1. 생쥐 고환으로부터 얻은 세포를 배양하여 군집을 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며, AP, SSEA-1, -3, -4과 Integrin $\alpha$6, $\beta$1 및 Oct4의 발현을 확인하였다. 2. 생쥐 생식줄기세포를 3-5일정도 배양하게 되면, 여러 층으로 이루어진 군집을 이루게 되는데 이는 생쥐 배아줄기세포나 배아생식줄기세포의 형태와 같은 것이었다. 3. 생쥐 생식줄기세포를 체외에서 효과적으로 분리, 배양할 수 있는 조건을 확립하였다.
1. 생쥐 고환으로부터 얻은 세포를 배양하여 군집을 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며, AP, SSEA-1, -3, -4과 Integrin $\alpha$6, $\beta$1 및 Oct4의 발현을 확인하였다. 2. 생쥐 생식줄기세포를 3-5일정도 배양하게 되면, 여러 층으로 이루어진 군집을 이루게 되는데 이는 생쥐 배아줄기세포나 배아생식줄기세포의 형태와 같은 것이었다. 3. 생쥐 생식줄기세포를 체외에서 효과적으로 분리, 배양할 수 있는 조건을 확립하였다.
Sperrnatogenesis, the process by which the male germ-line stem cells(GSCs; type A spermatogonia) divide and differentiate to produce the mature spermatozoa, occurs in the seminiferous tubules of the testis. The GSCs proliferate actively to produce two types of cells: other GSCs and differentiating s...
Sperrnatogenesis, the process by which the male germ-line stem cells(GSCs; type A spermatogonia) divide and differentiate to produce the mature spermatozoa, occurs in the seminiferous tubules of the testis. The GSCs proliferate actively to produce two types of cells: other GSCs and differentiating spermatogonia. GSCs have unipotentcy, devoted solely to the generation of sperm. The function of GSCs has broad implications for development, disease, and evolution. Spermatogenesis is fundamental for propagation of species and the defects of this system can result in infertility or disease. The ability to identify, isolate, culture, and alter GSCs will allow powerful new approaches in animal transgenesis and human gene therapy relating to infertility. Until recently, research on stem cells in the testis has been limited because of technical difficulties in isolating and identifying these cell populations. Here, we were trying to find out optimal conditions for in vitro culture of GSCs for identifying and isolating GSCs. We collected mouse GSCs from 3-days old mouse by two-step enzyme digestion method. GSCs were plated and grown on mouse embryonic fibroblasts in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 15％ fatal bovine serum, 10 mM 2-mercaptoethanol, 1％ non-essential amino acids, 1 ng/$m\ell$ bFGF, 10 $\mu$M forskolin, 1500 U/$m\ell$ human recombinant leukemia inhibitory factor (LIF). Over a period 3∼5 days, GSCs gave rise to large multicellular colonies resembling those of mouse pluripotent stem cells. After 5th passages, cells within the colonies continued to be alkaline phosphatase and Oct-4 positive and tested positive against a panel of two immunological markers(Integrin $\alpha$ 6 and Integrin $\beta$ 1) that have been recognized generally to characterize GSCs. SSEA-1, SSEA-3, and SSEA-4 also showed positive signals. Based on our data, these GSCs-derived cultures meet the criteria for GSCs itself and even other pluripotent stem cells. We reported here the establishment of in vitro cultures from mouse male GSCs.
