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문제 정의
- , 1996)은 내분비계장애물질로 분류되고 있는 Mancozeb을 장기간 직업적으로 노출된 사람에게서 면역계 변화가 약하게 나타난다고 보고하였다. 그러나 Mancozeb의 일반독성이나 유전독성 및 생식독성 등에 대한 연구결과에 비해 면역계에 미치는 영향에 대한 연구결과는 거의 보고되지 않아 본 연구에서는 Mancozeb이 생체내의 면역계에 미치는 영향을 체계적으로 검토하기 위하여 Mancozeb을 아급성 노출시킨 후 면역병리학적 인자 및 비장세포 증식능을 측정하였다.
제안 방법
- )에 취하고 roll mixer로 혼화한 후 WBC (white blood cell), RBC (red blood cell), HGB (hemoglobin), HCT (hemato crit), PLT (platelet)-f- Coulter counters- 측정하였다. Coulter counter는 사용 전에 4C plus®액으로 WBC, RBC, HGB, HCT, PLT값을 표준용액에 맞게 보정한 후 혈액을 분석하였다.
- Mancozeb을 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day 용량으로 주 5회 30일간 경구투여하여 아급성 노출시킨후 32일째에 체중 및 사료섭취량과 장기무게를 측정하여 32일 동안 증가된 체중과 사료섭취량 및 체중에 대한 장기중량비를 Table 1에 나타내었다.
- Mancozeb을 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day로 30일간 투여하여 아급성 노출시킨 후 32일째에 마우스의 비장을 무균적으로 적출하였다. 적출한 비장으로 조제한 비장세포액 100μL(2×106cells/mL)를 96 well flat bottomed plate의 각 well에 가하고 30 분동안 배양 (37℃, 5% CO2)하여 안정시킨 후 T cell mitogen인 Con A (2 ㎍/mL) 또는 B cell mitogen인 LPS(50 ㎍/mL)를 각각 가하고 10%FBS-RPMI 배지로 200μL가 되도록 하여 배양하였다.
- Mancozeb을 주 5회 30일간 경구적으로 아급성노출시킨 후 32일째에 비장을 적출하여 비장세포 수를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day용량으로 투여한 결과 대조군에 비해 각각 9.
- Mancozeb을 투여직전 3차 증류수에 현탁하여 마우스 체중 10g당 Mancozeb 현탁액 0.1mL를 투여할 수 있는 농도로 조제한 다음, LD50과 EPA의 면역 독성시험 지침서(U.S. EPA, 1996)를 기준으로 하여 결정한 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day 용량으로 주 5회 30일간 경구투여한 후 32일째에 실험하였고 대조군에는 동량의 3차 증류수를 같은 방법으로 투여하였다.
- 내분비계 장애물질로 알려진 Mancozeb을 250, 1,000, 1,500 mg/kg 용량으로 주 5회 30일간 경구투여하여 아급성 노출시킨 후 면역병리 (체중, 장기 무게, 비장세포수, 복강 대식세포수, 혈액 학적 para meter) 및 mitogen에 대한 비장세포 증식능에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다. Mancozeb에 아급성 노출된 경우 투여용량에 차이는 있으나 간장과 신장의 중량비가 대조군에 비하여 증가되었고 백혈구 수와 적혈구수는 유의성 있게 감소되었으며 혈소판은 약하게 감소하는 경향을 보이고 고농도로 노출시 비장세포수도 유의적으로 감소하였다.
- 마우스의 안정맥총에서 heparinized capillary (Chase instruments Co.)로 채혈하여 EDTA(K3)가 들어있는 시험관 (Sherwood medical Co.)에 취하고 roll mixer로 혼화한 후 WBC (white blood cell), RBC (red blood cell), HGB (hemoglobin), HCT (hemato crit), PLT (platelet)-f- Coulter counters- 측정하였다. Coulter counter는 사용 전에 4C plus®액으로 WBC, RBC, HGB, HCT, PLT값을 표준용액에 맞게 보정한 후 혈액을 분석하였다.
- 적출한 비장으로 조제한 비장세포액 100μL(2×106cells/mL)를 96 well flat bottomed plate의 각 well에 가하고 30 분동안 배양 (37℃, 5% CO2)하여 안정시킨 후 T cell mitogen인 Con A (2 ㎍/mL) 또는 B cell mitogen인 LPS(50 ㎍/mL)를 각각 가하고 10%FBS-RPMI 배지로 200μL가 되도록 하여 배양하였다. 배양 3일후에 MTT assay를 이용하여 비장세포 증식능을 측정하였다.
- 복강에서 취한 세포액을 모아 원심분리 (2,000rpm, 5min., 4℃)한 후 침전물에 0.2% NaCl을 가하여 적혈구를 용혈시킨 다음 원심분리하여 상징액을 제거하고 PBS로 2회 세척후 Turk's solution을 이용하여 마우스 당 세포수를 계산하였다.
