한우 및 산양의 장내 섬유소 분해 혐기 곰팡이의 분리 및 특성 구명 Isolation and Characterization of Cellulolytic Anaerobic Fungi from the Guts of the Hanwoo Cattle and the Korean Native Goat원문보기
본 연구는 국내의 재래 반추동물인 재래산양과 한우의 장내에 서식하며 강력한 섬유소를 분해하는 혐기 곰팡이를 탐색하고 분리하여 섬유소 분해 특성을 구명하고자 실시되었다. 산양의 반추위로부터 16종과 한우의 십이지장 소화물로부터 5종의 혐기 곰팡이를 분리하여 총 21종의 혐기성 곰팡이가 분리되었다. 섬유소 분해효소의 활력을 측정하여 그 중 섬유소 분해력이 높은 4종의 곰팡이에 대하여 광학현미경에 의한 형태학적 관찰을 기초로 동정 작업을 수행하였다. NLRI-M003은 monocentric 성장형태, 구형의 포자낭, filamentous rhizoid 및 유주자의 flagella가 다수인 Neocallimastix sp., NLRI-M014는 monocentric 성장형태, 방추형의 포자낭, filamentous rhizoid 및 유주자의 flagella가 단수인 Piromyces sp.로, NLRI-T004는 monocentric 성장형태, 난형의 포자낭, filamentous rhizoid 및 유주자의 fagella 수가 다수인 Neocallimastix sp.로 각각 확인되었다. NLRI-M001은 Orpinomyces sp. 와 유사한 것으로 추측되나 지금까지 밝혀진 곰팡이 이외에 다른 밝혀지지 않은 곰팡이가 존재할 가능성이 있을 것으로 평가되어 더욱 더 세부적인 조사가 필요하다고 사료되었다. 혐기 곰팡이의 섬유소 분해 특성을 조사하기 위해 산양의 반추위로부터 분리된 NLRI-M003 혐기 곰팡이 배양액을 2% 첨가하여 혼합 반추위 미생물의 in vitro 건물 분해율을 볏짚과 filter paper를 기질로 하여 조사하였다. 모든 처리구에서 혐기 곰팡이 배양액을 첨가한 첨가구가 무첨가구에 비하여 볏짚의 경우 약 4%이상(p〈0.05) 그리고 filtre paper를 기질로 사용시 11% 이상(p〈0.001)의 분해율이 증가하였다. 또한 CMCase와 xylanase 효소의 활력도 첨가구에서 증가하였으며 특히 반추위 곰팡이는 강력한 xylanase 효소활력이 높음을 보여주었다.
본 연구는 국내의 재래 반추동물인 재래산양과 한우의 장내에 서식하며 강력한 섬유소를 분해하는 혐기 곰팡이를 탐색하고 분리하여 섬유소 분해 특성을 구명하고자 실시되었다. 산양의 반추위로부터 16종과 한우의 십이지장 소화물로부터 5종의 혐기 곰팡이를 분리하여 총 21종의 혐기성 곰팡이가 분리되었다. 섬유소 분해효소의 활력을 측정하여 그 중 섬유소 분해력이 높은 4종의 곰팡이에 대하여 광학현미경에 의한 형태학적 관찰을 기초로 동정 작업을 수행하였다. NLRI-M003은 monocentric 성장형태, 구형의 포자낭, filamentous rhizoid 및 유주자의 flagella가 다수인 Neocallimastix sp., NLRI-M014는 monocentric 성장형태, 방추형의 포자낭, filamentous rhizoid 및 유주자의 flagella가 단수인 Piromyces sp.로, NLRI-T004는 monocentric 성장형태, 난형의 포자낭, filamentous rhizoid 및 유주자의 fagella 수가 다수인 Neocallimastix sp.로 각각 확인되었다. NLRI-M001은 Orpinomyces sp. 와 유사한 것으로 추측되나 지금까지 밝혀진 곰팡이 이외에 다른 밝혀지지 않은 곰팡이가 존재할 가능성이 있을 것으로 평가되어 더욱 더 세부적인 조사가 필요하다고 사료되었다. 혐기 곰팡이의 섬유소 분해 특성을 조사하기 위해 산양의 반추위로부터 분리된 NLRI-M003 혐기 곰팡이 배양액을 2% 첨가하여 혼합 반추위 미생물의 in vitro 건물 분해율을 볏짚과 filter paper를 기질로 하여 조사하였다. 모든 처리구에서 혐기 곰팡이 배양액을 첨가한 첨가구가 무첨가구에 비하여 볏짚의 경우 약 4%이상(p〈0.05) 그리고 filtre paper를 기질로 사용시 11% 이상(p〈0.001)의 분해율이 증가하였다. 또한 CMCase와 xylanase 효소의 활력도 첨가구에서 증가하였으며 특히 반추위 곰팡이는 강력한 xylanase 효소활력이 높음을 보여주었다.
The study was conducted to isolate and identify highly fibrolytic anaerobic fungi from the guts of a Hanwoo steer and a Korean native goat, and then investigate the characterization of cellulolytic activity of an anaerobic fungus. Twenty-one anaerobic fungal colonies were isolated in the study, in w...
