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문제 정의
- 본 연구에서는 식품부산물인 미강 단백질 필름 포장재을 이용한 식품의 저장 시, 미강 단백질 필름의 짧은 저장기간의 문제점을 해결하기 위한 방법으로 미강배지에서 bacteriocin을 생산할 수 있는 Pseudomonas putida 21025를 직접 미강에 배양하여 bacteriocin이 배양된 미강으로부터 필름용 단백질을 추출하고 필름 포장재로 가공함으로써 필름의 저장성뿐만이 아니라 항균 기능성이 부여된 포장재를 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 이용하고 있다. 가열, 동결건조, 자연건조 등의 물리적 방법과 미생물발효에 의한 방법, 염장법, 당장법, 훈연법, 대기환경을 조절하는 MA포장, CA저장, 화학 합성 방부제 첨가 등의 방법을 사용하였다. 그러나 이러한 방법은 모든 식품에 적용되지 못하며, 화학합성 방부제의 경우 식품에 대한 사용량이 제한되어져 있다.
- , USA)를 이용하였다. 미강의 일반성분은 수분 13.5%, 단백질 13.2%, 지방 18.3%, 당질 38.3%, 섬유소 7.8%, 회분 8.9%이며 bacteriocin 생성 균주는 탄소원으로 당질, 질소원으로 단백질을 이용하므로 다른 성분을 첨가하지 않고 미강 액체배지를 그대로 사용하였다.
- 미강 고체 배지에 Pseudomonas patida를 접종하여 30℃에서 33시간 배양한 후 지시균주를 107 cell을 포함한 0.75% soft TSA 4 ㎖를 Pseudomonas putida를 접종한 미강 고체 배지에 분주하여 30℃ 에서 12시간 배양하여 억제환을 관찰하였다.
- 5% TSA에 분주한다. Soft TSA가 굳으면 Pseudomonas putida 21025를 미강 액체배지에 30℃, 33시간 배양한 배양액을 6500rpm으로 4℃, 20분간 원심분리하여 상등액을 0.45㎛ Cellulose Acetate syringe filter로 여과하여 제균한 배양액을 항생물질 검정용 여지에 100㎕를 분주하여 30℃, 37℃ 에서 12시간 후 억제환을 관찰하였다. Bacteriocin을 2배씩 희석하여 항균활성(activity units, AU)을 계산하였다.
- 45㎛ Cellulose Acetate syringe filter로 여과하여 제균한 배양액을 항생물질 검정용 여지에 100㎕를 분주하여 30℃, 37℃ 에서 12시간 후 억제환을 관찰하였다. Bacteriocin을 2배씩 희석하여 항균활성(activity units, AU)을 계산하였다. 결과는 2회 반복하여 나타내었다.
- 침전물을 소량의 10mM 인산염 완충용액(pH 7)에 용해시킨 후, Spectra-Por no. 3 dialysis tubing(molecular weight cutoff 3,500, Spectrum Medical Industries, U.S.A.)을 이용하여 4℃ 에서 48시간 투석하였다.
- 미강 단백질 필름의 저장에 따른 부패도를 실험하기 위해 아미노태 질소량을 측정하였다.
- Bae와 Jang(9)의 미강에서의 단백질 추출법을 이용하여 미강을 pH 9.4에서 10% 에탄올로 추출하였다.
- 미강 추출액을 가온 교반기를 사용하여 교반하면서 80℃에 이를 때까지 가열하여 가소제로 글리세롤 2%를 첨가한다. 80℃에 이르면 2분 더 가열한 후 방냉하고, 40℃에 이르면 각각 105 cell을 포함한 지시균, 105 cell을 포함한 지식균과 제균한 배양액 5%, 105 cell을 포함한 지식균과 제균한 배양액 10%를 첨가하여 25℃ 에서 24시간 건조한 단백질 필름의 부패도를 조사하기 위해 아미노태 질소량을 측정하였다.
