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문제 정의
- , 1980; Davis and Safe, 1980). PCB 면역독성 연구를 위해 잘 알려진 모델 중 하나는 in u/i/c상에서 sheep red blood cell(sRBC)에 반응한 항체를 연구하는 것이다. 항 sRBC 반응은 antigen-presenting cell(APC), 조절 T 세포와 B 세포에 따라 다르며 in vivo상에서 immune sensitivity를 평가하기 위하여 많이 사용되고 있다.
- 그러므로 본 연구에서 Aroclor 1254가 농도와 시간별로 마우스의 장기들과 면역세포에 미치는 영향을 in vivo 상에서 알아보고자 하였다.
- 이는 300 ㎎/㎏ 이하의 저농도는 비장 세포에 영향을 미치지 않았지만, 1,000 ㎎/㎏ 이상의 고농도의 PCBs는 splenocyte에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 또한 B cell prolifelation의 T cell indepnt polyclonal stimulator LPS와 T cell prolifelation stimulator 인 Con A를 사용하여 투여된 PCBs의 영향을 면역기능 parameter의 하나인 mitogen 유도 lymphocyte prolifelation으로 알아보고자 하였다. 세포증식율의 대조군은 PCB 처리를 하지 않았고, mitogens(LPS, Con A) 만을처리하였다.
- PCBs의 혼합물인 Aroclors 1254는 생식독성, 간 독성 뿐만 아니라 갑상선호르몬 및 면역기능의 저하를 유발하는 면역독성이 일어 PCBs가 노출된 지역의 동물이나 어린이들에서 전염병의 확산이 쉬운 것으로 알려져 있다. 이 연구에서 동물이 PCBs에 노출되었을 때, in vivo상에서 PCBs가 각 장기에 미치는 영향 및 면역세포의 세포생존률 및 세포증식율에 미치는 영향에 대하여 연구하였다.
제안 방법
- A. PCBs에 의한 장기무게의 변화 측정: 각 마우스의 체중을 측정한 후 PCBs를 각각 3, 30, 300, 1,000 mg/ kg으로 Corn oil에 녹여서 각 PCBs 농도별로 군당 3마리에 투여하고 PCBs를 투여한 후 각각 4일, 7일, 14일에 마우스의 복부를 절개하여 간, 비장, 폐를 각각 분리하여 무게를 측정하였다.
- PCBs가 각 장기에 미치는 영향을 연구하기 위하여 실험동물을 이용하여 PCBs 처리군과 대조군을 비교하고 날짜별로 나누어 장기무게를 측정하였다. 각 PCBs 농도 투여군의 간, 폐, 비장의 무게변화를 측정한 결과, 간의 경우, 고농도의 PCBs 투여군에서 간의 비대화 및 간의 무게가 증가하였다.
- PCBs가 면역세포인 림프구에 미치는 영향을 알아보기 위하여 splenocyte의 생존률 및 LPS와 Con A로 유도된 splenocyte 세포증식율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 PCBs를 농도별로 투여한 마우스의 비장을 추출하여 MTS assay 방법으로 관찰하였다. 본 연구에서 세포가 증식하는 과정에서 PCB에 의한 영향으로, 세포생존률은 PCBs 투여 후 4일에는 모든 농도에서 대조군보다 증가하는 양상을 나타내었다.
- PCB를 투여하지 않은 대조군의 세포생존률을 기준으로 농도변화와 시간경과에 따른 세포생존률을 계산하여 비교하였으며, LPS와 Con A 처리된 세포증식율은 역시 PCB 를 투여하지 않은 증식율을 기준으로 변화의 비를 산정하였다. 본 실험은 2요인 실험법(two-way ANOVAE로 수준(level) 간의 차이는 최소유의차 방법으로 유의수준 0.