Sperrnatogenesis, the process by which the male germ-line stem cells(GSCs; type A spermatogonia) divide and differentiate to produce the mature spermatozoa, occurs in the seminiferous tubules of the testis. The GSCs proliferate actively to produce two types of cells: other GSCs and differentiating spermatogonia. GSCs have unipotentcy, devoted solely to the generation of sperm. The function of GSCs has broad implications for development, disease, and evolution. Spermatogenesis is fundamental for propagation of species and the defects of this system can result in infertility or disease. The ability to identify, isolate, culture, and alter GSCs will allow powerful new approaches in animal transgenesis and human gene therapy relating to infertility. Until recently, research on stem cells in the testis has been limited because of technical difficulties in isolating and identifying these cell populations. Here, we were trying to find out optimal conditions for in vitro culture of GSCs for identifying and isolating GSCs. We collected mouse GSCs from 3-days old mouse by two-step enzyme digestion method. GSCs were plated and grown on mouse embryonic fibroblasts in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 15％ fatal bovine serum, 10 mM 2-mercaptoethanol, 1％ non-essential amino acids, 1 ng/$m\ell$ bFGF, 10 $\mu$M forskolin, 1500 U/$m\ell$ human recombinant leukemia inhibitory factor (LIF). Over a period 3∼5 days, GSCs gave rise to large multicellular colonies resembling those of mouse pluripotent stem cells. After 5th passages, cells within the colonies continued to be alkaline phosphatase and Oct-4 positive and tested positive against a panel of two immunological markers(Integrin $\alpha$ 6 and Integrin $\beta$ 1) that have been recognized generally to characterize GSCs. SSEA-1, SSEA-3, and SSEA-4 also showed positive signals. Based on our data, these GSCs-derived cultures meet the criteria for GSCs itself and even other pluripotent stem cells. We reported here the establishment of in vitro cultures from mouse male GSCs.
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문제 정의
있지 않은 상황이다. 본 연구에서는 생쥐의 생식줄기세포를 체외 배양을 통해 분리한 후 증식시킨 후 그 이용 가능성을 조사해 보았다.
가설 설정
1. 수컷 생쥐 생식줄기세포의 분리.
Expressions of SSEA-1, -3, -4, Integrin a 6, β1 and Oct4 on male germ-line stem cells. A: Expression of SSEA-1 on male germ-line stem cells. B: Expression of SSEA-3 on male germ-line stem cells.
A: Expression of SSEA-1 on male germ-line stem cells. B: Expression of SSEA-3 on male germ-line stem cells. C: Expression of SSEA-4 on male germ-line stem cells.
A: Germ-line stem cells expressed AP. B: Small colony of male germ-line stem cell was stained by AP. A and B were pictured after 6hr in vitro culture.
B: Expression of SSEA-3 on male germ-line stem cells. C: Expression of SSEA-4 on male germ-line stem cells. D: Expression of Integrin a6 on male germ-line stem cells.
A and B were pictured after 6hr in vitro culture. C: The colonies of male germ-line stem cells were on Sertoli cells (100X). D: Thecolony was composed of many male germ-line stem cells.
C: Expression of SSEA-4 on male germ-line stem cells. D: Expression of Integrin a6 on male germ-line stem cells. E: Expression of Integrin β1 on male germ-line stem cells.
C: The colonies of male germ-line stem cells were on Sertoli cells (100X). D: Thecolony was composed of many male germ-line stem cells. This picture was enlarged from A(200X).
D: Expression of Integrin a6 on male germ-line stem cells. E: Expression of Integrin β1 on male germ-line stem cells. F: .
제안 방법
1 mM 2-mercap- toethanol, 1500 units mouse recombinant leukemia inhibitory factor(ESGRO, Chemicon), 5ng/ml of human basic FGF(R&D) 그리고 10μM forskolin(Sigma)을 첨가한 배양액을 이용하였으며, 배양은 5% CO2, 95% 습도가 유지된 배양기 내에서 실시하였다. 계대배양을 위해 매 5~7일 마다 생성된 생식줄기세포 colony를 0.25% trypsin을 37℃ 에서 5~7분간 처리한 후 pipetting으로 세포를 배양접시에서 분리하였으며, trypsin반응을 억제하기 위해 serum이 첨가된 배양액을 넣어준 후 원심분리를 l, 500rpm 에서 4분간 수행하였다. 상충액은 버리고 생식줄기세포 배양액에 pellet을 재부유시키고 새로운 배양접시로 옮겨 배양을 실시하였다.
)을 사용했다. 발색반응을 보기 위해서 APreaction buffer0]] BCIP(Sigma) and NBT(Sigma)mixture를 넣어서 발색을 확인하였다.
