본 연구는 식중독 환자로부터 분리한 장염비브리오균 120 균주를 세균학적 특성시험, 항균제 감수성 여부, 독소 유전자와 독소조절유전자의 검출 및 보유 여부를 PCR, RPLA 로 시험하였으며, 각 지역간의 분리 세균을 GS-PCR, PFGE 시험으로 병원체 상관 관계를 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 장염비브리오균은 0%의 NaCl 농도에서는 성장을 보이지 않았고, 8% NaCl이 첨가된 농도에서는 성장을 보였다. 국내 설사환자의 장염비브리오균의 O, K 혈청형은 17가지로 나타났으며, 이 중 O3:K6형이 68.3%로 가장 많았다. Ampicillin 등 18가지 항균제 시험에서 Ampicillin, Ticacillin에 높은 내성을 보였으며, Ampicillin, Ticacillin, Vancomycin에 동시 내성을 나타낸 경우가 52.5%로 나타났다. 독소조절 유전자 toxR은 PCR시험에서 시험균주 모두 368bp 크기의 유전자를 가지고 있었으며 장염 비브리오균의 조기진단에 유용한 것으로 확인되었고, 독소유전자 tdh는 120균주 중 109 균주만이 199bp 크기의 유전자를 보유하고 11균주가 음성이었다. trh 독소 유전자를 보유한 균주는 시험균주 중 3 균주만이 250bp 크기의 유전자를 보유하고 있었으며, tdh, trh 유전자를 동시에 가지고 있는 균주는 3균주로 이 균주의 TDH 독소 생성능은 x16 정도로 독소 생성능이 미약했다. 독소생성 Kanagawa 시험에서 120균주 중 107균주가 양성반응 을 나타내었으며, Kanagawa 양성반응을 보인 균주은 모두 tdh 유전자를 보유하고 있었다. Group Specific-PCR에서 최근에 유행을 일으키는 O3:K6 혈청형의 유연관계를 찾는데 유용한 것으로 나타났다. 조절유전자 toxRS 염기서열을 분석한 결과 같은 혈청형이라도 3균주는 7개의 염기서열 차이를 나타내었으며, 이는 현재 유행을 일으키는 균주와는 다른 균주임을 확인하였다. PFGE로 보다 더 세분화하여 혈청관계를 분류할 수 있었으며, 식중독 환자 유래 장염비브리오균은 3가지 type으로 나타났으며, 이들 균주 사이에는 상호 밀접한 상관관계를 나타내었다. 따라서 PFGE 기법으로 얻어진 결과는 분자 역학적으로 유용한 도구로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 연구는 식중독 환자로부터 분리한 장염비브리오균 120 균주를 세균학적 특성시험, 항균제 감수성 여부, 독소 유전자와 독소조절유전자의 검출 및 보유 여부를 PCR, RPLA 로 시험하였으며, 각 지역간의 분리 세균을 GS-PCR, PFGE 시험으로 병원체 상관 관계를 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 장염비브리오균은 0%의 NaCl 농도에서는 성장을 보이지 않았고, 8% NaCl이 첨가된 농도에서는 성장을 보였다. 국내 설사환자의 장염비브리오균의 O, K 혈청형은 17가지로 나타났으며, 이 중 O3:K6형이 68.3%로 가장 많았다. Ampicillin 등 18가지 항균제 시험에서 Ampicillin, Ticacillin에 높은 내성을 보였으며, Ampicillin, Ticacillin, Vancomycin에 동시 내성을 나타낸 경우가 52.5%로 나타났다. 독소조절 유전자 toxR은 PCR시험에서 시험균주 모두 368bp 크기의 유전자를 가지고 있었으며 장염 비브리오균의 조기진단에 유용한 것으로 확인되었고, 독소유전자 tdh는 120균주 중 109 균주만이 199bp 크기의 유전자를 보유하고 11균주가 음성이었다. trh 독소 유전자를 보유한 균주는 시험균주 중 3 균주만이 250bp 크기의 유전자를 보유하고 있었으며, tdh, trh 유전자를 동시에 가지고 있는 균주는 3균주로 이 균주의 TDH 독소 생성능은 x16 정도로 독소 생성능이 미약했다. 독소생성 Kanagawa 시험에서 120균주 중 107균주가 양성반응 을 나타내었으며, Kanagawa 양성반응을 보인 균주은 모두 tdh 유전자를 보유하고 있었다. Group Specific-PCR에서 최근에 유행을 일으키는 O3:K6 혈청형의 유연관계를 찾는데 유용한 것으로 나타났다. 조절유전자 toxRS 염기서열을 분석한 결과 같은 혈청형이라도 3균주는 7개의 염기서열 차이를 나타내었으며, 이는 현재 유행을 일으키는 균주와는 다른 균주임을 확인하였다. PFGE로 보다 더 세분화하여 혈청관계를 분류할 수 있었으며, 식중독 환자 유래 장염비브리오균은 3가지 type으로 나타났으며, 이들 균주 사이에는 상호 밀접한 상관관계를 나타내었다. 따라서 PFGE 기법으로 얻어진 결과는 분자 역학적으로 유용한 도구로 사용될 수 있음을 확인하였다.
