[논문]한국과 일본에서 유행하는 장염비브리오의 병원성 인자와 유전자의 특성

홍석원; 문지영; 이복권; 김영부

doi:10.5352/jls.2007.17.3.386

한국과 일본에서 유행하는 장염비브리오의 병원성 인자와 유전자의 특성
Genetic Characteristics and Virulence Factors of Pandemic Vibrio parahaemolyticus Isolated in South Korea and Japan 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.17 no.3 = no.83, 2007년, pp.386 - 395

홍석원 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 문지영 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 이복권 (국립보건원 세균질환부 장내세균과) , 김영부 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실)

초록
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본 연구는 1999년에서 2001년도 걸쳐서 3년간 국내에서 분리된 환자유래 장염비브리오 18균주와 일본 후쿠오카 지역에서 2002년도에 환자에서 분리한 장염비브리오 9균주 등 총 27균주에 대하여 toxR 유전자의 검출, 혈청형별 검사, 약제내성의 양상, tdh, trh1 및 trh2 유전자의 보유상태 및 urease 생성성을 살펴보고, 혈청형 O3:K6 균주에 대하여 TDH의 생성성 검사, tdh 양성균주의 RFLP 형별, ORF 8의 분포, PFGE법과 RAPD법을 실시하였으며 결과는 다음과 같다. 1. 한국 및 일본의 환자유래 균주 대부분에서 urease음성이었으며, toxR 유전자로 확인 동정하였고 혈청형의 분포는 국내 분리 주의 O3:K6, O4:K9, O6:K46, O3:K57, O5:Kl5와 일본 분리주의 O3:K6, O1:K38, O4:K68, O4:Kl2의 혈청형으로 나타났다. 2. 항생제 감수성 시험에서는 vancomycin과 oxacillin은 27균주 (100%), penicillin은 26균주 (96.3%)로 높은 내성을 나타내었고, 14균주 (51.9%)가 4가지 이상의 항생제에 다제내성을 나타내었다. 항생제의 내성양상은 6종류로 혈청형에 관계없이 vancomycin, oxacillin, penicillin에 내성을 나타내는 V형이 15균주 (55.6%)로 가장 많이 나타났다. 3. tdh 유전자는 26균주가 PCR법과 DNA probe hybridization법의 결과에서 양성으로 나타났으며, urease양성이었던 일본 환자유래 혈청형 O3:K6 1균주만이 tdh유전자 음성, trh2 유전자 양성을 나타냈다. 혈청형 O3:K6의 TDH 생성성역가는 전 균주가 256배에서 2,048배 정도로 나타났으며, RFLP 양상은 모든 균주가 11.5 kb와 4.3 kb에 tdh 유전자를 보유하고 있었다. 또한 혈청형 O3:K6 균주들은 RAPD법과 PFGE법으로 유전자형별을 비교 검토한 결과 8형으로 거의동일한 유전자형별의 결과를 나타내었다. 4. ORF 8의 분포는 혈청형 O3:K6 전 균주에서 양성이었고, 특히 혈청형 O6:K46 4균주 모두에서 ORF 8 양성을 나타내어 새롭게 나타난 유행균주일 가능성을 시사 하였다. 따라서 ORF 8 유전자의 검출은 범세계적으로 유행하는 균주들을 동정하는데 있어 genetic marker로서 매우 유용한 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