- 후 원심분리하였다. 상징액을 제거하고 침전된 비장세포에 일정량의 HBSS용액을 가한 후 Turk's solution (Rakich et al., 1998)으로 세포수를 측정하여 비장당 비장세포수를 계산하였다.
- 실험 전 물은 자유롭게 공급하면서 약 16시간동안 절식한 후 체중을 측정하였으며, 체중증가(g)는 실험일의 체중과 Mancozeb 투여일의 체중과의 차이로 나타내었다. 또한 각 장기의 중량비는 실험일에 실험동물의 비장, 흉선, 간장, 신장을 적출하여 각각의 무게를 실험일의 체중에 대한 백분율(%)로 나타내었다.
- 실험동물 실의 온도는 21 ~ 24℃, 습도는 40~60%로 유지하였고 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
- 비장을 무균적으로 적출하였다. 적출한 비장으로 조제한 비장세포액 100μL(2×106cells/mL)를 96 well flat bottomed plate의 각 well에 가하고 30 분동안 배양 (37℃, 5% CO2)하여 안정시킨 후 T cell mitogen인 Con A (2 ㎍/mL) 또는 B cell mitogen인 LPS(50 ㎍/mL)를 각각 가하고 10%FBS-RPMI 배지로 200μL가 되도록 하여 배양하였다. 배양 3일후에 MTT assay를 이용하여 비장세포 증식능을 측정하였다.
대상 데이터
- 3~4주령인 ICR계 암컷 마우스를 유한양행 중앙연구소로부터 분양받아 고형사료(삼양사)와 수돗물을 자유롭게 공급하면서 실험동물실에서 2~3주간적응시 킨 후, 건강상태가 양호한 6 ~ 8주령 (25±2g)의 마우스를 선택하여 실험에 사용하였다. 실험동물 실의 온도는 21 ~ 24℃, 습도는 40~60%로 유지하였고 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
- 5%, technical grade, Dau Agro Science, France)을 (주)경농에서 공급받아 사용하였고, 시약으로는 Coulter 제품인 Lyse, phosphate buffer, Clenz, Gibco 제품인 RPMI 1640 medium power, fetal bovine serum (FBS), antibiotic -antimycotic agent, MEM-nonessential amino acid, sodium bicarbonate, trypan blue, Hank's balanced salt solution (HBSS), Sigma 제품인 dimethylsulphoxide (DMSO), concanavalin A (ConA), lipopolysaccha rides (LPS), 4-(2-hydroxy ethyl)piperazine- 1 - ethanesulfonic acid(HEPES), Amresco 제품인 3-(4, 5, -dimethythiazol-2-y 1)-2, 5 -diphenyltetrazolium- bromide (MTT)와 Wako 제품인 2 - mercaptoethanol 등을 사용하였으며 그 외의 시약은 모두 세포배양용 또는 특급을 사용하였다. 기기로는 CO2 incubator (NAPCO, Precision scientific Inc.), Coulter counter (T-890, Coulter Co.), ELISA microplate reader (ELX 800, BIO-TEK instruments Co.) 등을 사용하였다
- 실험물질로는 Mancozeb(86.5%, technical grade, Dau Agro Science, France)을 (주)경농에서 공급받아 사용하였고, 시약으로는 Coulter 제품인 Lyse, phosphate buffer, Clenz, Gibco 제품인 RPMI 1640 medium power, fetal bovine serum (FBS), antibiotic -antimycotic agent, MEM-nonessential amino acid, sodium bicarbonate, trypan blue, Hank's balanced salt solution (HBSS), Sigma 제품인 dimethylsulphoxide (DMSO), concanavalin A (ConA), lipopolysaccha rides (LPS), 4-(2-hydroxy ethyl)piperazine- 1 - ethanesulfonic acid(HEPES), Amresco 제품인 3-(4, 5, -dimethythiazol-2-y 1)-2, 5 -diphenyltetrazolium- bromide (MTT)와 Wako 제품인 2 - mercaptoethanol 등을 사용하였으며 그 외의 시약은 모두 세포배양용 또는 특급을 사용하였다. 기기로는 CO2 incubator (NAPCO, Precision scientific Inc.
데이터처리
- 각 실험군의 측정값의 평균과 표준편차를 구하고 대조군의 실험치와 비교하여 Student's t-test로 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 05) 나타났으나 농도의존적인 차이를 나타내지는 않았다. 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day 투여군에서 간장의 중량비는 대조군에 비해 각각 9.9%, 20.5%, 34.3%로 유의성있게 (p<0.01) 농도 의존적으로 증가하였고 신장의 중량비는 Mancozeb 투여군이 대조군에 비해 각각 2.8%, 7.0%, 7.0% (P<0.01)증가 경향을 보였다. Mancozeb 투여군의 흉선 중량비는 대조군에 비해 모든 용량에서 약 11 ~12% 정도 감소하였으며, 비장의 중량비는 대조군과 비슷하였다.