7% paraformaldehyde 고정하였고, naphthol / FRV-alkaline AP substrate(Sigma)로 염색한 후 염색 여부를 확인하였다. 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 배아생식줄기세포(embryonic germ cell)의 표지인자로 알려져 있는 Stage Specific Embryonic Antigen-1, -2,-3 및 생식줄기세포의 표지인자로 알려져 있는CD49f(Integrin q6 chain; BD / Pharmingen) 과 CD29(Integrin B 1 아lain; BD / Pharmingen)의 발현 여부도 immimostaining으로 확인하였다. 생식줄기세포 colony 를 3.
25% Trypsin (Sigma)을 넣고 15분간 37℃ shacking water bath에서 배양하였다. 배양 후 trypsin반응을 억제하기 위하여 배 양액 [DMEM(GIBCO), 10% FBS(Hy- clone), 1% Penicillin streptomycin(GIBCO)]을 첨가한 후 l, 500rpm에서 4분간 원심분리하였다. 상층 액을 제거 하고, pellet을 배 양액을 이용하여 재부유하고 70㎛ filter로 거른 후, l, 500rpm에서 4분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 남은 pellet을 배양에 이용하였다.
Kanatsu-shinohara 등(2003)은 특수하게 조제된 배양액을 이용하여 생식줄기세포의 장기간 체외배양이 가능하다고 하였으며, 이를 고환 내에 이식하여 정자로 분화를 시킬 수 있었다고 보고하였다. 본 연구에서는 생후 3~5일령의 생쥐 고환을 채취한 후 효소를 이용하여 생식줄기세포와 미성숙 Sertoli 세포의 혼합 부유액을 준비한 후 배아줄기세포 증식에 이용되는 단순배양액을 이용하여 생식줄기세포의 분리 및 증식을 시도하여 보았다. 배양 6시간 후의 세포들은 AP 발현을 나타내었으며 배양 2~3일째에 생식줄기세포는 생쥐 배아줄기세포 그리고 생쥐 배아생식줄기세포와 매우 유사한 형태의 colony를 형성하여 증식하였다(Fig.
본 연구진은 분리 및 증식된 생식줄기세포를 이용하여 체외분화를 유도하였으며 이를 통하여 정자세포를 생산할 수 있었다(Lee 등, 2003). 이전까지의 연구에서는 고환에 존재하는 생식줄기세포만을 분리할 수 있는 방법이 없었으나 본 연구에서는 체외배양을 통해 효과적으로 생식줄기세포를 분리할 수 있는 방법을 개발하였다.
생식줄기세포 colony를 MEMFA(0.1M MOPS, pH 7.5, 2mM EDTA, ImM MgSQ, 3.7% form-aldehyde)로 상온에서 20분 동안 고정하였다. 구체적인in situ hybridization방법은 Song 등(1999)이 했던 순서를 따랐으며, hybridizatione 55℃에서 수행하였다.
생식줄기세포 표지인자로 알려져 있는 alkaline phosphatase(AP) 의 발현 여부를 알아보기 위하여 생식줄기세포 colony# 3.7% paraformaldehyde 고정하였고, naphthol / FRV-alkaline AP substrate(Sigma)로 염색한 후 염색 여부를 확인하였다. 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 배아생식줄기세포(embryonic germ cell)의 표지인자로 알려져 있는 Stage Specific Embryonic Antigen-1, -2,-3 및 생식줄기세포의 표지인자로 알려져 있는CD49f(Integrin q6 chain; BD / Pharmingen) 과 CD29(Integrin B 1 아lain; BD / Pharmingen)의 발현 여부도 immimostaining으로 확인하였다.
수컷 ICR 생후 3~5일령에서 생식줄기세포(germ-line stem cells)를 분리하기 위해 두 단계의 효소 처리 과정을 거쳤다(Ogawa 등, 1997). 생쥐로부터 고환을 적출하여 PBS로 옮겨 세척한 후 백막을 제거하였다. 백막이 제거된 고환은 세정관이 드러나게 되는데, 이것들을 모아 1% Collagenase(Sigma), 1% Hyalu- ronidase(Sigma) 능도의 배양액에 옮긴 후 15분 동안37℃ shacking water bath에서 배양하였다.