A total of 27 strains of Vibrio parahaemolyticus (18 strains isolated from Korea and 9 strains from Japan) were serotyped and examined for biochemical characteristics, antimicrobial susceptibility patterns, cytotoxicity assay, thermostable direct hemolysin (TDH) production and molecular epidemiology. Using polymerase chain reaction (PCR) method and DNA probe hybridization method, the strains were tested for toxR, tdh, trh and ORF 8 genes. The V. parahaemolyticus isolated from patients were belonged to 8 different serotypes : O3:K6, O1:K38, O3:K57, O4:K9, O4:Kl2, O4:K68, O5:Kl5 and O6:K46. Urease-positive strain possessed the trh gene, and conversely, urease-negative strains lacked the gene, indicating that urease production by V. parahemolyticus strains strongly correlates with the possession of the trh gene. Most strains showed multiple resistant to more than three antibiotics and the antibiogram could be classified into 6 group (I to VI). All of the O3:K6 strains isolated in South Korea and Japan producted TDH at high levels. The TDH titers ranged between 256 and 2.048, and the average titer was 1009. To distinguish the new and increasingly common V. parahaemolyticus strains from clinical isolates, ORF 8 is a useful genetic marker. After Southern hybridization, the HindIII restriction fragment patterns of the tdh gene were grouped one type, respectively. One type showed two bands one of which was 4.3kb and the other was 11.5kb in size. Variation between the O3:K6 serotype are minor when compared to the differences seen with the non O3:K6 strains. The migration patterns of Not I -digested of the total DNA of the O3:K6 strains were similar, and only slight variations were observed between the serotypes. By contrast, the O3:K6 strains and non O3:K6 had markedly different profiles. In conclusion, Random amplified polymorphic DNA (RAPD) profile using appropriate primers was an effective epidemiological marker.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 한국과 일본에서 유행하는 장염비브리오의 병원성 인자와 유전자의 역학적 연구에 도움이 될 특성을 비교하기 위하여 국내에서 분리된 환자유래 장염 비브리오 균주와 일본 후쿠오카 지역의 환자에서 분리한 장염 비브리오 균주에 대하여 toxR 유전자의 검출, 혈청형별 검사, 약제내성의 양상, tdh, trhl 및 trh2 유전자의 보유상태 및 생화학적 성상 중에서 urease 생성성에 대하여 검토하고, 특히 혈청형 O₃K6 장염비브리오 대하여 TDH의 생성성에 대한 검사를 실시하였다. 또한 유전자형별을 검토하기 위하여 tdh 양성균주의 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 형별, ORF8의 분포, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) 법과 random amplified polymorphic DNA (RATO) 법을 실시하여 분석하였다.