The purpose of this study is to inquire into molecular epidemiological characteristics of Vibrio parahaemolyticus. For this study, 120 strains(120 strains of Vibrio parahaemolyticus sampled from diarrhea patients) were examined and analyzed for biochemical characteristics, TDH (thermostable direct h...
The purpose of this study is to inquire into molecular epidemiological characteristics of Vibrio parahaemolyticus. For this study, 120 strains(120 strains of Vibrio parahaemolyticus sampled from diarrhea patients) were examined and analyzed for biochemical characteristics, TDH (thermostable direct hemolysin) antibiotics sensitivity and detection of toxR, gyrE, tdh, and tds gents. G-S PCR (Group Specific Polymerase), PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoriesis) methods were performed on the materials from patients were results. 1 Vibrio parahaemolyticus didn't grow in 0% density of NaCl, but the fact was found that those grew in 8% density of NaCl. 2. O:K serotypes of Vibrio parahaemolyticus was turned up in domestic patients was 17 types. Among those O3:K6 was the most, it was 68.3%. 3. In 18 kinds of antibiotic tests resistant against Ampicillin, Ticacillin was comparatively high. the case of resistant against Ampicillin, Ticacillin, Vancomycin at the multiple resistant was 52.5%. 4. Toxin gene tdh had only 109 strains among 120 ones isolated from patients held the genes of 199bp size, and 11 strains was negativity 5. In the test of Kanagawa toxic productivity, 107 strains among strains isolated from patients appeared to be positivity reaction 6. The strain that held trh toxin was only 3, and those among test strains had the genes of 250bp size and that had tdh, trh genes at a time were 3 strains, and TDH toxic productivity of those were 16 times, and it was weak. 7. Group Specific-PCR appeared to be useful in the confirmation of O3:K6 serotype interrelations. 8. Three strains which showed difference of 7 DNA sequence even in the same serotype were detected by the result of analyzing the regular gene, toxRS DNA sequence. These strains are differ from general strains which carry infection easily. 9. These mutual dose epidemiological relations were classified into smaller-parts through PFGE method. As a result of such classify, 3 findings were found. V. parahaemolyticus sampled from diarrhea patients were classified into 3 types. And third, the result obtained through PFGE method can be used as a useful tool in a point of molecular-epidemiological view.
The purpose of this study is to inquire into molecular epidemiological characteristics of Vibrio parahaemolyticus. For this study, 120 strains(120 strains of Vibrio parahaemolyticus sampled from diarrhea patients) were examined and analyzed for biochemical characteristics, TDH (thermostable direct hemolysin) antibiotics sensitivity and detection of toxR, gyrE, tdh, and tds gents. G-S PCR (Group Specific Polymerase), PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoriesis) methods were performed on the materials from patients were results. 1 Vibrio parahaemolyticus didn't grow in 0% density of NaCl, but the fact was found that those grew in 8% density of NaCl. 2. O:K serotypes of Vibrio parahaemolyticus was turned up in domestic patients was 17 types. Among those O3:K6 was the most, it was 68.3%. 3. In 18 kinds of antibiotic tests resistant against Ampicillin, Ticacillin was comparatively high. the case of resistant against Ampicillin, Ticacillin, Vancomycin at the multiple resistant was 52.5%. 4. Toxin gene tdh had only 109 strains among 120 ones isolated from patients held the genes of 199bp size, and 11 strains was negativity 5. In the test of Kanagawa toxic productivity, 107 strains among strains isolated from patients appeared to be positivity reaction 6. The strain that held trh toxin was only 3, and those among test strains had the genes of 250bp size and that had tdh, trh genes at a time were 3 strains, and TDH toxic productivity of those were 16 times, and it was weak. 7. Group Specific-PCR appeared to be useful in the confirmation of O3:K6 serotype interrelations. 8. Three strains which showed difference of 7 DNA sequence even in the same serotype were detected by the result of analyzing the regular gene, toxRS DNA sequence. These strains are differ from general strains which carry infection easily. 9. These mutual dose epidemiological relations were classified into smaller-parts through PFGE method. As a result of such classify, 3 findings were found. V. parahaemolyticus sampled from diarrhea patients were classified into 3 types. And third, the result obtained through PFGE method can be used as a useful tool in a point of molecular-epidemiological view.