- PCB의 면역독성에 대한 기존연구에서 단독 PCB보다 PCB 복합체가 강한 독성을 나타낸다는 이론에 따라 상품화되어 있는 PCB 복합체로 PCBs 농도에 따른 면역독성을 관찰하였다. 그룹 당 마우스 3마리씩 3, 30, 300, 1000㎎/㎏의 농도로 PCBs를 투여하여 장기무게 변화, 면역세포의 생존율과 세포증식율을 관찰하였다, 그리고 투여 후, 4일, 7일, 14일의 시간경과에 따른 변화를 관찰하였다.
- 그 후, 1,000 rpm 에서 5분간 원심 분리한 후 배지로 세척하고 96 well microplates에 각각 3X105 cells/well의 세포를 200 μI 씩 분주하였다. 각 plate를 48시간 동안 37℃, 5% CO2 의 배양기에서 배양한 후 각 well에 MTS를 20 μg/well 로 처리한 후 3시간 경과 후에 96 microplate reader에서 490 nm로 O.D.(optical density) 값을 측정하였다.
- 각 농도의 PCBs 투여 후 간, 비장, 폐의 무게변화를 측정하고 각각의 변화량을 농도와 시간경과에 따라 비교하였다(Table 1). PCBs 농도변화에 따른 비장의 무게 변화는 거의 변화가 없었으나(p=0.
- 각각의 PCBs 농도를 투여한 마우스 비장을 추출하여 splenocytes를 분리하고 mitogen인 LPS와 Con A를 처리하여 세포증식율을 관찰하였다. LPS에 의한 splenocytes 의 세포증식율은 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏으로 투여한 군에서는 투여 후 4일, 7일, 14일 모두 증가하였지만 PCBs 1,000 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 4일, 7일 14 일 모두 세포증식율이 감소하였다Gov0.
- 관찰하였다. 그룹 당 마우스 3마리씩 3, 30, 300, 1000㎎/㎏의 농도로 PCBs를 투여하여 장기무게 변화, 면역세포의 생존율과 세포증식율을 관찰하였다, 그리고 투여 후, 4일, 7일, 14일의 시간경과에 따른 변화를 관찰하였다. '
- 값을 측정하였다. 모든 실험결과는 mitogens(LPS & Con A)을 처리한 군을 대조군으로 하여 각각 비교하여 측정하였다.
- 또한 B cell prolifelation의 T cell indepnt polyclonal stimulator LPS와 T cell prolifelation stimulator 인 Con A를 사용하여 투여된 PCBs의 영향을 면역기능 parameter의 하나인 mitogen 유도 lymphocyte prolifelation으로 알아보고자 하였다. 세포증식율의 대조군은 PCB 처리를 하지 않았고, mitogens(LPS, Con A) 만을처리하였다. Mitogens을 처리하지 않은 군과 비교하여 LPS는 4일, 7일, 14일에 각각 50.
- 분석방법: PCB 농도와 시간경과에 따른 간, 폐, 비장의 무게변화를 관찰하는데 각 마우스의 무게에 따른 장기 무게의 차이를 보정(adjust)하기 위하여 간 등의 장기 무게를 마우스의 체중으로 나누어 각 마우스의 체중에 대한 간, 폐, 비장의 무게 값으로 비교 분석하였다. 시간 경과에 따른 무게변화를 관찰하기 위한 대조군으로는 PCB를 투여하지 않고 4일, 7일, 14일째 장기무게를 측정한 값을 평균하여 연구출발 시점의 장기무게로 사용하였다.
대상 데이터
- Polychlorinated biphenyl mixtures는 Supelco에서상품화된 Aroclor 1254를 구입하였고, 경구 투여하기 위하여 Corn oil(Sigma Co.)에 녹여서 사용하였다. LPS와 Con A는 Sigma Chemical Co.
- MTS(promega)는 세포내로 흡수된 후, 미토콘드리아의 succinate dehydrogenase에 의해 formazan을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 즉 세포활성을 의미하므로 세포의 생존률을 측정하는 방법으로 이용되고 있다. 시험에 사용된 실험동물은 6주령의 ICR mice를 식품의약품안전청 동물 실로부터 수령하여 polycarbonate cage에 6마리씩 수용하였다. 수령일로부터 7일 이상의 순화기간 후에 실험을 시작하였다.
