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문제 정의
- 따라서 다양한 조건에 따라 추출된 6-glucan의 생리활성을 서로 비교해 볼 필요성은 매우 크다. 그러므로 본 연구에서는 귀리에 함유되어 있는 0 -glucan을 건강 및 기능성 식품소재로 개발하기 위하여 귀리 겉겨(bran)로부터 8잉ucan을 중심합성계획에 의해 추출하고, 분리된 각 6-glucan분획들의 생물활성을 검토하였다.
가설 설정
- 1)All values are mean±S.D., and means in a column sharing a same letter are not significantly diffferent(p<0.05).
제안 방법
- 그 후 침전물을 회수하여 95%에탄올로 2회 반복하여 세척하고 난 다음, 동결건조하여 귀리겉겨로부터 수용성 6-glucan을 얻었다. 6-glucan의 추출조건은 Fig. 1의 귀리 수용성 6잉ucan추출공정중에서 가장 중요한 요인으로 작용하는 추출온도(XI), 에탄올농도(X2) 및 pH(X3)를 각각 독립변수로 선정하였고, table 1에서와 같이 이를 각각 5수준(-2, -1, 0, 1, 2)으로 하여 중심합성계획 (central composite design)에 의해 설계하여 16가지의 서로 다른 조건으로 추출하였다.
- 1#를 혼합하여 멸균된 petri-dish에 주입하고 2~3시간 방치하여 고형화시킨 다음, 멸균된 직경 8mm의 filter paper disc를 평판위에 올려놓았다. 귀리 -glucan 시료를 250 및 500µg/disc농도가 되도록 주입한 후 30℃의 incubator에서 48시간 동안 정치배양하면서 disc주변의 clear zone(mni)을 측정하여 항균력을 조사하였다. 이때 사용한 피검균은 총 6종으로 gram positive bacteria 3종 (Listeria monocytogenes ATCC 19111, Bacillus subtilis KCCM 11204, Sthaphylococcus aureus KCCM 32395) 과 gram negative bacteria 3 종(Samtonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli O157.
- 항산화활성은 Blois등의 방법(17)을 변형하여 전자공여능 (electron donating ability, EDA) 실험법으로 측정하였다. 5%(5#)의 귀리 J3-glucan시료를 조제하여 이 시료용액 0.
- 귀리 수용성 6-glucan시료의 암세포에 대한 생육 저해 능을 조사하기 위해 이용한 암 세포주는 인간의 위암세포인 AGS(gastric carcinoma, human), 간암세포 Hep3B(hepatocellular carcinoma, human) 및 폐암세포인 A549(lung carcinoma, human)이었으며, 시료의 세포독성을 알아보기 위하여 사람의 정상 간세포인 WRL 68을 사용하여 selectivity를 구하였다. WRL 68, Hep3B 및 AGS세포주의 배양은 DMEM (Delbecco's modified eagle medium) 배지를 사용하였고, A549 는 RPMI 1640배지에서 10% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 37*C의 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 실험 대상 세포를 4~5#의 농도가 되도록 96well plate의 각 well에 배지와 함께 100#씩 첨가한 후 24 시간 동안 37 ℃ 의 CO2 incubator에서 배양하였다. 그 후 0.25, 0.5 및 LOmgW농도로 조제한 귀리 수용성 E-glucan시료를 100#씩 첨가하여 48시간 동안 배양한 다음, 상등액을 제거하고 냉각한 10%(w/v)의 TCA(trichloroacetic acid)용액 100#를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후 증류수로 수회 세척하고 실온에서 plate를 건조한 다음, 각 well에 l%(v/v)의 acetic acid에 녹인 0.
- 4%(w/v)의 SRB용액을 100#씩을 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 염색되지 않은 잔존 SRB염색액은 1%의 acetic acid로 세척하고 건조한 후 10mM의 tris buffer용액 100以를 첨가하여 염색액을 녹여 microplate reader를 이용하여 540run에서 흡광도를 측정하여 암세포 생육저해능(%)을 구하였다.
대상 데이터
- 귀리로부터 수용성 6-glucan을 분리하기 위하여 사용한 귀리 겉겨 (bran) 원료는 (주)보락으로부터 OBC(Oat Bran Concentrate, Avena Ltd. Finland)를 공급받아 사용하였다.