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문제 정의
있다. 따라서 본 연구는 최근 한국에서 유행하는 장염비브리오균의 특성을 파악하기 위하여 1999년부터 2001년 사이 국내 식중독 발생 환자로부터 채취한 대변 시료로부터 분리 동정 된 균주의 세균학적 특성 시험, 항균제 감수성 여부, 독소 유전자와 독소 조절유전자의 검출 및 보유여부를 PCR, RPLA (Reversed Passive Latex Agglutination)S. 시험하였으며, 각 지역 간의 분리 세균을 GS-PCR, PFGE 시험으로 병원체 상관 관계를 분석하였으며, 독소조절유전자의 염기서열을 분석하여 국내에서 발생한 병원체의 특성을 파악하여 전염병 방역 대책에 필요한 기초 자료를 제공하는데 그 연구 목적을 두었다.
따라서 본 연구는 최근 한국에서 유행하는 장염비브리오균의 특성을 파악하기 위하여 1999년부터 2001년 사이 국내 식중독 발생 환자로부터 채취한 대변 시료로부터 분리 동정 된 균주의 세균학적 특성 시험, 항균제 감수성 여부, 독소 유전자와 독소 조절유전자의 검출 및 보유여부를 PCR, RPLA (Reversed Passive Latex Agglutination)S. 시험하였으며, 각 지역 간의 분리 세균을 GS-PCR, PFGE 시험으로 병원체 상관 관계를 분석하였으며, 독소조절유전자의 염기서열을 분석하여 국내에서 발생한 병원체의 특성을 파악하여 전염병 방역 대책에 필요한 기초 자료를 제공하는데 그 연구 목적을 두었다.
제안 방법
이들 primer가 표적으로 하는 tdh DNA의 크기는 199 bp이며, 沥의 DNA 크기는 250 bp이다. PCR을 통해 얻어진 증폭 산물은 2% TBE agarose gel에 loading하여 100 V로 1시간 전기 영동한 후 ethidium bromide 용액 (0.25 以/砒)으로 15분간 염색하여 transilluminator로 밴드 패턴을 확인하고 필터가 부착된 폴라로이드 카메라로 촬영하였다.
PFGE 실험은 Gautom(13)의 방법을 변형하여 실험하였다. 균을 TSB배지에 접종하여 18시간 배양한 다음 배양액 1 m£ 을 취하여 균체를 수거하여 wash buffer (1 M NaCl, 10 mM Tris, 10 mM EDTA)로 세척한 다음, wash buffer에 재현 탁 시키고 재현탁액을 VITEK colorim아er를 이용하여 20% 투명도로 조절한 다음 50℃ water bath에 넣고, 미리 준비한 2% a응arose와 1 : 1 (v/v)의 비율로 섞은 후 mold에 넣고 4℃에서 15분 동안 굳혔다.
V. parahaemolyticuse] O 항원 및 K 항원 진단 (Denka seiken, Japan) 은 11가지의 0 항혈청과 9가지의 다가 (Multivalant) K항혈청과 78가지의 단가 (Monovalant) K 항혈청을 사용하여 slide 응집반응으로 혈청형을 확인하였다.