제안 방법

ORF 8 유전자[8]의 염기배열 중에서 특이영역 oligonu- cleotide를 합성한 primer를 사용하여 PCRe 앞에서 언급된 teK 유전자의 검출과 동일하게 실시하였다. 그리고 유전자 증폭 과정은 96℃ 5분간 예비 가열한 후, 열변성 94℃, 1분간 실시하고, 1분간 53℃에서 annealing 과정, 1분간 72℃에서 신장과정을 25 cycles을 실시하였다.
tdh, trhl 및 trhl 유전자의 형별은 polynucleotide probe를 사용한 DNA colony blot으로 실시하였다. 즉, tdh 유전자는클론화된 plasmid pCVD518를 QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)로 분리 한 후, 415 bp Pst I 단편을 probe로서 사용하였으며, trhl 유전자는 클론화된 plasmid pKTN 101을 분리하여 334 bp BamHI-EcoRI 단편을 그리고 trh2는 plasmid pKTN 909를 분리 한 후, 419 bp BamHL EcoRI 단편을 probe로 사용하였다.
방법에 따라 시행하였다. 각 plug당 30U의 Not I (TaKaRa Biomedicals) 제한효소를 첨가하여 37℃ 에서 24시간 처리 후 CHEF-DR HI system (Bio・Rad)을 사용하여 1% pulsed field certified agarose gel에서 전기영동을 실시하였다. 영동조건은 pulse시간 2초에서 40초, 전압 6V/cm, 18시간으로 하였다.
유전자의 검출과 동일하게 실시하였다. 그리고 유전자 증폭 과정은 96℃ 5분간 예비 가열한 후, 열변성 94℃, 1분간 실시하고, 1분간 53℃에서 annealing 과정, 1분간 72℃에서 신장과정을 25 cycles을 실시하였다. 10皿의 PCR 증폭 산물과 molecular weight marker로는 100 kb DNA ladder (TaKaRa Biomedicals)> 2% agarose g이 전기영동하였다.
실시하였다. 또한 유전자형별을 검토하기 위하여 tdh 양성균주의 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 형별, ORF8의 분포, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) 법과 random amplified polymorphic DNA (RATO) 법을 실시하여 분석하였다.
균주는 Ewing[6]의 방법에 따라 생화학적.및 혈청학적인 방법으로 동정하였으며, 최종적인 장염비브리오의 동정은 foxR 유전자의 검출로 확인하였다[11].
본 연구는 1999년에서 2001년도 걸쳐서 3년간 국내에서 분리된 환자유래 장염비브리오 18균주와 일본 후쿠오카 지역에서 2002년도에 환자에서 분리한 장염비브리오 9균주 등 총 27균주에 대하여 toxR 유전자의 검출, 혈청형별 검사, 약제내성의 양상, tdh, trhl 및 trh2 유전자의 보유상태 및 ure- ase 생성성을 살펴보고, 혈청형 O₃:K6 균주에 대하여 TDH 의 생 성성 검사, tdh 양성균주의 RFLP 형 별, ORF 8의 분포, PFGE법과 RAPD법을 실시하였으며 결과는 다음과 같다.
사용하였다. 실험균주의 DNA 추출과 PCRe 위의 toxR 유전자의 검출과 동일하게 실시하였으며, 증폭과정은 94℃ 5 분간 여)비 가열한 후, 열변성 94℃, 1분간 실시하고, 1분간 5 5℃에서 annealing 과정, 1분간 72℃ 신장 과정을 35 cycles 을 실시하여 2% agarose gel에서 확인하였다.
영동조건은 pulse시간 2초에서 40초, 전압 6V/cm, 18시간으로 하였다. 영동 후 EtBr로 염색하고 사진촬영을 실시하였으며 Lambda DNA ladders를 molecular weight marker 로서 사용하였다[8,33].
DNA colony blot으로 실시하였다. 즉, tdh 유전자는클론화된 plasmid pCVD518를 QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)로 분리 한 후, 415 bp Pst I 단편을 probe로서 사용하였으며, trhl 유전자는 클론화된 plasmid pKTN 101을 분리하여 334 bp BamHI-EcoRI 단편을 그리고 trh2는 plasmid pKTN 909를 분리 한 후, 419 bp BamHL EcoRI 단편을 probe로 사용하였다. 위의 probe DNA의 표지는 DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 시행하였다[12].
한국 및 일본에서 분리된 환자유래의 혈청형 O₃:K6 17 균주와 혈청형 non O₃:K6의 10균주에 대한 유전자형별을 AP-PCR을 이용한 RAPD법과 PFGE법으로 실시한 결과는 다음과 같았다. RAPD법에서 혈청형 O₃:K6 17균주에서는 OPE-16 primer에 의해 A, B, C, D, E의 5종류로 0PP-16, OPK-Ol, OPK-04 및 OPP-03 primer에 의해 각각 A, B, C의 3종류로 각각 분류할 수 있었다.

대상 데이터

0% agarose ge!에서 10 mA 15V로 18시간 전기영동한 후 위와 같이 Southern hybridization을 실시하였다[29]. Molecular weight marker로 DNA Molecular Weight Marker VⅡ, digox- igenin-labeled (Roche)를 사용하였다.
본 연구에서 사용된 균주는 1999년에서 2001년도에 걸쳐서 국내에서 분리된 환자유래의 장염비브리오 18균주, 2002년도에 일본 후쿠오카에서 분리된 환자유래의 장염비브리오 9균주 등 27균주를 대상으로 하였다. 균주는 Ewing[6]의 방법에 따라 생화학적.
사용한 약제는 BBL Sensi-Disc Antimicrobial Susceptibility Test Discs (Difco, Becton Dickinson Co, MD., USA) 의 제품으로 tetracycline (Te, 30 ㎍), cefoperazone (Cfp, 75 pg), chloramphenicol (C, 30 ㎍), penicillin (P, 10 ㎍, oxacillin (Ox, 1 ug), gentamicin (Gm, 10㎍) 및 vancomycin (Va, 30㎍)의 7가지를 사용하였다.
염색체 DNA의 분리는 실험균주를 LB 한천평판배지에서 37℃ 24시간 배양한 후 1개의 집락만을 선택하여 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Homega)를 사용하였으며 primers는 Table 2와 같이 사용하였다.

