RFLP, PLFA, CLSU를 이용한 폐기물연용토양의 토양미생물 특성 평가 비교 Comparison of Biological Characteristics on the Organic Waste-treated Lysimeter Soil by RFLP, PLFA, and CLSU원문보기
폐기물 연용토양의 미생물 군집 분석을 위해 공단지역 하수 슬러지 처리등 16처리(3수준)에 대하여 가장 좋은 방법을 찾고자, RFLP, CLSU, PLFA, TGGE 의 4가지 방법을 이용하였으며, 이들 4가지 방법에 대하여 시기별 군집변동 조사를 통한 통계적 비교 분석을 하였다. 그 결과, 미생물의 경시적 군집 변동상 관찰은 PLFAs (Phospholipid Fatty Acids) 방법이 가장 효율적이었으며 RFLP는 많은 종류의 제한 효소의 사용이 필요하다. TGGE는 DNA 추출을 통해 비배양학적인 분석에서는 가장 좋은 방법이나 PCR조건 등 실험 과정에서 토양종류에 따라 민감하게 반응하여 비슷한 조성의 토양분석에 효율적이라고 생각한다.
폐기물 연용토양의 미생물 군집 분석을 위해 공단지역 하수 슬러지 처리등 16처리(3수준)에 대하여 가장 좋은 방법을 찾고자, RFLP, CLSU, PLFA, TGGE 의 4가지 방법을 이용하였으며, 이들 4가지 방법에 대하여 시기별 군집변동 조사를 통한 통계적 비교 분석을 하였다. 그 결과, 미생물의 경시적 군집 변동상 관찰은 PLFAs (Phospholipid Fatty Acids) 방법이 가장 효율적이었으며 RFLP는 많은 종류의 제한 효소의 사용이 필요하다. TGGE는 DNA 추출을 통해 비배양학적인 분석에서는 가장 좋은 방법이나 PCR조건 등 실험 과정에서 토양종류에 따라 민감하게 반응하여 비슷한 조성의 토양분석에 효율적이라고 생각한다.
The application of sludge wastes into agricultural fields has been increasing annually in Korea. In particular, sewage sludge application has been widely accepted in decades. Sewage sludge application aid in the recycling of essential nutrients and act as a source of organic matter improving the str...
The application of sludge wastes into agricultural fields has been increasing annually in Korea. In particular, sewage sludge application has been widely accepted in decades. Sewage sludge application aid in the recycling of essential nutrients and act as a source of organic matter improving the structure and water-holding properties of the soil. The efficient use of sludge wastes, however, requires an individual assessment of waste products. This study assessed the biological characteristics of organic waste-treated lysimeter soils and develop its indicator to assess the soil health of organic waste-treated lysimeter soils. Several analytical techniques more recently developed such as restriction fragment length polymorphism (RFLP), phospholipid fatty acid (PLFA), and community level substrate utilization (CLSU) fingerprints allow for detailed analyses of soil microbial communities. PLFA and RFLP was, therefore, used in the study to characterize the microbial communities in soil without the need to isolate individual fungi and bacteria. PLFA, RFLP and CLSU have been utilized to assess microbial characteristics of the lysimeter soils with four different sludge wastes for eight consecutive years. Each of these methods was analyzed for a different aspect of soil microbial characteristics. The study would disclose those methods yielded highly reproductive results for each soil and allow distinguishing the soils based on the structures of specific geneand PLFA-pools more than CLSU fingerprints. PLFA methods, especially, revealed the same relative similarities of the treated soils based on cluster analysis of the biological characteristics. Pig manure compost-treated soil, however, was only the same relative resemblance among the three methods. These results indicated that PLFA easily assessed the biological soil characterization.