Wong 등(11)의 보고에 따라 새로운 O3:K6를 특이적으로 검출할 수 있는 변화된 primer를 제작하여 (5, -TAATGAGGT AGAAACAA-3, ), AQ3815균주의 toxRS 서열의 561부위로부터 576 영역과 1, 211로부터 1, 196 영역을 primer 서열로 사용하였고, 다음 방법으로 PCR를 실시하였다. 실험균주는 TSB 5 謨에 접종하여 37℃ 18시간 진탕 배양한 균액을 10분간 가열한 후, 균액 5 以, deoxynucloside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dtTTP, 1 mM dGTP) 2 成, 10x PCR용액 5 破, primer (100 pmol//z£) 1 队 Taq polymerase 1.
tdh, ”根의 유전자 검출은 반응과정은 94笆에서 5분간 예비가열 후, 94℃에서 denaturation 1분, 72℃에서 extention 1분을 한 주기로 하여 35주기를 시행하였다. 이들 primer가 표적으로 하는 tdh DNA의 크기는 199 bp이며, 沥의 DNA 크기는 250 bp이다.
독소 유전자 조절효소인 toxRS 유전자의 염기서열을 결정하기 위하여 toxBSl (5'- TATCICCCATCCGCAAACCTA) 과 toxRS2 (5, -ACAGTACCGTAGAACCGTGAT) primer를 이용하여 DNA를 증폭하여 1, 406 bp DNA를 얻었다. PCR 용액 100 以에 PEG (2.
독소 유전자의 특이 염기배열 부위를 primer (Table 1)로 합성하여 PCR (Fields 등, 1992)을 실시하였다. 시험균주를 TSB 5 砒에 접종하여 37℃에서 18시간 진탕 배양한 균액을 10분간 가열한 후 균액 5 以, deoxynucleoside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP) 2 成, lOx PCR용액 5 迎, primer (100 pmol/以) 1 曲 Taq polymerase 1.
침전된 DNA를 건조시킨 후 20 以의 증류수에 녹여 사용하였다. 염기서열 반응은 toxRSl과 toxRS2 prime!를 사용하여 DNA sequencing kit (BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0)으로 반응시키고 알코올 침전법으로 DNA를 정제하여 자동 염기서열 분석기 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 확인하였다.
본 연구는 식중독 환자로부터 분리한 장염비브리오균 120 균주를 세균학적 특성시험, 항균제 감수성 여부, 독소 유전자와 독소조절유전자의 검출 및 보유 여부를 PCR, RPLA 로시험하였으며, 각 지역간의 분리 세균을 GS-PCR, PFGE 시험으로 병원체 상관 관계를 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 장염비브리오균은 0%의 NaCl 농도에서는 성장을 보이지 않았고, 8% NaCl이 첨가된 농도에서는 성장을 보였다.
독소 유전자의 특이 염기배열 부위를 primer (Table 1)로 합성하여 PCR (Fields 등, 1992)을 실시하였다. 시험균주를 TSB 5 砒에 접종하여 37℃에서 18시간 진탕 배양한 균액을 10분간 가열한 후 균액 5 以, deoxynucleoside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP) 2 成, lOx PCR용액 5 迎, primer (100 pmol/以) 1 曲 Taq polymerase 1.25 U를 혼합하여 총 부피를 50 成로 제조하여 Thermal cycler로 증폭과정을 실시하였다.
다음 방법으로 PCR를 실시하였다. 실험균주는 TSB 5 謨에 접종하여 37℃ 18시간 진탕 배양한 균액을 10분간 가열한 후, 균액 5 以, deoxynucloside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dtTTP, 1 mM dGTP) 2 成, 10x PCR용액 5 破, primer (100 pmol//z£) 1 队 Taq polymerase 1.25 U를 혼합하여 총 부피를 50 成로 제조하여 Thermal cyclei로 증폭과정을 실시하였다. 유전자 증폭과정은 96 ℃ 5분간 예비 가열 후, 96 ℃ 에서 denaturation 1분, 45 ℃ 에서 annealing 2분, 72℃에서 extention 3분간의 주기로 25회 실시하여, 유전자 증폭산물은 2% agarose g이로 전기영동하여 ethidium bromide에서 염색하고 UV상에서 관찰하였다.