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실험재료
실험물질로는 PCBs(Aroclor 1254, Lot 95915)을 사용하였고, 각각의 B-cell lymphocyte mitogen인 Lipo-polysaccharide(LPS), T-cell lymphocyte mitogen인 Concanavalin A(ConA), MTS(Promega) 등을 사용하였다. Polychlorinated biphenyl mixtures는 Supelco에서상품화된 Aroclor 1254를 구입하였고, 경구 투여하기 위하여 Corn oil(Sigma Co.
데이터처리
- E. 분석방법: PCB 농도와 시간경과에 따른 간, 폐, 비장의 무게변화를 관찰하는데 각 마우스의 무게에 따른 장기 무게의 차이를 보정(adjust)하기 위하여 간 등의 장기 무게를 마우스의 체중으로 나누어 각 마우스의 체중에 대한 간, 폐, 비장의 무게 값으로 비교 분석하였다. 시간 경과에 따른 무게변화를 관찰하기 위한 대조군으로는 PCB를 투여하지 않고 4일, 7일, 14일째 장기무게를 측정한 값을 평균하여 연구출발 시점의 장기무게로 사용하였다.
- 본 실험은 2요인 실험법(two-way ANOVAE로 수준(level) 간의 차이는 최소유의차 방법으로 유의수준 0.05 로 비교하였다.
이론/모형
- PCBs 시간경과와 농도에 따른 마우스 비장의 splenocytes의 세포 생존력을 MTS assay 방법으로 관찰하였다. Splenocytes의 세포생존력이 4일에는 대조군에 비해 각 농도가 증가하는 경향을 보였다(q<0.
성능/효과
- 05). (결과는 보이지 않았음) 마우스의 비장을 추출하여 비장 세포의 mitogen에 의한 세포증식율 또한 고농도 PCBs 투여군은 대조군에 비해 많이 감소하여 1,000 ㎎/㎏ 이상의 고농도의 PCBs 투여는 mitogen에 의한 자극에도 세포증식이 일어날 수 없을 정도로 세포에 영향을 주었다고 할 수 있다. Splenocytes 수를 측정하는 실험에서 28일 후의 결과는 대조군과 거의 유사하여 각 장기무게의 변화뿐 아니라 세포생존률과 세포증식율도 14일 이후의 변화를 관찰하여 시간경과에 따른 세포생존률과 세포증식률의 변화를 명확히 규명할 필요가 있다.
- 각각의 PCBs 농도를 투여한 마우스 비장을 추출하여 splenocytes를 분리하고 mitogen인 LPS와 Con A를 처리하여 세포증식율을 관찰하였다. LPS에 의한 splenocytes 의 세포증식율은 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏으로 투여한 군에서는 투여 후 4일, 7일, 14일 모두 증가하였지만 PCBs 1,000 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 4일, 7일 14 일 모두 세포증식율이 감소하였다Gov0.0001)(Fig. 3). Splenocytes의 Con A에 의한 세포 증식력은 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏ 투여군에서는 증가하였으나 PCBs 1, 000 ㎎/㎏을 투여군에서는 투여 후 4일에는 20.
- 세포증식율의 대조군은 PCB 처리를 하지 않았고, mitogens(LPS, Con A) 만을처리하였다. Mitogens을 처리하지 않은 군과 비교하여 LPS는 4일, 7일, 14일에 각각 50.82±0.76, 37.10+ 2.28, 40.88±1.41 그리고 Con A는 28.52+1.10, 24.86 ±2.75, 20.82±1.89로 유의하게 증가하였다0<0.05). (결과는 보이지 않았음) 마우스의 비장을 추출하여 비장 세포의 mitogen에 의한 세포증식율 또한 고농도 PCBs 투여군은 대조군에 비해 많이 감소하여 1,000 ㎎/㎏ 이상의 고농도의 PCBs 투여는 mitogen에 의한 자극에도 세포증식이 일어날 수 없을 정도로 세포에 영향을 주었다고 할 수 있다.