The application of sludge wastes into agricultural fields has been increasing annually in Korea. In particular, sewage sludge application has been widely accepted in decades. Sewage sludge application aid in the recycling of essential nutrients and act as a source of organic matter improving the structure and water-holding properties of the soil. The efficient use of sludge wastes, however, requires an individual assessment of waste products. This study assessed the biological characteristics of organic waste-treated lysimeter soils and develop its indicator to assess the soil health of organic waste-treated lysimeter soils. Several analytical techniques more recently developed such as restriction fragment length polymorphism (RFLP), phospholipid fatty acid (PLFA), and community level substrate utilization (CLSU) fingerprints allow for detailed analyses of soil microbial communities. PLFA and RFLP was, therefore, used in the study to characterize the microbial communities in soil without the need to isolate individual fungi and bacteria. PLFA, RFLP and CLSU have been utilized to assess microbial characteristics of the lysimeter soils with four different sludge wastes for eight consecutive years. Each of these methods was analyzed for a different aspect of soil microbial characteristics. The study would disclose those methods yielded highly reproductive results for each soil and allow distinguishing the soils based on the structures of specific geneand PLFA-pools more than CLSU fingerprints. PLFA methods, especially, revealed the same relative similarities of the treated soils based on cluster analysis of the biological characteristics. Pig manure compost-treated soil, however, was only the same relative resemblance among the three methods. These results indicated that PLFA easily assessed the biological soil characterization.
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문제 정의
DNA를 통한 오염환경에 대한 군집 변동, 분석은 지표미생물의 기능적인 측면도 분석이 가능하며 이러한연구는 국내에서는 미흡한 편이다. 본 연구는 생화학적방법 및 유전공학기법을 활용하여 오염 농경지내 미생물의 경시적 변동조사 및 특정 오염지역의 평가 기법을 개발하는 기초 자료로 활용하고자 수행하였다.
제안 방법
2. Cluster analysis of the transformed data sets derived from Biolog analysis, MSS : Municipal Sewage Sludge-treated Soils, ISS : Industrial Sewage Sludge-treated Soils, LS : Leather Processing Sludge-treated Soils, FS : Alcohol Fermentation Processing Sludge-treated Soils, PMC : Pig Manure Compost-treated Soils.
5. Cluster analysis of the transformed data sets derived from PLFA analysis, MSS : Municipal Sewage Sludge-treated Soils, ISS : Industrial Sewage Sludge-treated Soils, LS : Leather Processing Sludge-treated Soils, FS : Alcohol Fermentation Processing Sludge-treated Soils, PMC : Pig Manure Compost-treated Soils.
3. Cluster analysis of the transformed data sets derived from RFLP analysis, MSS : Municipal Sewage Sludge-treated Soils, ISS : Industrial Sewage Sludge-treated Soils, LS : Leather Processing Sludge-treated Soils, FS : Alcohol Fermentation Processing Sludge-treated Soils, PMC : Pig Manure Compost-treated Soils.
4. Cluster analysis of the transformed data sets derived from TGGE analysis, MSS : Municipal Sewage Sludge-treated Soils, ISS : Industrial Sewage Sludge-treated Soils, LS : Leather Processing Sludge-treated Soils, PMC : Pig Manure Compost-treated Soils.
Hae Ⅲ 제한 효소를 이용한 RFLP 방법에 의해 공시토양의 유전적 유사도를 알아보았다(Fig. 3). 총 4 개의 클러스터로 분석되었으나 토양 처리별로 뚜렷한경향을 볼 수가 없었다.
돈분퇴비 처리구(PMC)와 공단지역 하수 슬러지 처리구(ISS)는 수준별로 같은 클러스터를 형성하였으며 대조구(NPK)와 돈분퇴비 처리구(PMC)는 동일한 클러스터에 포함되었다. 반면에, 피혁오니 처리구(LS) 와 주정오니 처리구(FS)는 수준별로 다른 클러스터를 형성하였다(Fig 2).
PLFA 방법은 동결 건조한 토양샘플을 2mm체로 친후 Klamer(1998)방법에 준하여 실시하였으며, Widmer(2001) 방법에 의해 토양의 총 DNA를 추출하여 TGGE는 Felske(1998)방법, RFLP는 송 등 (1999) 및 Montagne(2002)의 방법에 준하여 DNA fingerprinting에 의해 군집구조를 해석하였다. 또한 CLSU는 Smalla(1998)의 방법에 준하여 채취한 토양샘플을 100배로 희석하여 BIOLOG GN2 microplate에 200ul씩 접종한 후 Eliza reader로 발색 값을 측정하여 대사적 유사도를 분석하였다. 발색 적정시간을 찾고자 토양샘플 중 돈분처리구(PMC)와 대조구(NPK) 샘플을 시간대별로 측정해본 결과(Fig.