- 본 실험에서 순환말초혈액내의 혈액학적 분석결과는 Guest 등(1991)이 보고한 결과와 유사하였다. 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day 투여군에서 백혈구(WBC)수가 각각 22.1%, 23.3%, 40.7% 농도의존적으로 유의성있게 (p<0.01) 감소하였으며, 적혈구(RBC)수는 1,000, 1,500mg/kg/day 투여군에서 대조군에 비해 각각 3.8% (p<0.01), 6.3% 약하게 감소하였다. Hemoglobin (HGB)은 저농도에서는 대조군과 차이가 없었으나 1,000, 1,500 mg/kg/day 용량에서 대조군에 비해 각각 3.
- 1과 같다. 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day용량으로 투여한 결과 대조군에 비해 각각 9.0%, 27.8%, 33.8% (p<0.05) 감소하여 고농도의 Mancozeb에 반복적으로 노출될 경우 마우스의 비장세포수가 영향을 받는 것으로 보인다.
- 01)증가 경향을 보였다. Mancozeb 투여군의 흉선 중량비는 대조군에 비해 모든 용량에서 약 11 ~12% 정도 감소하였으며, 비장의 중량비는 대조군과 비슷하였다. 이상의 결과는 저자 등 (Chung and Pyo, 2004)이 Mancozeb을 마우스에 급성노출하여 보고한 결과와 매우 유사하였다.
- 얻었다. Mancozeb에 아급성 노출된 경우 투여용량에 차이는 있으나 간장과 신장의 중량비가 대조군에 비하여 증가되었고 백혈구 수와 적혈구수는 유의성 있게 감소되었으며 혈소판은 약하게 감소하는 경향을 보이고 고농도로 노출시 비장세포수도 유의적으로 감소하였다. Mancozeb을 아급성 노출시킨 비장세포는 T cell mitogen인 Con A에 대해서는 용량의 존적으로 증식정도가 저하되었으며, B cell mitogen인 LPS에 대해서도 다소 증식이 감소되었다.
- Mancozeb에 아급성으로 노출된 마우스의 Con A에 대한 비장세포 증식능(Fig. 3)은 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day 투여군에서 대조군에 비해 각각 16.6%, 19.4% (p<0.05), 21.6% (p<0.05) 용량의존적으로 감소되었으며, 급성노출시(Chung and Pyo, 2004)에 나타난 감소경향이 아급성 노출시에 비장세포 증식능이 뚜렷이 감소되는 것으로 보인다. 또한 LPS에 대한 비장세포 증식능을 측정한 결과를 Fig.
- Mancozeb에 아급성 노출된 경우 투여용량에 차이는 있으나 간장과 신장의 중량비가 대조군에 비하여 증가되었고 백혈구 수와 적혈구수는 유의성 있게 감소되었으며 혈소판은 약하게 감소하는 경향을 보이고 고농도로 노출시 비장세포수도 유의적으로 감소하였다. Mancozeb을 아급성 노출시킨 비장세포는 T cell mitogen인 Con A에 대해서는 용량의 존적으로 증식정도가 저하되었으며, B cell mitogen인 LPS에 대해서도 다소 증식이 감소되었다.
- Mancozeb의 아급성 노출에 의해 250mg/kg/day 용량에서 대조군에 비해 체중증가(g)의 감소가 유의성 있게(P<0.05) 나타났으나 농도의존적인 차이를 나타내지는 않았다. 250, 1,000, 1,500 mg/kg/day 투여군에서 간장의 중량비는 대조군에 비해 각각 9.
- 05) 용량의존적으로 감소되었으며, 급성노출시(Chung and Pyo, 2004)에 나타난 감소경향이 아급성 노출시에 비장세포 증식능이 뚜렷이 감소되는 것으로 보인다. 또한 LPS에 대한 비장세포 증식능을 측정한 결과를 Fig. 4에서 보면, Mancozeb에 in vivo에서 아급성 노출을 받은 비장세포의 LPS mitogen에 대한 증식정도는 대조군에 비해 모든 용량에서 약 15% 감소되었다.
- 이상의 결과는 Mancozeb은 아급성 노출시 면역병리학적 parameter에 변화를 유발하고 비장 세포증식능을 억제하는 결과를 보여 생체 면역계에 영향을 미칠 수 있음을 시사해 주고 있다.
후속연구
- 이상의 결과로 보면, Mancozeb으로 아급성 노출이 되었을 때 세포성 면역반응이 억제되고 체액성면역반응도 영향을 받을 것으로 생각되며 Mancozeb의 면역독성기전 연구를 계속 진행할 필요가 있다.
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