- 귀리 -glucan 시료를 250 및 500µg/disc농도가 되도록 주입한 후 30℃의 incubator에서 48시간 동안 정치배양하면서 disc주변의 clear zone(mni)을 측정하여 항균력을 조사하였다. 이때 사용한 피검균은 총 6종으로 gram positive bacteria 3종 (Listeria monocytogenes ATCC 19111, Bacillus subtilis KCCM 11204, Sthaphylococcus aureus KCCM 32395) 과 gram negative bacteria 3 종(Samtonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli O157.H7932, Proteus mirabilis KCCM 11327) 을 각각 사용하였다.
- 0 畝를 가하고 약 10초간 진탕한 다음, 10분간 실온에서 반응시킨 후 525nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 전자공여 능(%)의 계산은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차를 각각 구하여 백분율로 환산하였고, 대조용 시료로는 BHT(buthylated hydroxytoluene), Vitamin C 및 Vitamin E를 각각 사용하였다.
- WRL 68, Hep3B 및 AGS세포주의 배양은 DMEM (Delbecco's modified eagle medium) 배지를 사용하였고, A549 는 RPMI 1640배지에서 10% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 37*C의 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 각종 암세포에 대한 귀리 수용성 8-잉 ucan 의 생육저해능의 검정은 SRB(sulforhodamine B) assay(18)에 따라 다음과 같이 수행하였다.
데이터처리
- 귀리의 수용성 $-glucan을 중심합성계획에 의해 설정된 총 16종의 조건에 따라 시료를 추출하였고 이의 생리활성을 검토하여 얻은 결과는 평균치 또는 평균치士표준편차로 나타내었으며, 각 실험값의 유의성 검정은 SAS program을 이용하여 Dmcan의 multiple range test로 분석하였다.
이론/모형
- 귀리 수용성 #glucan의 항균력검정은 paper disc를 이용한 agar diffusion method(16)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. TSA(tryptic soy agar)배지를 조제하여 시험관에 20 #씩 분주하고 12KC에서 15분간 살균한 다음, 45~5(TC의 항온수조에 넣어 배지를 일정한 온도로 유지하였다.
- WRL 68, Hep3B 및 AGS세포주의 배양은 DMEM (Delbecco's modified eagle medium) 배지를 사용하였고, A549 는 RPMI 1640배지에서 10% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 37*C의 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 각종 암세포에 대한 귀리 수용성 8-잉 ucan 의 생육저해능의 검정은 SRB(sulforhodamine B) assay(18)에 따라 다음과 같이 수행하였다. 실험 대상 세포를 4~5#의 농도가 되도록 96well plate의 각 well에 배지와 함께 100#씩 첨가한 후 24 시간 동안 37 ℃ 의 CO2 incubator에서 배양하였다.
성능/효과
- 실험에 의해 측정한 결과이다. 16종의 귀리 수용성 8 잉ucan시료는 모두 전자공여능이 0~11.9%의 매우 낮은 값을 보여 귀리 수용성 6-glucan 시료들은 항산화력이 거의 없었으며, 대조구인 BHT(buthylated hydroxytoluene) 와 Vitamin C 및 Vitamin E의 전자공여능(%)은 95.2~98.8%로매우 높은 값을 보였다.
- 5 및 로 조제하여 암세포에 대한 생육 저해능을 조사한 결과는 Table 3과 같다. 위암세포(AGS)에 대한 생육저해능은 7번 시료(추출온도 45℃, 에탄올농도 15%, pH 6)가 0.5#농도에서 약 49%, LOmgM농도에서는 약 59%로 -glucan 시료 중 가장 높은 생육저해능을 보였으며, 다른 시료와 유의적인 차이를 보였다<p<0.05). 또 제 13번 시료(추출온도 50℃, 에탄올농도 10%, pH 9)와 제 1번 시료(추출온도 55℃, 에탄올 농도 5%, pH 6)의 경우도 다른 시료에 비해 비교적 높은 저해 활성을 보였다.
- 05). 또 제 13번 시료(추출온도 50℃, 에탄올농도 10%, pH 9)와 제 1번 시료(추출온도 55℃, 에탄올 농도 5%, pH 6)의 경우도 다른 시료에 비해 비교적 높은 저해 활성을 보였다. 간암세포(Hep3B)에 대한 생육 저해 능의 경우도 B-glucan 제 7번 시료가 유의적으로 다른 시료에 비해 높은 활성을 보였는데, LOmg/#의 농도에서 약 58%의 저해능을 나타내었으며, 제 1번 시료도 비교적 높은 활성을 나타내었다.