25 U를 혼합하여 총 부피를 50 成로 제조하여 Thermal cyclei로 증폭과정을 실시하였다. 유전자 증폭과정은 96 ℃ 5분간 예비 가열 후, 96 ℃ 에서 denaturation 1분, 45 ℃ 에서 annealing 2분, 72℃에서 extention 3분간의 주기로 25회 실시하여, 유전자 증폭산물은 2% agarose g이로 전기영동하여 ethidium bromide에서 염색하고 UV상에서 관찰하였다.
5% Na-deoxycholate, 2 阐i成 RNase, 1 mg/m-C lysozyme, 1 mgM Protease K] 에 넣어 55 ℃ 에서 약 24시간 반응시킨 다음 Lysis buffer를 제거하고 plug를 TE buffer로 30분 4회 세척하였다. 이 plug를 200 以의 제한효소 반응용 buffer에 넣어 실온에서 1시간 동안 평형화시킨 후 다시 새로운 200 以의 제한효소 반응용 buffer로 교체하고 Not I 25 unit를 넣은 후 37℃에서 4시간 반응시키고 CHEP DRII system (BioRad, USA)을 이용하여 6 V/cm, pulse time 1초~ 25초, 22시간, 14℃, 0.5x TBE의 조건으로 전기영동을 실시하였다
항균제 감수성 검사는 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard, 2000), Lorian (1996) 등의 디스크 확산법으로 BBL (Baltimore Biological Laboratories, USA)사의 Ampicillin 등 18종류의 항균제 디스크를 사용하여, 37℃에 18시간 배양, 성장 발육 저지 억제대를 직경으로 측정하여 표준 판독표와 비교하여 감수성 여부를 판독하였다. 항균제 감수성 검사의 정도관리를 위해 표준균주로 E.
대상 데이터
1999년부터 2001년 사이 전국 보건환경연구원의 보건망을 통하여 국립보건원에 의뢰된 식중독 환자에서 분리한 장염비브리오 120균주를 분양 받아 본 실험 균주로 사용하였다.
Mannitol Peptone 배지 (Polypeptone 2 g, D-Mannitol 0.5 g, NaCl 5 g, distilled water 100 砒, pH 7.8)에 37℃ 18시간 배양한 후 3000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 시험액으로 사용하였다. 독소시험은 KAP-RPLA "Seiken” (Denka Seiken Co.
이론/모형
toxR, gyrB 유전자와 tdh, 沥의 유전자 검출은 PCR 방법을 사용하였다. 독소 유전자의 특이 염기배열 부위를 primer (Table 1)로 합성하여 PCR (Fields 등, 1992)을 실시하였다.
밴드를 나타내었다. 이들 밴드 결과를 기초로 Tenover 등(19)의 방법에 따라 V. parahaem아yticns균들의 유형이 가장 많이 나오는 A type을 중심으로 나누었다.
판독하였다. 항균제 감수성 검사의 정도관리를 위해 표준균주로 E. coli ATCC 25922 과 S. aureus ATCC 25923을 사용하였고, 감수성 기준은 NCCLS (2000)의 기준에 따랐다.
환자에서 분리한 균주를 TCBS 및 Trytic soy agar (TSA) 평판배지에 배양하여 녹색집락을 선별하여 FDA(1992), Bergey's manual, Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria와 Manual of clinical microbiology, Tests for identification of medical bacteria 및 감염병 실험실 진단지침 (1996) 방법 등에 따라 시험관법을 사용 생화학적 시험을 수행하여 동정하였다.
성능/효과
250 bp 크기의 trh 유전자를 검출하기 위하여 PCR 법으로 확인한 결과 120 균주 중 3 균주가 확인되었으며, trh 유전자만 보유하고 있는 균주는 검출되지 않았으며, 사람유래 식중독 환자에서 분리된 국내 장염비브리오균의 위장관염 원인은 tdh 유전자에 의한 것으로 확인되었다. 본 시험에서 특이한 것은 urease 양성균이 120 균주 중 3 균주가 나왔으며, 이 균주들은 tdh, trh 유전자를 동시에 가지고 있으며, Kanagawa 현상에서 양성반응으로 나타났으나, TDH 역가에서는 다른 균의 역가가 2, 048배에 비해서 매우 낮은 16배 정도를 나타내었다.
5%의 양 혈액이 첨가된 Wagatsuma 배지에서 시험균주 모두 음성반응으로 나타났으며, 2균주가 약한 용혈반응을 나타내었다. 사람혈액을 첨가한 반응시험에서 120균주 중 89.