- 80℃에 이르면 2분 더 가열한 후 방냉하고, 40℃에 이르면 각각 105 cell을 포함한 지시균, 105 cell을 포함한 지식균과 제균한 배양액 5%, 105 cell을 포함한 지식균과 제균한 배양액 10%를 첨가하여 25℃ 에서 24시간 건조한 단백질 필름의 부패도를 조사하기 위해 아미노태 질소량을 측정하였다.
- 식품의약품안전청 식품공전에 제시된 포르몰법을 이용하여(18), 부패도에 따른 아미노태 질소량 측정을 위해 각각의 필름에 지시균과 제균한 배양액을 첨가하였다. 미강 단백질필름 1g을 250㎖의 증류수에 녹인 후 0.
- Bacteriocin을 함유한 단백질 포장재의 식품의 방부효과를 조사하기 위해 슬라이스 햄을 포장한 bacteriocin 함유 단백질 포장재 표면에 지시균을 접종하여 포장된 햄의 미생물번식 정도를 조사하였다.
- 대조군은 슬라이스 햄 약 3g에 지시균주를 직접 접종하였으며, 시료는 지시균주가 접종된 슬라이스 햄 약 3g에 미강 단백질 포장재와 bacteriocin 함유 미강 단백질 포장재로 포장하여 균증식도를 비교하였다.
- 와 Pseudomonas sp. 등 9종을 spot-on-lawn과 modified deferred 방법을 이용하여 항균 활성을 조사하였다(Table 1). Bacteriocin은 항균물질 생성 균주 자신과 계통, 분류학적으로 근접한 균종으로 항균 활성을 나타내는 것과 같이 modified deferred 방법으로 실험한 결과는 Pseudomonas sp.
- 미강 단백질 필름의 저장성을 조사하기 위하여 지시균과 bacteriocin을 첨가하여 저장 시 단백질의 부패도를 보기 위해 아미노태 질소함량을 측정하였다.(Fig 2)
- 햄을 이용하여 필름과 20% bacteriocin을 함유한 필름의 방부효과를 조사하기 위해 햄에 임의적으로 균을 접종하여 그 균의 번식도를 조사하였다(Fig 3).
- Pseudomonas putida 21025의 항균활성은 modified deferred 방법을 이용하여 미강 고체 배지로 지시균주에 대한 항균활성을 실험하였다.
대상 데이터
- 본 연구는 Pseudomonas putida ATCC21025를 ATCC에서 분양 받아 사용하였다. 또한 미강 배지에서 bacteriocin 생성 가능한 Pseudomonas putida ATCC21025의 힝균력 및 활성범위를 조사하고자, 쌀에 존재하며 토양미생물인 Bacillus sp.
- 와 Jseudomonas sp. 균주 등 9개 균주 Escherichia coli KCTC1039, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027, Pseudomonas putida VT(2C21Q25, Pseudomonas methanolica ATCC21960, Pseudomonas luorenscens KCTC1767, Bacillus subtilis ATCC6633, Bacillus nacerans KCTC1822, Bacillus cereus KCTC2744, Bacillus nagaterium KCTC2178, Micrococcus luteus ATCC9341를 ATCC와KCTC에서 분양 받아 사용하였다. 배지는 미강배지와 TRYPTIC SOY BORTH, SOYBEAN- CASEIN DIGEST AGAR DEHYDRATED (DIFCO Inc.
- 균주 등 9개 균주 Escherichia coli KCTC1039, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027, Pseudomonas putida VT(2C21Q25, Pseudomonas methanolica ATCC21960, Pseudomonas luorenscens KCTC1767, Bacillus subtilis ATCC6633, Bacillus nacerans KCTC1822, Bacillus cereus KCTC2744, Bacillus nagaterium KCTC2178, Micrococcus luteus ATCC9341를 ATCC와KCTC에서 분양 받아 사용하였다. 배지는 미강배지와 TRYPTIC SOY BORTH, SOYBEAN- CASEIN DIGEST AGAR DEHYDRATED (DIFCO Inc., USA)를 이용하였다. 미강의 일반성분은 수분 13.
