하여 국내(강원, 충남, 경기 일대) 및 국외(영국, 미국) 일대의 토양에서 시료를 채취하였다. 채취한 토양은 상온에서 24~48시간 동안 건조한 다음, myxobacteria 분리에 사용하였다.
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