나타내었다. 512배 역가를 나타낸 균주는 낸 균주는 3 균주, 1024배 역가를 나타낸 균주는 13균주, 2048배 역가를 나타낸 균주는 4균주이었으며, 4096배 높은 독소 생성 역가를 나타낸 균주도 2균주나 나타났다. 이 연구결과는 Nishibuchi 와 Kaper(7)의 결과와도 비슷하게 나타났다.
3%로 가장 많았다. Ampicillin 등 18가지 항균제 시험에서 Ampicillin, Ticacillin 에 높은 내성을 보였으며, Ampicillin, Ticacillin, Vancomycin 에. 동시 내성을 나타낸 경우가 52.
Urease 생성시험에서 1999년 80균주 중 3균주가 양성반응을 보였다. Glucose을 포함한 12가지 당 발효시험에서 Mannitol, Mannose, Maltose, Arabinose, Glucose을 모두 발효하는 것으로 나타났으며, Sucrose는 발효 음성을 나타내었다 (Table 2).
독소생성 Kanagawa 시험에서 120균주 중 107균주가 양성반응을 나타내었으며, Kanagawa 양성반응을 보인 균주은 모두 tdh 유전자를 보유하고 있었다. Gro叩 Specific-PCR에서 최근에 유행을 일으키는 03 : K6 혈청형의 유연관계를 찾는데 유용한 것으로 나타났다. 조절유전자 toxRS 염기서열을 분석한 결과 같은 혈청형이라도 3균주는 7개의 염기서열 차이를 나타내었으며, 이는 현재 유행을 일으키는 균주와는 다른 균주임을 확인하였다.
ONPG 반응시험, Citrate 이용시험, VP 반응, Arginine dehydrolase 시험에서는 모두 음성반응을 나타내었으며, Oxidase 시험, Indole 생성시험, 운동성 시험, Lysine decarboxylase, Ornithine decarboxylase, Nitrate 환원시험에서는 모두 양성반응으로 나타났다. Nutrient broth 배지에서 NaCl 농도에 따른 성장시험에서 무첨가에서는 모두 성장을 하지 않았지만, 6% NaCl 첨가에서는 모두 성장, 8% NaCl 첨가에서는 1999년도 80균주 중 2균주, 2001년도 20 균주 중 4균주가 성장하지 않았을 뿐 모두 증식하는 차이를 보였다. Urease 생성시험에서 1999년 80균주 중 3균주가 양성반응을 보였다.
parahaemolyticus ATCC 17803 균주의 반응 결과와 같이 전형적인 장염비브리오균의 생화학적 특성을 가진 것으로 나타났다. ONPG 반응시험, Citrate 이용시험, VP 반응, Arginine dehydrolase 시험에서는 모두 음성반응을 나타내었으며, Oxidase 시험, Indole 생성시험, 운동성 시험, Lysine decarboxylase, Ornithine decarboxylase, Nitrate 환원시험에서는 모두 양성반응으로 나타났다. Nutrient broth 배지에서 NaCl 농도에 따른 성장시험에서 무첨가에서는 모두 성장을 하지 않았지만, 6% NaCl 첨가에서는 모두 성장, 8% NaCl 첨가에서는 1999년도 80균주 중 2균주, 2001년도 20 균주 중 4균주가 성장하지 않았을 뿐 모두 증식하는 차이를 보였다.
조절유전자 toxRS 염기서열을 분석한 결과 같은 혈청형이라도 3균주는 7개의 염기서열 차이를 나타내었으며, 이는 현재 유행을 일으키는 균주와는 다른 균주임을 확인하였다. PFGE로 보다 더 세분화하여 혈청 관계를 분류할 수 있었으며, 식중독 환자 유래 장염비브리오균은 3 가지 type으로 나타났으며, 이들 균주 사이에는 상호 밀접한 상관관계를 나타내었다. 따라서 PFGE 기법으로 얻어진 결과는 분자 역학적으로 유용한 도구로 사용될 수 있음을 확인하였다.
toxR 유전자 368 bp와 gyrB 유전자 285 bp을 증폭 산물을 이용하여 PCR을 시험한 결과 장염비브리오균 120 균주 모두가 也成과 gyrB에 양성반응을 보여 장염비브리오 조기진단에 도움이 될 것으로 사료된다.