이론/모형

Mold 제작은 CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 시행하였다. 각 plug당 30U의 Not I (TaKaRa Biomedicals) 제한효소를 첨가하여 37℃ 에서 24시간 처리 후 CHEF-DR HI system (Bio・Rad)을 사용하여 1% pulsed field certified agarose gel에서 전기영동을 실시하였다.
Probe 의 labelinge random primed DNA labeling 법에 의해서 digoxigenin- 11-deoxyuridine-triphosphate (Boehringer Mannhein, Mannhein, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 시행하였다.
TDH 생성은 reversed passive latex agglutination (RPLA) 법으로 KAP-RPLA kit (Denka Seiken)를 사용하여 검출하였다[10, 34]. 실험균주를 KP배지 (2% NaCl peptone, 0.
polymerase 가!ain reaction (AP-PCR)을 이용한 RAPD법으로 실시하였다.
価와 协의 유전자 검출은 PCR법과 DNA.probe hybrid- ization법으로 하였다.
감수성 검사는 평판희석법에 의하여 Mueller-Hinton 한천배지 (Difco)를' 사용하였으며 방법 및 내성균의 판정은 Clinical and Laboratory Standards Institute의 기쥔20] 에 준하였다. 사용한 약제는 BBL Sensi-Disc Antimicrobial Susceptibility Test Discs (Difco, Becton Dickinson Co, MD.
등 27균주를 대상으로 하였다. 균주는 Ewing[6]의 방법에 따라 생화학적.및 혈청학적인 방법으로 동정하였으며, 최종적인 장염비브리오의 동정은 foxR 유전자의 검출로 확인하였다[11].
34]. 실험균주를 KP배지 (2% NaCl peptone, 0.5% D-mannitol 및 5% NaCl 함유한 액체배지, pH 7.8)에 접종하여 37℃에서 16시간 진탕 배양한 후 4℃, 12,000 rpm으로 원심분리하고 그 상청액을 2배 단계로 희석하여, KAP-RPLA kit 사용설명서에 준하여 microplate법으로 실시하였다.
즉, tdh 유전자는클론화된 plasmid pCVD518를 QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)로 분리 한 후, 415 bp Pst I 단편을 probe로서 사용하였으며, trhl 유전자는 클론화된 plasmid pKTN 101을 분리하여 334 bp BamHI-EcoRI 단편을 그리고 trh2는 plasmid pKTN 909를 분리 한 후, 419 bp BamHL EcoRI 단편을 probe로 사용하였다. 위의 probe DNA의 표지는 DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 시행하였다[12].