이전까지의 연구에서는 고환에 존재하는 생식줄기세포만을 분리할 수 있는 방법이 없었으나 본 연구에서는 체외배양을 통해 효과적으로 생식줄기세포를 분리할 수 있는 방법을 개발하였다. 미성숙 Sertoli 세포는 배양접시에 부착하여 fibroblast 와 유사한 모양으로 증식하였으며, 이 세포가 생식줄기세포의 증식에 미치는 영향에 관한 연구는 더 진행이 되어야 할 것으로 생각된다.
대상 데이터
2% gelatin을 코팅한 배양접시에 부착시켜 배양을 실시하였다. DMEM(GIBCO)에 15% fetal bovine serum(HyClone), 1% non essential amino acids(GIBCO), 0.1 mM 2-mercap- toethanol, 1500 units mouse recombinant leukemia inhibitory factor(ESGRO, Chemicon), 5ng/ml of human basic FGF(R&D) 그리고 10μM forskolin(Sigma)을 첨가한 배양액을 이용하였으며, 배양은 5% CO2, 95% 습도가 유지된 배양기 내에서 실시하였다. 계대배양을 위해 매 5~7일 마다 생성된 생식줄기세포 colony를 0.
본 실험에 사용된 수컷 ICR 생쥐, 생후 3~5일령은 (주)대한바이오링크에서 구입하였다. 수컷 ICR 생후 3~5일령에서 생식줄기세포(germ-line stem cells)를 분리하기 위해 두 단계의 효소 처리 과정을 거쳤다(Ogawa 등, 1997).
본 실험에서는 ICR의 고환으로부터 두 단계 효소처리를 거쳐 얻은 생식줄기세포를 배아줄기세포와 유사한 조성의 배양액으로 배양하였다. Fig.
이론/모형
7% form-aldehyde)로 상온에서 20분 동안 고정하였다. 구체적인in situ hybridization방법은 Song 등(1999)이 했던 순서를 따랐으며, hybridizatione 55℃에서 수행하였다.
성능/효과
1. 생쥐 고환으로부터 얻은 세포를 배양하여 군집을 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며, AP,SSEA-1, -3, -4과 Integrin a 6, B 1 및 Oct4의발현을 확인하였다.
2. 생쥐 생식줄기세포를 3-5일정도 배양하게 되면, 여러 층으로 이루어진 군집을 이루게 되는데 이는 생쥐 배아줄기세포나 배아생식줄기세포의 형태와 같은 것이었다.
3. 생쥐 생식줄기세포를 체외에서 효과적으로 분리, 배양할 수 있는 조건을 확립하였다.
2 의 A와 B는 생식줄기세포 배양 6시간 후에 생식줄기세포 여부를 확인하기 위하여AP staining을 실시한 것이다. Fig. 2의 A에서 보듯이 AP를 강하게 발현하는 세포들이 배양접시에 부착하여 응집하는 것을 관찰하였고, 이를 확대해서 보면 B와 같이 다수의 세포들이 군집을 이루어 증식함을 확인할 수 있었다. Fig.
2 D). Fig. 3의 A에서 보듯이 SSEA-1, -3, -4가 생식줄기세포 colony에서만 발현되는 것을 확인하였고, 생식줄기세포의 표지인자 로서 알려져 있는 Integrin a 6, Integrin 61 도 군집에서만 발현한 것으로 관찰되어(Fig. 3 D, E) 배양된 군집을 이루는 세포들이 생식줄기세포임을 확인하였다. 줄기세포의 또 다른 표지인자로 널리 알려진 Oct4도 in situ hybridization로 생식줄기세포에서 발현함을 확인하였다(Fig.
이상에서 살펴본 바와 같이 생쥐 생식줄기세포를 효과적으로 분리하여 단기간 증식시킬 수 있는 조건을 확립할 수 있었다. 그러나 생식줄기세포로 증명된 세포들은 효소처리에 의해 계대를 6~7회 정도 거치면서 생식줄기세포가 모인 군집 내부가 검게 변하는 세포의 퇴행성 변화를 관찰할 수 있었으며, 또한 증식능력도 떨어지고 군집을 형성하는 비율도 줄어들어 점점 건강한 상태의 생식줄기세포의 군집을 유지할 수 없게 되었다.