또한, 공시 토양으로부터 처리별 genomic DNA를 추출하여 이들의 16s rDNA를 PCR로 증폭하여TGGE를 통한 각처리간의 다형성을 비교해 보았다 (Fig. 4). 그 결과, 화학비료를 시용한 대조구를 포함한 5처리구의 미생물 군집은 2개의 클러스터를 형성하였다.
미생물 군집 분석법 비교 미생물의 경시적 군집변동조사를 위한 체계적이고 효율적인 방법을 선발하고자 Phospholipid Fatty Acids (PLFAs), Teperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Community Level Substrate Utilization (CLSU) 등총 4가지 방법을 사용하였으며, 각각의 방법으로 폐기물 장기연용 토양별 유연관계를 분석하였다. PLFA 방법은 동결 건조한 토양샘플을 2mm체로 친후 Klamer(1998)방법에 준하여 실시하였으며, Widmer(2001) 방법에 의해 토양의 총 DNA를 추출하여 TGGE는 Felske(1998)방법, RFLP는 송 등 (1999) 및 Montagne(2002)의 방법에 준하여 DNA fingerprinting에 의해 군집구조를 해석하였다.
또한 CLSU는 Smalla(1998)의 방법에 준하여 채취한 토양샘플을 100배로 희석하여 BIOLOG GN2 microplate에 200ul씩 접종한 후 Eliza reader로 발색 값을 측정하여 대사적 유사도를 분석하였다. 발색 적정시간을 찾고자 토양샘플 중 돈분처리구(PMC)와 대조구(NPK) 샘플을 시간대별로 측정해본 결과(Fig. 1), 샘플 접종 후 약 45분 후에 처리별로 가장 안정된 값을 보여 45 분을 측정시간으로 선발하였다. 이렇게 4가지 방법에 의해 주어진 값들은 모두 SAS 통계 프로그램을 이용하여 유연관계를 분석하였다.
폐기물 연용토양의 미생물 군집 분석을 위해 공단지역 하수 슬러지 처리등 16처리(3수준)에 대하여 가장 좋은 방법을 찾고자, RFLP, CLSU, PLFA, TGGE 의 4가지 방법을 이용하였으며, 이들 4가지 방법에 대하여 시기별 군집변동 조사를 통한 통계적 비교 분석을 하였다. 그 결과, 미생물의 경시적 군집 변동상 관찰은 PLFAs (Phospholipid Fatty Acids) 방법이 가장 효율적이었으며 RFLP는 많은 종류의 제한효소의 사용이 필요하다.
대상 데이터
공시 토양 본 연구를 위하여 Table 1과 같이 생활하수오니(MSS), 공간하수오니(ISS), 피혁오니(LS), 주정오니(FS)등 4종류의 폐기물과 대조구로서 3요소 구(NPK)를 라이시미터에 ha당 12.5톤, 25톤, 50톤을 7년동안 시용한 연용포장의 토양을 사용하였다(원 등, 2004).
데이터처리
1), 샘플 접종 후 약 45분 후에 처리별로 가장 안정된 값을 보여 45 분을 측정시간으로 선발하였다. 이렇게 4가지 방법에 의해 주어진 값들은 모두 SAS 통계 프로그램을 이용하여 유연관계를 분석하였다.
이론/모형
PLFA 방법은 동결 건조한 토양샘플을 2mm체로 친후 Klamer(1998)방법에 준하여 실시하였으며, Widmer(2001) 방법에 의해 토양의 총 DNA를 추출하여 TGGE는 Felske(1998)방법, RFLP는 송 등 (1999) 및 Montagne(2002)의 방법에 준하여 DNA fingerprinting에 의해 군집구조를 해석하였다. 또한 CLSU는 Smalla(1998)의 방법에 준하여 채취한 토양샘플을 100배로 희석하여 BIOLOG GN2 microplate에 200ul씩 접종한 후 Eliza reader로 발색 값을 측정하여 대사적 유사도를 분석하였다.