- 또 제 13번 시료(추출온도 50℃, 에탄올농도 10%, pH 9)와 제 1번 시료(추출온도 55℃, 에탄올 농도 5%, pH 6)의 경우도 다른 시료에 비해 비교적 높은 저해 활성을 보였다. 간암세포(Hep3B)에 대한 생육 저해 능의 경우도 B-glucan 제 7번 시료가 유의적으로 다른 시료에 비해 높은 활성을 보였는데, LOmg/#의 농도에서 약 58%의 저해능을 나타내었으며, 제 1번 시료도 비교적 높은 활성을 나타내었다. 폐암세포(A549)에 대한 생육저해능에 있어서도 제 7번 £잉ucan 시료가 다른 시료에 비해 유의적으로 높은 활성을 보여 LOnigM의 농도에서 약 54%의 저해능을 보였다.
- 간암세포(Hep3B)에 대한 생육 저해 능의 경우도 B-glucan 제 7번 시료가 유의적으로 다른 시료에 비해 높은 활성을 보였는데, LOmg/#의 농도에서 약 58%의 저해능을 나타내었으며, 제 1번 시료도 비교적 높은 활성을 나타내었다. 폐암세포(A549)에 대한 생육저해능에 있어서도 제 7번 £잉ucan 시료가 다른 시료에 비해 유의적으로 높은 활성을 보여 LOnigM의 농도에서 약 54%의 저해능을 보였다. 또 자료로 나타내지는 않았으나 시료의 세포독성을 알아보기 위하여 암세포에 대한 정상세포의 저해비율인 selectivity를 구한 결과, 귀리 수용성 잉ucan의 농도가 증가함에 따라 selectivity는 큰 변화가 없이 2.
- 폐암세포(A549)에 대한 생육저해능에 있어서도 제 7번 £잉ucan 시료가 다른 시료에 비해 유의적으로 높은 활성을 보여 LOnigM의 농도에서 약 54%의 저해능을 보였다. 또 자료로 나타내지는 않았으나 시료의 세포독성을 알아보기 위하여 암세포에 대한 정상세포의 저해비율인 selectivity를 구한 결과, 귀리 수용성 잉ucan의 농도가 증가함에 따라 selectivity는 큰 변화가 없이 2.5-4.0 범위에서 일정하여 6잉ucan시료는 정상세포에 대한 독성이 거의 없는 것으로 생각되었다.
- 5와 같다. 먼저 위암 세포(AGS)의 생육저해능에 미치는 각 요인들의 영향을 보면 (Fig. 3), 추출온도(XI)와 에탄올농도(X2)의 경우, 추출온도가 높을 때에는 에탄올농도가 낮을수록 암세포에 대한 생육저해율이 증가한 반면, 추출온도가 낮을 때에는 에탄올 농도가 높을수록 저해율이 증가하였다. 추출온도(XI)와 pH(X3) 의 영향은 다른 요인에 비해 크지 않았으며, 에탄올농도02) 와 pH(X3)의 경우에는 에탄올농도가 낮을 때는 pH가 높을수록 저해율이 증가하였고 에탄올농도가 높을 때에는 pH가 낮을수록 저해율은 증가하는 경향을 보였다.
- 3), 추출온도(XI)와 에탄올농도(X2)의 경우, 추출온도가 높을 때에는 에탄올농도가 낮을수록 암세포에 대한 생육저해율이 증가한 반면, 추출온도가 낮을 때에는 에탄올 농도가 높을수록 저해율이 증가하였다. 추출온도(XI)와 pH(X3) 의 영향은 다른 요인에 비해 크지 않았으며, 에탄올농도02) 와 pH(X3)의 경우에는 에탄올농도가 낮을 때는 pH가 높을수록 저해율이 증가하였고 에탄올농도가 높을 때에는 pH가 낮을수록 저해율은 증가하는 경향을 보였다. Fig.