2). 배양 시 매 5~7일째에 효소처리를 통하여 단일세포로 분리한 후 계대배양을 실시하였고, 계대 후 세포는 다시 colony를 형성하여 증식하는 것을 관찰할 수 있었다. 배양을 시작한 후 다음 날 계대를 넘기면 생식줄기세포가 더 많은 수의 건강한 군집을 이루는 경향이 있었다.
바닥에 부착한 세포들은 Sertoli cell이며, 그 위 군집들은 생식줄기세포라고 추정하였다. 생식줄기세포라고 생각되는 군집 하나를 200배율로 확대하여 보았을 때, 하나의 군집이 여러 개의 세포들로 뭉쳐져 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2 D). Fig.
3 F). 이상에서 살펴본 바와 같이 생쥐 생식줄기세포를 효과적으로 분리하여 단기간 증식시킬 수 있는 조건을 확립할 수 있었다. 그러나 생식줄기세포로 증명된 세포들은 효소처리에 의해 계대를 6~7회 정도 거치면서 생식줄기세포가 모인 군집 내부가 검게 변하는 세포의 퇴행성 변화를 관찰할 수 있었으며, 또한 증식능력도 떨어지고 군집을 형성하는 비율도 줄어들어 점점 건강한 상태의 생식줄기세포의 군집을 유지할 수 없게 되었다.
3 D, E) 배양된 군집을 이루는 세포들이 생식줄기세포임을 확인하였다. 줄기세포의 또 다른 표지인자로 널리 알려진 Oct4도 in situ hybridization로 생식줄기세포에서 발현함을 확인하였다(Fig. 3 F). 이상에서 살펴본 바와 같이 생쥐 생식줄기세포를 효과적으로 분리하여 단기간 증식시킬 수 있는 조건을 확립할 수 있었다.
후속연구
이전까지의 연구에서는 고환에 존재하는 생식줄기세포만을 분리할 수 있는 방법이 없었으나 본 연구에서는 체외배양을 통해 효과적으로 생식줄기세포를 분리할 수 있는 방법을 개발하였다. 미성숙 Sertoli 세포는 배양접시에 부착하여 fibroblast 와 유사한 모양으로 증식하였으며, 이 세포가 생식줄기세포의 증식에 미치는 영향에 관한 연구는 더 진행이 되어야 할 것으로 생각된다.
번식의 근본이다. 생식줄기세포를 체외에서 분리 및 배양하여 증식시킬 수 있다면 이로부터 남성 불임 및 유전 질병과 관련된 유전자치료를 근본적으로 해결할 수 있는 방안을 제시할 수 있으며, 또한 형질전환 동물을 보다 효과적으로 생산할 수 있는 길도 열 수 있을 것으로 생각된다(Parks 등, 2003). 생식줄기세포는 우리 신체에 존재하는 모든 줄기세포를 연구하는데 좋은 실험적 대상이 될 수 있으며, 정자발생과정은 여러가지 유용한 방법으로 많은 연구가 되어 있기 때문에 줄기세포 연구에도 충분히 응용될 수 있다.
사멸하는 것으로 생각된다. 세포의 장기간 증식을 유도할 수 있는 새로운 배양액 및 배양조건의 개발이 필요할 것으로 생각된다.
참고문헌 (19)
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Hammer RE and Garbers DL. 2002. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99:14931-14936
Lee DR, Kim SK, Yang YH, Yoon TG, Cha KY and Kim KS. 2003. Establishment of mouse male germ line stem cells and in vitro differentiation to haploid cells. $59^{th}$ Annual meeting of the American Society for Reproductive Medicine, oral presentation
Matsui Y, Zsebo K and Hogan BLM. 1992. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell, 70:841-847
Nagano M, Brinster CJ, Orwig KE, Ryu B-Y, Avarbock MR and Brinster RL. 2001. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98:13090-13095
Song J, Oh SP, Schrewe H, Nomura M, Lei H, Okano M, Gridley T and Li E. 1999. The type II activin receptors are essential for egg cylinder growth, gastrulation, and rostral head development in mice. Dev. Biol., 213:157-69
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS and Jones JM. 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts, Science, 282: 1145-7
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