성능/효과

1. 한국 및 일본의 환자유래 균주 대부분에서 urease 음성이었으며, foxR 유전자로 확인 동정하였고 혈청형의 분포는 국내 분리주의 O₃K6, O₄:K9, O₆:K46, O₃:K57, O₅:K15와 일본 분리주의 O₃:K6, O₁:K38, O₄:K68, O₄K12의 혈청 형으로 나타났다.
2. 항생제 감수성 시험에서는 vancomycin과 oxacilline 27균주 (100%), penicilline 26균주 (96.3%)로 높은 내성을 나타내었고, 14균주 (51.9%)가 4가지 이상의 항생제에 다제내성을 나타내었다. 항생제의 내성양상은 6종류로 혈청형에 관계없이 vancomycin, oxacillin, penicillin에 내성을 나타내는 V형이 15균주 (55.
3. tdh 유전자는 26균주가 PCR법과 DNA probe hybrid- ization법의 결과에서 양성으로 나타났으며, urease 양성이었던 일본 환자유래 혈청형 O₃:K6 1균주만이 tdh 유전자 음성, trhl 유전자 양성을 나타냈다. 혈청형 O₃K6의 TDH 생성 성역 가는 전 균주가 256배에서 2, 048배 정도로 나타났으며, RFLP 양상은 모든 균주가 11.
4. ORF 8의 분포는 혈청형 O₃:K6 전 균주에서 양성이었고, 특히 혈청형 O₆:K46 4균주 모두에서 ORF 8 양성을 나타내 어 새롭게 나타난 유행균주일 가능성을 시사 하였다. 따라서 ORF 8 유전자의 검출은 범세계적으로 유행하는 균주들을 동정하는데 있어 genetic marker로서 매우 유용한 것으로 사료된다.
7종류의 항생제를 사용한 항생제 감수성 시험에서는 van- comycin과 oxacilline 27균주 (100%), penicillin에 대하여서는 26균주 (96.3%)에서 높은 내성을 나타내었고 gentamicin 에 대하여서는 10균주 (37.0%)가 내성을 나타내는 반면에 그 외 항생제에 대해서는 tetracycline 4균주 (14.8%), chloramphenicol 1균주 (3.7%), cefoperazone 1균주 (3.7%)를 제외한 대부분의 균주에서 감수성을 나타내었다. 그리고 각 항생제의 내성 양상을 살펴보면「VI형의 6종류로 분류할 수 있었으며 한국 및 일본의 대부분의 균주는 혈청형별에 관계없이 vancomycin, oxacillin, penicillin에 내성을 나타내는 V형이 15균주 (55.
ORF 8의 DNA-specific oligonucleotide primer 에서 혈청형 O₃K6 16균주에서 증폭되 었으나, 혈청형 non O₃:K6 균주인 혈청 형 O₄:K9, 03:57, O₅:K15, 04:12 및 O₁:K38 균주에서 ORF 8은 음성이었으며, 특히 혈청형 06:46 4균주 모두에서 ORF 8 양성을 나타내 어 새롭게 나타난 유행균주일 가능성을 시사하였다.
있다[9, 11, 33]. RAPD법과 PFGE법에 의한 유전자형별실험의 결과를 살펴보면 O₃:K6 균주들의 변이는 전체적으로 아주 미약하였으나, 특히 RAPD법의 결과에서는 상당한 다형성 (polymorphism)이 O₃:K6와 non O₃:K6균주 사이에서 관찰되었다. 따라서 RAPD법으로 O₃:K6와 non O₃:K6의 감별이 보다 용이한 것으로 보이며 혈청형 O₃:K6 균주들은 RAPD법과 PFGE법으로 유전자형별을 비교 검토한 결과 거의 동일한 결과를 나타내었다.
RPLA법을 사용하여 TDH 생성의 역가를 비교 검토한 결과는 혈청 형 O₃K6 16균주가 256배에서 2, 048배 정도로 TDH 생성성의 역가가 높게 나타났다. TDH의 생성성은 배양조건 f成의 promotor 차이 및 발현조절인자 fc)xR의 영향에 의한 것으로 알려져 있으며 본 실험에서는 균주에 따라 TDH생성역가가 다소 차이가 있는 것으로 나타났다.