- 1). PCBs 농도변화에 따른 비장의 무게 변화는 거의 변화가 없었으나(p=0.43), 간의 무게는 증가하고 폐의 무게는 약간 감소하는 경향을 나타냈다. 간의 무게는 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 증가하는 경향이었으나 유의성은 없었다.
- 3). Splenocytes의 Con A에 의한 세포 증식력은 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏ 투여군에서는 증가하였으나 PCBs 1, 000 ㎎/㎏을 투여군에서는 투여 후 4일에는 20.9%, 7일에는 44.3%, 14일에는 42.1% 감소하였다S<0.0001) (Fig. 4).
- 관찰하였다. Splenocytes의 세포생존력이 4일에는 대조군에 비해 각 농도가 증가하는 경향을 보였다(q<0.05). 그러나 7일에는 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏을 투여한 군에서는 증가하였으나, PCBs 1,000 ㎎/㎏을 투여군에서는 대조군보다 생존력이 9.
- PCBs 1000 ㎎/㎏ 농도 투여군과 대조군을 비교하였을 때, 투여 후 4일에 가장 크게 증가하였다가 시간이 경과하면서 점차 감소흐]는 경향을 나타내었다. TCDD의 체내 영향에 대한 연구에서 TCDD를 간과 친화성이 높은 2, 2, 4, 4, 5, S-hexachlorci biphenyl (HxCB\와 함께 투여하였을 때, 간 무게가 증가하였고 polychlorinated dibenzo-p-dioxins(PCDDs), polychlorinated dibenzofurans(PCDFs) 및 PCBs를 실험동물에 1회 투여하였을 때, hepatic deposition0] 농도에 따라 증가하였으며, 간 비대화, 간 중량증가, 간세포 종양 및 간세포암(Ward, 1985; Tryphonas et al., 1991: Gray et al., 1993; Mayes et a!.. 1998)을 유발하였던 것과 같이 본 연구에서도 고농도 PCBs의 영향으로 초기에 간의 무게가 증가하였던 것을 관찰할 수 있었다. PCBs에 노출되었을 때, 간에서는 활면소포체(SER, smooth endoplasmic reticulum), peroxisomes, lipid droplet 등이 증가하는데(Thomas et al.
- 나누어 장기무게를 측정하였다. 각 PCBs 농도 투여군의 간, 폐, 비장의 무게변화를 측정한 결과, 간의 경우, 고농도의 PCBs 투여군에서 간의 비대화 및 간의 무게가 증가하였다. PCBs 1000 ㎎/㎏ 농도 투여군과 대조군을 비교하였을 때, 투여 후 4일에 가장 크게 증가하였다가 시간이 경과하면서 점차 감소흐]는 경향을 나타내었다.
- , 1982). 그러므로 본 연구에서 PCBs 투여 후 일정시간이 경과되면 간의 무게가 회복되는 것을 관찰할 수 있었는데 이는 활면소포체에서 CYT 효소의 활동에 의한 해독작용으로 하여 시간이 경과되면서 간의 무게가 정상으로 회복되는 것이라 할 수 있다. 폐의 경우 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏의 농도를 투여한 군에서는 관찰기간 모두 대조군보다 무게가 감소하였고, PCBs 1, 000 ㎎/㎏ 투여군에서는 4일에 무게가 증가하였다가 점차 감소하여 14일째에는 대조군보다 감소되었다.
- 이와 같이 PCBs는 hepatotoxicity, carcinogenesis, neurotoxicity 등의 독성으로 잘 알려진 물질로서 면역억제, 미생물 감염에 대한 저항성 감소, 암에 대한 면역기능 손상 등 면역세포에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 동물의 경우, PCB 노출 후 1~3주에 독성이 나타났고 상품화된 PCB 혼합물의 독성은 성, 종, 연령에 따라 다르며 단독투여 실험보다 반복투여 실험에서 강하게 독성이 나타났다. 이러한 증세는 다른 halogenated aromatics 의 독성과 유사하다고 한다(Damstra et al.