독소 조절유전자 toxRe PCR시험에서 시험균주 모두 368 bp 크기의 유전자를 가지고 있었으며 장염 비브리오균의 조기진단에 유용한 것으로 확인되었고, 독소유전자 tdh 는 120균주 중 109 균주만이 199 bp 크기의 유전자를 보유하고 11균주가 음성이었다. trh 독소 유전자를 보유한 균주는 시험균주 중 3 균주만이 250 bp 크기의 유전자를 보유하고 있었으며, tdh, trh 유전자를 동시에 가지고 있는 균주는 3균주로 이 균주의 TDH 독소 생성능은 X16 정도로 독소 생성능이 미약했다. 독소생성 Kanagawa 시험에서 120균주 중 107균주가 양성반응을 나타내었으며, Kanagawa 양성반응을 보인 균주은 모두 tdh 유전자를 보유하고 있었다.
반면 P-lactamase 억제제가 첨가된 Ampicill回Sulbactam에는 1999년~2001년 설사 환자 분리균 모두 감수성을 나타내었다. 각 항생제의 내성 Patterne Ampicillin, Ticacillin, Vancomycin의 3가지 약제에 동시에 내성을 가진 균주가 52.5%인 63균주가 내성을 나타내었으며, 다음으로 23.3%인 28균주가 Ampicillin, Cephalothin, Ticacillin, Vancomycin의 4가지 다약제에 동시 내성을 나타내었다.
5%로 나타났다. 독소 조절유전자 toxRe PCR시험에서 시험균주 모두 368 bp 크기의 유전자를 가지고 있었으며 장염 비브리오균의 조기진단에 유용한 것으로 확인되었고, 독소유전자 tdh 는 120균주 중 109 균주만이 199 bp 크기의 유전자를 보유하고 11균주가 음성이었다. trh 독소 유전자를 보유한 균주는 시험균주 중 3 균주만이 250 bp 크기의 유전자를 보유하고 있었으며, tdh, trh 유전자를 동시에 가지고 있는 균주는 3균주로 이 균주의 TDH 독소 생성능은 X16 정도로 독소 생성능이 미약했다.
trh 독소 유전자를 보유한 균주는 시험균주 중 3 균주만이 250 bp 크기의 유전자를 보유하고 있었으며, tdh, trh 유전자를 동시에 가지고 있는 균주는 3균주로 이 균주의 TDH 독소 생성능은 X16 정도로 독소 생성능이 미약했다. 독소생성 Kanagawa 시험에서 120균주 중 107균주가 양성반응을 나타내었으며, Kanagawa 양성반응을 보인 균주은 모두 tdh 유전자를 보유하고 있었다. Gro叩 Specific-PCR에서 최근에 유행을 일으키는 03 : K6 혈청형의 유연관계를 찾는데 유용한 것으로 나타났다.
독소조절유전자 toxR, gyrB는 시험균주 모두 보유하고 있는 것으로 나타났으며, 독소유전자 tdh는 120균주 중 109 균주가 독소유전자를 보유하고 있으며, 11균주가 유전자를 보유하지 않는 것으로 나타났다. trh 유전자는 시험균주 120 균주 중 3균주만이 trh 유전자를 보유하고 있는 것으로 나타났으며, 이들 3균주들은 urease 양성 균주들이었다(Fig.
PFGE로 보다 더 세분화하여 혈청 관계를 분류할 수 있었으며, 식중독 환자 유래 장염비브리오균은 3 가지 type으로 나타났으며, 이들 균주 사이에는 상호 밀접한 상관관계를 나타내었다. 따라서 PFGE 기법으로 얻어진 결과는 분자 역학적으로 유용한 도구로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한 tdh 유전자 199 bp을 나타낸 유전자로 PCR 시험에서 식중독 환자 유래 분리균은 120 균주 중 90.8%인 109 균주가 tdh 유전자를 가지고 있는 것으로 나타났으며, TDH 독소 발현은 89.1%인 107 균주로 나타났다. 즉 tdh 유전자는 가지고 있으나, KP 시험이나 TDH RPLA 시험에서 음성반응으로 독소 단백질 발현은 나타나지 않았다.