- 4는 간암 세포(Hep3B)에 미치는 각 요인들의 영향을 등고선 그림으로 나타낸 결과이다. 추출온도(XI)와 에탄올농도(X2)의 경우는 위암 세포에서와 같은 경향을 보여 추출온도가 높을 때에는 에탄올 농도가 낮을中록 저해율이 증가하였고, 주출온도가낮을때에는 에탄올 농도가 높을수록 저해율이 증가하였다. 추출온도(XI)와 pH(X3)에 있어서는 추출온도에 비해 pH의 변화가 간암세포 저해능에 미치는 영향이 상대적으로 큰 것으로 나타났다.
- 추출온도(XI)와 에탄올농도(X2)의 경우는 위암 세포에서와 같은 경향을 보여 추출온도가 높을 때에는 에탄올 농도가 낮을中록 저해율이 증가하였고, 주출온도가낮을때에는 에탄올 농도가 높을수록 저해율이 증가하였다. 추출온도(XI)와 pH(X3)에 있어서는 추출온도에 비해 pH의 변화가 간암세포 저해능에 미치는 영향이 상대적으로 큰 것으로 나타났다. 또 에탄올농도(X2)와 pH(X3)의 경우는 에탄올 농도가 낮을때 pH는 높을수록, 에탄올농도가 높을 때에는 pH가 낮을수록 저해율은 증가하는 경향을 보였다.
- 추출온도(XI)와 pH(X3)에 있어서는 추출온도에 비해 pH의 변화가 간암세포 저해능에 미치는 영향이 상대적으로 큰 것으로 나타났다. 또 에탄올농도(X2)와 pH(X3)의 경우는 에탄올 농도가 낮을때 pH는 높을수록, 에탄올농도가 높을 때에는 pH가 낮을수록 저해율은 증가하는 경향을 보였다. 폐암세포 (A549)에 미치는 각 독립변수 요인들의 영향을 분석한 결과는 Hg.
- 5와 같다. 추출온도(XI)와 에탄올농도(X2)의 관계는 위암 세포나 간암세포의 경우와 비슷한 결과를 보였는데, 추출온도가 높으면 에탄올농도는 낮을수록 저해율이 증가하였고, 추출온도가 낮을 때에는 에탄올 농도가 높을수록 저해율이 증가하였다 추출온도(XI)와 pH(X3)의 경우에는 중심값 부근의 추출온도에서 최고의 저해율을 나타내는 안부점 (saddle point)의 형태로 나타났다. 에탄올농도(02)와 pH(X3) 사이에는 에탄올농도가 낮으면 pH가 중심값보다 낮거나 높을 때 저해율이 증가하였고 에탄올농도가 높을 때에는 낮은 pH에서 저해율이 증가하는 경향을 보였다.
- 추출온도(XI)와 에탄올농도(X2)의 관계는 위암 세포나 간암세포의 경우와 비슷한 결과를 보였는데, 추출온도가 높으면 에탄올농도는 낮을수록 저해율이 증가하였고, 추출온도가 낮을 때에는 에탄올 농도가 높을수록 저해율이 증가하였다 추출온도(XI)와 pH(X3)의 경우에는 중심값 부근의 추출온도에서 최고의 저해율을 나타내는 안부점 (saddle point)의 형태로 나타났다. 에탄올농도(02)와 pH(X3) 사이에는 에탄올농도가 낮으면 pH가 중심값보다 낮거나 높을 때 저해율이 증가하였고 에탄올농도가 높을 때에는 낮은 pH에서 저해율이 증가하는 경향을 보였다. 한편, 중심합성계획에 의해 얻은 실험값을 반응표면분석하여 이차회귀계수를 구한 결과는 Table 4와 같다.
- 한편, 중심합성계획에 의해 얻은 실험값을 반응표면분석하여 이차회귀계수를 구한 결과는 Table 4와 같다. 암세포의 종류에 따라 각 독립변수가 암세포의 저해율에 미치는 영향은 서로 달랐으며, 3종의 암세포에 대하여 에탄올농도의 2차 회귀계수(X2 X X2)가 유의적으로 다른 변수에 비해 높았다(p<0.001). 또 각 종속변수와 독립변수들의 다중상관계수와 잔차를 요인으로 하여 회귀식의 종속변수량에 대한 독립변수의 영향을 검토한 분산분석 (ANOVA, Analysis of variance)의 결과는 Table 5와 같다.
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