- 본 연구에서 PCBs를 마우스에 투여하였을 때, 간과 폐에서는 초기에 무게가 증가하였다가 시간이 경과 하면 서점 차 감소하는 경향을 나타냈으며, 비장의 경우, 간과 폐와는 다른 무게변화가 관찰되었고 splenocytes의 세포생존률과 세포증식율은 모두 PCBs의 농도와 시간경과에 따라 감소하여 면역계에 영향을 미치는 것을 관찰할 수 있었다.
- assay 방법으로 관찰하였다. 본 연구에서 세포가 증식하는 과정에서 PCB에 의한 영향으로, 세포생존률은 PCBs 투여 후 4일에는 모든 농도에서 대조군보다 증가하는 양상을 나타내었다. 시간에 따라, 저농도의 PCBs 투여군에서는 세포생존률이 증가하다가 14일에 다시 감소하는 경향을 나타냈다.
- , 2000), 이는 폐에서 cytochrome P4501A1 효소의 활성도가 높아져 300 ㎎/㎏ 이하의 PCBs 농도에서 폐의 무게가 감소하였다. 비장에서는 무게의 변화가 PCBs 농도와 시간경과에 따른 유의한 무게변화는 없었으나 투여 후 4일에 비장의 무게가 감소하였다가 7일, 14일에 무게가 증가하는 경향을 보여, 이는 간과 폐의 무게 변화와 다른 양상이었다.
- 그러나 고농도의 PCBs 투여군에서는 세포생존률이 시간이 지날수록 계속하여 감소하다가 14일에는 거의 대조군보다 약 40% 정도 세포생존률이감소하였다. 이는 300 ㎎/㎏ 이하의 저농도는 비장 세포에 영향을 미치지 않았지만, 1,000 ㎎/㎏ 이상의 고농도의 PCBs는 splenocyte에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 또한 B cell prolifelation의 T cell indepnt polyclonal stimulator LPS와 T cell prolifelation stimulator 인 Con A를 사용하여 투여된 PCBs의 영향을 면역기능 parameter의 하나인 mitogen 유도 lymphocyte prolifelation으로 알아보고자 하였다.
- 그러므로 본 연구에서 PCBs 투여 후 일정시간이 경과되면 간의 무게가 회복되는 것을 관찰할 수 있었는데 이는 활면소포체에서 CYT 효소의 활동에 의한 해독작용으로 하여 시간이 경과되면서 간의 무게가 정상으로 회복되는 것이라 할 수 있다. 폐의 경우 PCBs 3, 30, 300 ㎎/㎏의 농도를 투여한 군에서는 관찰기간 모두 대조군보다 무게가 감소하였고, PCBs 1, 000 ㎎/㎏ 투여군에서는 4일에 무게가 증가하였다가 점차 감소하여 14일째에는 대조군보다 감소되었다. PCB 105와 PCB 118 그리고 PCB 156을 마우스에 장기간 투여하였을 때.
후속연구
- (결과는 보이지 않았음) 마우스의 비장을 추출하여 비장 세포의 mitogen에 의한 세포증식율 또한 고농도 PCBs 투여군은 대조군에 비해 많이 감소하여 1,000 ㎎/㎏ 이상의 고농도의 PCBs 투여는 mitogen에 의한 자극에도 세포증식이 일어날 수 없을 정도로 세포에 영향을 주었다고 할 수 있다. Splenocytes 수를 측정하는 실험에서 28일 후의 결과는 대조군과 거의 유사하여 각 장기무게의 변화뿐 아니라 세포생존률과 세포증식율도 14일 이후의 변화를 관찰하여 시간경과에 따른 세포생존률과 세포증식률의 변화를 명확히 규명할 필요가 있다. PCB 중독증은 대부분의 동물종에서 Lymphoid 세포의 응축을 동반하며 (McConnell et al.
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