역가가 높게 나타났다. TDH의 생성성은 배양조건 f成의 promotor 차이 및 발현조절인자 fc)xR의 영향에 의한 것으로 알려져 있으며 본 실험에서는 균주에 따라 TDH생성역가가 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. f成양성균주에 대한 Hindias] RFLP 실험의 결과는 16 균주가 모두 11.
TDH의 생성성은 배양조건 f成의 promotor 차이 및 발현조절인자 fc)xR의 영향에 의한 것으로 알려져 있으며 본 실험에서는 균주에 따라 TDH생성역가가 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. f成양성균주에 대한 Hindias] RFLP 실험의 결과는 16 균주가 모두 11.5 kb 와 4.3 kb Hindm DNA 단편에 tdh 유전자를 보유하는 1형뿐이었다. Suthienkul 등[29]은 1996년 이전에 분리한 장염비브리오에 대한 Hindlll으로 RFLP 시험의 결과에서 두 가지 형으로 보고하였다.
역가가 상당히 높았다. tdh 유전자 양성 16균주의 RFLP 양상은 모든 균주가 11.5 kb와 4.3 kb Hind]51 DNA 단편위 에 tdh 유전자를 보유하고 있었다 (Fig. 2).
유전자를 검출한 결과는 다음과 같다. tdh 유전자는 실험 균주 27균주 중에서 26균주가 PCR법과 DNA probe hy- bridization법의 결과에서 양성으로 나타났으며 (Fig. 1), 27 균주 중에서 26균주는 urease를 생성하지 않았으나, 일본 환자 유래 혈청형 O₃:K6 1균주만이 tdh 유전자 음성, irhl 유전자 양성으로 urease 양성을 나타났다 (Table 3).
7%)를 제외한 대부분의 균주에서 감수성을 나타내었다. 그리고 각 항생제의 내성 양상을 살펴보면「VI형의 6종류로 분류할 수 있었으며 한국 및 일본의 대부분의 균주는 혈청형별에 관계없이 vancomycin, oxacillin, penicillin에 내성을 나타내는 V형이 15균주 (55.6%)로 가장 많이 나타났고 그 다음으로 vancomycin, oxacillin, gentamicin 및 penicillin에 내성을 나타내는 IV형 7균주 (25.9%)로 높게 나타났으며 전체 27균주 중 14균주 (51.9%)가 4가지 이상의 항생제에 다제내성을 나타내었다. 또한 국내 분리주의 경우 V형이 가장 많이 나타났으며, 특히 혈청형 O₃:K6균주들은 대부분이 V형의 내성 양상을 나타났다 (Table 3, 4).
RAPD법에서 혈청형 O₃:K6 17균주에서는 OPE-16 primer에 의해 A, B, C, D, E의 5종류로 0PP-16, OPK-Ol, OPK-04 및 OPP-03 primer에 의해 각각 A, B, C의 3종류로 각각 분류할 수 있었다. 따라서 4종류의 primers의 분류를 조합하여 8형 (A, B, C, D, E, F, G 및 H형)으로 분류할 수 있었으며, 한국유래균주는 C형이 주류를 이루었으나 일본 유래균주는 4가지 primers의 조합에서는 B, E, F, G, H 형으로 세분할 수 있었다. 한국유래균주와 일본유래균주의 RAPD법에서 4종류의 primers 의 조합에서 완전하게 일치하는 것은 B형으로 한국유래 3균주와 일본유래 1균주가 완전하게 일치하였다.
RAPD법과 PFGE법에 의한 유전자형별실험의 결과를 살펴보면 O₃:K6 균주들의 변이는 전체적으로 아주 미약하였으나, 특히 RAPD법의 결과에서는 상당한 다형성 (polymorphism)이 O₃:K6와 non O₃:K6균주 사이에서 관찰되었다. 따라서 RAPD법으로 O₃:K6와 non O₃:K6의 감별이 보다 용이한 것으로 보이며 혈청형 O₃:K6 균주들은 RAPD법과 PFGE법으로 유전자형별을 비교 검토한 결과 거의 동일한 결과를 나타내었다. 장염비브리오의 역학적 해석에서는 적절하게 몇 개의 primer를 사용한 AP-PCR법이 역학적 분류를 PFGE법과 같이 세분화 할 수 있고 비싼 장비도 필요 없이 재현성이 높아 신속하고 간편하게 실시할 수 있으므로 대단히 유효한 방법이라고 사료되었다.