이론/모형
- Bacteriocin 활성은 spot-on-lawn 방법을 이용하여 분석하였다. 지시균주를 107 cell을 포함한 0,75% soft TSA 4㎖를 1.
- Bacteriocin의 부분정제는 Pseudomonas putida 21025를 미강 액체배지에 36시간 배양한 배양액을 6500rpm으로 4℃, 20분간 원심분리한 상등액을 황산암모늄에 의한 염석법을 이용하였다.
성능/효과
- 에 항균력을 보이며, Bacillus sp.에도 항균 활성을 나타내며, 특히 Bacillus subtilis에 큰 항균활성을 나타내었다(Fig 1, Table 1). 그러나 대상 균주에 대한 항균 효과가 modified-deferred 방법과 spot-on-lawn 방법으로 실험한 결과가 차이를 보이는 것은 본 연구의 Pseudomonas putida 21025가 생산하는 항균물질이 bacteriocin 외에도 bacteriophage나 H2O2와 같은 물질이 항균 효과에 기여하기 때문이라 추정된다.
- 그러므로 20분 이내의 가열이 bacteriocin의 안정성을 위하여 권장된다. 또한 25℃에서의 활성실험은 미강 단백질 필름 건조시 온도를 고려하려 행하였으며 활성이 안정한 것을볼 수 있었다. 또한 미강 단백질을 추출할 경우 pH 9~9.
- 또한 25℃에서의 활성실험은 미강 단백질 필름 건조시 온도를 고려하려 행하였으며 활성이 안정한 것을볼 수 있었다. 또한 미강 단백질을 추출할 경우 pH 9~9.5로 적정할 경우 bacteriocin에 큰 영향을 주지 않을 것으로 보여지며 단백질 추출시 이용되는 10% 에탄올에는 안정할 것으로 보인다.
- 10% bacteriocin을 첨가한 필름은 8일째부터 아미노태 질소함량이 증가하지 않았으며, 5% bacteriocin은 12일째부터 아미노태 질소함량이 증가하지 않았다. 또한 bacteriocin을 첨가하지 않은 필름은 10% bacteriocin을 첨가한 필름에 비해20일 저장 시, 90mg% 증가를 나타내었다.
- 질소함량이 증가하지 않았다. 또한 bacteriocin을 첨가하지 않은 필름은 10% bacteriocin을 첨가한 필름에 비해20일 저장 시, 90mg% 증가를 나타내었다. 따라서 bacteriocin을첨가한 미강 단백질 필름의 단백질 부패도가 감소하는 것으로 보아 단백질 필름의 짧은 저장성을 보완할 수 있을 것으로 보인다.
- 필름포장재을 사용하지 않은 대조군은 균수가 급증하는 것에 비해 20% bacteriocin 함유 필름포장제를 사용한 햄에서는 균수의 증가율이 20% 정도 증가현상을 보였다 Bacteriocin을 함유하지 않은 필름에 포장돤 햄 또한 균수의 증가율이 50% 정도 급증하는 결과를 나타내었다. 따라서 Bacteriocin을 함유한 필름포장제는 지시균에 대해 항균력을 지닌 것으로 나타내었다.
- 4일 이후에 모든 시료의 균수가 감소한 것은 또한 햄의 완전 코팅방법을 고안하지 않고 공기중 수분과 오염물질만을 차단하여 실험한 결과 햄 자체의 수분이 증발하여 3일째 햄의 건조에 의해 균수가 감소한 것으로 보여진다. 따라서 미강 단백질 필름의 사용 시 식품고유의 품질을 유지할 수있는 코팅방법의 고안이 필요할 것으로 보인다.
후속연구
- 또한 bacteriocin을 첨가하지 않은 필름은 10% bacteriocin을 첨가한 필름에 비해20일 저장 시, 90mg% 증가를 나타내었다. 따라서 bacteriocin을첨가한 미강 단백질 필름의 단백질 부패도가 감소하는 것으로 보아 단백질 필름의 짧은 저장성을 보완할 수 있을 것으로 보인다.
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