성능/효과
분석을 하였다. 그 결과, 미생물의 경시적 군집 변동상 관찰은 PLFAs (Phospholipid Fatty Acids) 방법이 가장 효율적이었으며 RFLP는 많은 종류의 제한효소의 사용이 필요하다. TGGE는 DNA 추출을 통해 비배양학적인 분석에서는 가장 좋은 방법이나 PCR 조건 등 실험 과정에서 토양종류에따라 민감하게 반응하여 비슷한 조성의 토양분석에 효율적이라고 생각한다.
미생물 군집 분석법 비교 및 선발 유일 탄소원이용능(CLSU)의 클러스터 분석을 통하여 폐기물 연용토양의 처리별 생리적 대사 다양성을 비교해 본 결과, 미생물 군집은 3개의 클러스터를 형성하였다. 돈분퇴비 처리구(PMC)와 공단지역 하수 슬러지 처리구(ISS)는 수준별로 같은 클러스터를 형성하였으며 대조구(NPK)와 돈분퇴비 처리구(PMC)는 동일한 클러스터에 포함되었다.
또한 ISS 처리구는 단독으로 클러스터를 형성하여 다른 처리구와 분명한 차이를 보였다. 이상의 결과로, PLFA 방법 등 총 4가지 방법을 사용하여 폐기물 장기 연용토양의 군집구조를 분석한 결과, 모두 비슷한 경향을 보였다. DNA, PLFA와 CLSU 방법은 토양의 생물학적 특징을 분석하는 데 일반적으로 사용된다(Zelles 등, 1992).
지방산 추출법(PLFA)에 의해 미생물의 군집구조를 조사한 결과(Fig. 5), 3개의 클러스터로 분석되어 졌으며, NPK 처리구와 LS, PMC 처리구가 같은 클러스트로 속했으며 MSS 처리구와 FS 처리구가 같은 클러스터로 형성되었다. 또한 ISS 처리구는 단독으로 클러스터를 형성하여 다른 처리구와 분명한 차이를 보였다.
3). 총 4 개의 클러스터로 분석되었으나 토양 처리별로 뚜렷한경향을 볼 수가 없었다. 특히, 피혁오니(LS) 12.
참고문헌 (16)
？Felske, A., Wolterink, A., Lis, R.V., and Akkermans, A.D.L.. 1998. Phylogeny of the main bacterial 16S rRNA sequences in drentse a grassland soils (The Netherlands). Appl. Envir. Microbiol. 64(3):871-879.
Montagne, M.G.. Michel, F.C. Holden, P.A. and Reddy, C.A. 2002. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis. Journal of Microbiological Methods. 49: 255-264.
Muyzer, G., and Smalla, K. 1998. Application of Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and temprature gradient gel electrophoresis(TGGE) in microbial ecology.
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Smalla, K. Wachtendorf, U., Heuer, H., LIU, W.T., and Forney, L. 1998. Analysis of BIOLOG GN substrate utilization patterns by microbial communities. Appl. Envir. Microbiol. 64(4):1220-1225.
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Widmer, F., Fliebach, A., Laczko, E., Schulze-Aurich, J., and Zeyer, J. 2001. Assessing soil biological characteristics: a comparison of bulk soil community DNA-, PLFA-, and Biolog-analyses. Soil Biology & Biochemistry 33 : 1029-1036.
Widmer, F., Seidler, R.J., Gillevet, P.M., and Watrud, L.S., 2002. A highly selective PCR protocol for detecting 16S rRNA genes of the genus Pseudomonas (sensu stricto) in environmental samples. Appl. Envir. Microbiol. 1998 64: 2545-2553
Zelles, L., Bai, Q.Y., Beck, T., and Beese, F., 1992. Signature fatty acids in phospholipids and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biology & Biochemistry 24: 317-323.
Zhou, G. Whong, W.Z. Ong, T. and Chen, B. 2000. Development of a fungus-specific PCR assay for detecting low-level fungi in an indoor environment. Molecular and Cellular Probes. 14(6): 339-348.
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