그리고 일본 분리균주 1 균주를 제외하고는 모두 urease 음성 이 었다. 또한 toxR 유전자는 실험균주 전부가 보유하고 있어 장염비브리오로 확인 동정할 수 있었다.
9%)가 4가지 이상의 항생제에 다제내성을 나타내었다. 또한 국내 분리주의 경우 V형이 가장 많이 나타났으며, 특히 혈청형 O₃:K6균주들은 대부분이 V형의 내성 양상을 나타났다 (Table 3, 4).
3 kb에 tdh 유전자를 보유하고 있었다. 또한 혈청형 O₃:K6 균주들은 RAPD법과 PFGE법으로 유전자형별을 비교 검토한 결과 8형으로 거의 동일한 유전자형별의 결과를 나타내었다.
4). 또한 혈청형 O₃:K6 균주들은 RAPD법과 PFGE법으로 유전자형별을 비교 검토한 결과 RAPD와 거의 동일한 유전자형별의 결과를 나타내었다. 그리고 antibiogram의 양상은 RAPD법과 PFGE법과는 무관하였다 (Table 4).
한국유래균주와 일본유래균주의 RAPD법에서 4종류의 primers 의 조합에서 완전하게 일치하는 것은 B형으로 한국유래 3균주와 일본유래 1균주가 완전하게 일치하였다. 또한 혈청형 non O₃:K6 균주에서는 혈청형에 따라 각각 a, b, c, d, e, f로 세분할 수 있었고 혈청형 O₃:K6와 non O₃:K6와 전혀 다른 RAPD 양상을 나타내어 AP-PCR법으로 혈청형 O₃:K6 유행균주와 non O₃:K6을 감별할 수 있었다 (Table 4, Fig. 3).
-K25, O₁:K41 및 O₄:K12 등도 보고되고 있다[1, 19]. 본 연구에서 1999년도부터 2001년도까지 3년간에 걸쳐서 분리한 국내유래균주와 2002년 일본 후쿠오카 지역 유래균주의 혈청형 분포를 살펴본 결과 O₄:K9 (3.7%), O₆:K46 (14.8%), O₁:K38 (3.7%), O₄:K12 (3.7%), O₄:K68 (3.7%), O₃:K57 (3.7%) 및 O₃:K6 (63.0%)으로나타났으며, O₃:K6 혈청형이 단연 우위를 차지하고 있었다. 특히 일본 균주 중에서 O₄K68과 O₄K12가 각각 1균주 그리고 국내에서 새로운 혈청형 O₆:K46 4균주가 검출된 것은 처음 나타난 혈청형으로 흥미로운 일이다.
-KUT 균주는 새롭게 나타난 O₃:K6으로부터 진화되었음이 분자역학적 연구로 규명되었다[2, 4]. 본 연구에서 ORF 8 의 보유 유무를 확인한 결과, 병원성 장염비브리오 O₃:K6 17 균주 전부에서 증폭되었으며 2000년도 분리된 한국 유래 혈청형 O₆:K46 4균주와 2002년도 분리된 일본 유래 혈청형 O₄-.K68 1균주에서도 양성을 나타내는 반면, non O₃:K6 (혈청 형 O₄:K9, O₃:K57, O₅:K15, O₄:K12, O₁:K38) 5균주에서는 검출되지 않았다.
본 연구에서 장염비브리오의 병원성 인자를 확인하기 위해 PCR법과 DNA probe법의 두 가지 방법으로 tdh, ㎛1과 trh2 유전자 검출을 실시한 결과, 공시균주 27균주 중에서 26 균주 (96.3%)가 tdh 유전자 양성이었으며 1균주 (3.7%)만이 trh2 유전자 양성이었고 trh2 유전자 양성 균주의 생화학적 성상에서 urease를 생산하는 비전형적인 성상을 나타내었다. 장염비브리오의 urease 생성성에 대하여 1980년 Lam 등[14] 의 보고 이후, urease 생성 장염비브리오에 의한 식중독 사례가 보고되어 병원성과의 연관성에 대하여 주목하게 되었고, 이러한 장염비브리오의 비전형적 성상에 대하여 Park 등[27] 은 임상 분리균주 TH₃₉96의 염색체로부터 urease 유전자군과 trh 유전자를 갖는 15, 754 bp DNA 영역을 클론화 함으로써 ure 유전자는 ureD, A, B, C, E, F, G와 ureR으로 구성되어있고 trh유전자와 근접하고 있으므로 Mi와 urease 생성성과의 관련성을 규명하였다.