유전자에 의한 것으로 확인되었다. 본 시험에서 특이한 것은 urease 양성균이 120 균주 중 3 균주가 나왔으며, 이 균주들은 tdh, trh 유전자를 동시에 가지고 있으며, Kanagawa 현상에서 양성반응으로 나타났으나, TDH 역가에서는 다른 균의 역가가 2, 048배에 비해서 매우 낮은 16배 정도를 나타내었다.
상층액 독소와 항독소를 감작시킨 라텍스비드 반응시험에서 120 균주 중 107 균주가 독소생성 양성반응으로 나타났으며, 25 균주를 선별하여 독소생성 역가를 시험한 결과 urease 양성반응을 보였으며, tdh, trh 유전자를 가진 3 균주는 16배에서 32배로 매우 낮은 독소생성 역가를 보였으나, 그 외에 다른 시험 균주는 512배부터 4096배까지 높은 독소 생성 역가를 나타내었다. 512배 역가를 나타낸 균주는 낸 균주는 3 균주, 1024배 역가를 나타낸 균주는 13균주, 2048배 역가를 나타낸 균주는 4균주이었으며, 4096배 높은 독소 생성 역가를 나타낸 균주도 2균주나 나타났다.
설사 환자에서 분리한 장염비브리오균의 0, K 혈청형 시험 결과는 모두 17가지의 O & K 혈청형을 나타내었다. 03 : K6 혈청형이 82 균주로 68.
설사환자에서 분리된 세균을 시험관 배양 반응법으로 시험한 결과 표준 균주인 V. parahaemolyticus ATCC 17803 균주의 반응 결과와 같이 전형적인 장염비브리오균의 생화학적 특성을 가진 것으로 나타났다. ONPG 반응시험, Citrate 이용시험, VP 반응, Arginine dehydrolase 시험에서는 모두 음성반응을 나타내었으며, Oxidase 시험, Indole 생성시험, 운동성 시험, Lysine decarboxylase, Ornithine decarboxylase, Nitrate 환원시험에서는 모두 양성반응으로 나타났다.
장염비브리오균은 0%의 NaCl 농도에서는 성장을 보이지 않았고, 8% NaCl이 첨가된 농도에서는 성장을 보였다. 국내 설사환자의 장염비브리오균의 O, K 혈청형은 17가지로 나타났으며, 이 중 03 : K6형이 68.
Gro叩 Specific-PCR에서 최근에 유행을 일으키는 03 : K6 혈청형의 유연관계를 찾는데 유용한 것으로 나타났다. 조절유전자 toxRS 염기서열을 분석한 결과 같은 혈청형이라도 3균주는 7개의 염기서열 차이를 나타내었으며, 이는 현재 유행을 일으키는 균주와는 다른 균주임을 확인하였다. PFGE로 보다 더 세분화하여 혈청 관계를 분류할 수 있었으며, 식중독 환자 유래 장염비브리오균은 3 가지 type으로 나타났으며, 이들 균주 사이에는 상호 밀접한 상관관계를 나타내었다.
항균제 내성 시험 결과 Ampicillin, Vancomycin, Ticacillin 에는 높은 내성을 보였으며, Ampicillin에는 1999년 설사 환자에서 분리한 장염비브리오균의 경우 93.8%, 2000년과 2001년도 분리 균은 각각 85%의 내성을 보였다. 반면 P-lactamase 억제제가 첨가된 Ampicill回Sulbactam에는 1999년~2001년 설사 환자 분리균 모두 감수성을 나타내었다.
후속연구
Kelly 등(16), Kaysner와 Hill(17), Park 등(18)은 장염비브리오균에서 생화학 특성시험에서 urease (ure+) 양성 균은 병원성을 나타내는 TDH+ 양성균으로 예측할 수 있는 지표로 사용할 수 있다고 하였으나 본 시험에서는 3개의 urease 양성균이 모두 湖I와 仃力유전자를 갖고 TDH 독소를 나타내었지만 TDH 역가에서는 다른 urease 음성인 균보다도 낮게 나와서 위의 Kaysner와 Hill(17)의 시험 결과를 확인하는 데는 좀 더 많은 urease 양성균으로 시험을 해야 될 것으로 사료된다.
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