장염 비브리오와 콜레라균에서는 16S rRNA유전자의 상동성은 91%이지만 foxR유전자의경우에는 55%이므로 Kim 등μ 1]은 toxR 유전자를 표적으로 하여 본 균의 정확하고 신속한 검출을 위한 PCR법은 최근에 새로이 개발된 방법이다. 본 연구에서는 실험균주를 생화학적 성상 및 혈청형 시험 이후에 본 균의 최종 확정 동정법으로 toxR 유전자 검출을 이용하였으며, 그 결과 실험균주 27 균주 전부가 toxR 유전자를 보유하고 있었다.
따라서 RAPD법으로 O₃:K6와 non O₃:K6의 감별이 보다 용이한 것으로 보이며 혈청형 O₃:K6 균주들은 RAPD법과 PFGE법으로 유전자형별을 비교 검토한 결과 거의 동일한 결과를 나타내었다. 장염비브리오의 역학적 해석에서는 적절하게 몇 개의 primer를 사용한 AP-PCR법이 역학적 분류를 PFGE법과 같이 세분화 할 수 있고 비싼 장비도 필요 없이 재현성이 높아 신속하고 간편하게 실시할 수 있으므로 대단히 유효한 방법이라고 사료되었다. 이처럼 장염비브리오의 역학적 연구에 다양한 분자유전학적인 방법들을 이용되고 있지만 방법에 따라 다양한 분석 능력을 갖고 있으므로 아직은 상호 보완적이어서 계속 새로운 방법들이 시도되어야 할 것으로 사료된다.
제한효소 Not I 를 사용한 PFGE 양상은 혈청형 O₃:K6 17 균주는 1형에서 8형으로 형별되었으며 한국 유래균주는 1형, 2 형, 3형, 4형의 4종류로 형별되었으며 3형이 6주로 가장 많았으며, 일본 유래균주는 2형, 5형, 6형, 7형 8형의 5종류로 형별 되었다. 혈청형 nonO₃:K6는 [형에서 vi형의 6종류로 형별 되었으나, 혈청형 O₃:K6와는 전혀 다른 양상을 나타냈다 (Table 4, Fig.
Suthienkul 등[29]은 1996년 이전에 분리한 장염비브리오에 대한 Hindlll으로 RFLP 시험의 결과에서 두 가지 형으로 보고하였다. 즉, I형은 1.3 kb와 2.5 kb, 또 다른 형은 2.8 kb와 12.7 kb에 tdh 유전자가 존재함을 보고하였으나, 본 실험에선 4.5 kb와 11.5 kb에서 tdh 유전자가 존재하는 하나의 형으로 완전히 다른 RFLP 양상을 나타내었고 이러한 차이는 Suthienkul 등의 실험 균주가 1996년■이전에 분리된 이른 바 ORF 8 음성 균주이기 때문일 것으로 사료되었다.
9%)가 4가지 이상의 항생제에 다제내성을 나타내었다. 항생제의 내성양상은 6종류로 혈청형에 관계없이 vancomycin, oxacillin, penicillin에 내성을 나타내는 V형이 15균주 (55.6%)로 가장 많이 나타났다.
tdh 유전자는 26균주가 PCR법과 DNA probe hybrid- ization법의 결과에서 양성으로 나타났으며, urease 양성이었던 일본 환자유래 혈청형 O₃:K6 1균주만이 tdh 유전자 음성, trhl 유전자 양성을 나타냈다. 혈청형 O₃K6의 TDH 생성 성역 가는 전 균주가 256배에서 2, 048배 정도로 나타났으며, RFLP 양상은 모든 균주가 11.5 kb와 4.3 kb에 tdh 유전자를 보유하고 있었다. 또한 혈청형 O₃:K6 균주들은 RAPD법과 PFGE법으로 유전자형별을 비교 검토한 결과 8형으로 거의 동일한 유전자형별의 결과를 나타내었다.

후속연구

장염비브리오의 역학적 해석에서는 적절하게 몇 개의 primer를 사용한 AP-PCR법이 역학적 분류를 PFGE법과 같이 세분화 할 수 있고 비싼 장비도 필요 없이 재현성이 높아 신속하고 간편하게 실시할 수 있으므로 대단히 유효한 방법이라고 사료되었다. 이처럼 장염비브리오의 역학적 연구에 다양한 분자유전학적인 방법들을 이용되고 있지만 방법에 따라 다양한 분석 능력을 갖고 있으므로 아직은 상호 보완적이어서 계속 새로운 방법들이 시도되어야 할 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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