The study was conducted to isolate and identify highly fibrolytic anaerobic fungi from the guts of a Hanwoo steer and a Korean native goat, and then investigate the characterization of cellulolytic activity of an anaerobic fungus. Twenty-one anaerobic fungal colonies were isolated in the study, in which 16 colonies were isolated from the rumen contents of the Hanwoo steer and 5 colonies from the duodenal fluids of the Korean native goat. Four anaerobic fungi were selected based on higher cellulolytic enzyme activities to identify under a optical microscope. NLRI-M003 and -T004 belong to Neocallimastix genus and NLRI-M014 belongs to Piromyces genus based on the morphology of their thallus, sporangia, rhizoid and the number of flagella. NLRI-M001 appeared to be an unknown strain of anaerobic fungi due to its different morphology from existing types of anaerobic fungi, though the morpholgoy is similar to Orpinomyces sp. Supplementation of 2% anaerobic fungal culture(NLRI-M003) in rumen-mixed microorganisms increased in vitro DM degradability of rice straw and filter paper up to 4 and 11%, respectively, compared with non-supplementation(control). CMCase and xylanase activities in in vitro culture were also higher in 2% fungal supplementation than controls in both rice straw and filter paper substrates.
The study was conducted to isolate and identify highly fibrolytic anaerobic fungi from the guts of a Hanwoo steer and a Korean native goat, and then investigate the characterization of cellulolytic activity of an anaerobic fungus. Twenty-one anaerobic fungal colonies were isolated in the study, in which 16 colonies were isolated from the rumen contents of the Hanwoo steer and 5 colonies from the duodenal fluids of the Korean native goat. Four anaerobic fungi were selected based on higher cellulolytic enzyme activities to identify under a optical microscope. NLRI-M003 and -T004 belong to Neocallimastix genus and NLRI-M014 belongs to Piromyces genus based on the morphology of their thallus, sporangia, rhizoid and the number of flagella. NLRI-M001 appeared to be an unknown strain of anaerobic fungi due to its different morphology from existing types of anaerobic fungi, though the morpholgoy is similar to Orpinomyces sp. Supplementation of 2% anaerobic fungal culture(NLRI-M003) in rumen-mixed microorganisms increased in vitro DM degradability of rice straw and filter paper up to 4 and 11%, respectively, compared with non-supplementation(control). CMCase and xylanase activities in in vitro culture were also higher in 2% fungal supplementation than controls in both rice straw and filter paper substrates.
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문제 정의
그러므로 Berton 등 (1990) 이사하라사막의 열악한환경에서 서식하는 산양 (Saharian ass) 의 장내로부터 혐기곰팡이(Piromyces rhizinflata) 를 분리한 것과 data-checked="false">같이 열악한환경조건에 있는 동물의 소화관에서 우수한섬유소분해력을가진곰팡이의분리는 우리나라와 같은 저질의 부존조사료원의 data-checked="false">이용성을 개선하는데 많은 영향을 끼치리라 기대된 다 . data-checked="false">따라서 본연구는 저질조사료 공급에도 적응력이 높은 국내의 재래반추동물인재래산양 의반추위에서식하는혐기성곰팡이와산성조 건에서 생존 가능한 곰팡이를 분리하기 data-checked="false">위해한우의십이지장내에 생존가능한강력한 섬유 소 분해력을 가진 혐기 곰팡이를 탐색 분리및 동정하였다 . 또한 선발된 혐기 data-checked="false">곰팡이들의 섬유소분해특성을 비교하고자저질조사료인 볏짚과 filterpaper 를 기질로건물분해율과섬유소분해효소의 활력을 측정하였다.
본연구는 국내의 재래반추동물인 재래산양과 한우의 장내에 서식하며 강력한 data-checked="false">섬유소를 분해하는 혐기곰팡이를 탐색하고분리하여 섬 유소 분해 특성을 구명하고자 실시되었다 산. 양의반추위로부터 16 종과한 우의십이지장소화물로부터 5 종의 혐기 곰팡이를 분리하여 총 21 종의 혐기성 곰팡이가 분리되었다 .
제안 방법
첨가용곰팡이배양액은 mediumB 에서3 일 동안 배양된 것을 이용하였다 . 50ml 의 분해율측정용배지에 곰팡이배양액을 2%수준으로 첨가하였다 . 섬유소 분해율과 효소활력을 측정하기 위하여 2mmscreensize 의 Wiley mill 로분쇄한볏짚과 WhatmanNo.
측정하였다 . Buchner 깔때기와 Whatman filter paper No. 54 및진공장치를이용하여 시료의 잔량을 측정하여 투입시료량과의 차이를구하고 , 이 차이량을 투입시료량에 대한 백분율로 환산하여 건물분해율을 구하였다.
CMCase 의 활력은 전과 동일한 방법으로 측정하였으며 , xylanase 의 활력은 0.5M potassium phosphate buffer(pH 6.5) 의 2% oat spelt xylan (w/v; Sig ma X0627) 1ml 을 이용하여 CMCase 활력분석법과 동일한방법으로 분석하였다.
5g 씩각배지에첨가하였다 . data-checked="false">건물분해율을 측정하기위하여 곰팡이배양액을첨가하지 않은 대조구 즉 무첨가구와 첨가구로 data-checked="false">나누어 각기질에 대하여 각각 따로invitro실험을 수 행하였다.
광학현미경 관찰을 위하여 액체배양액 내에서 곰팡이 colony 의 형성과 유주자의 이동을 제한하기 위하여 Ho 등 (1993a , b) 이 이용한 glucose sloppy agar medium ( Table 1) 을 사용하였다.data-checked="false">앞에서 분리된 혐기곰팡이 배양액의 첨가가 혼합반추미생물의 섬유소분해에미치는 영향 을 조사하기 위하여 filter paper 와 볏짚의 in vitro 건물분해율과 섬유소 분해효소의 활력을 측정하였다.
. 각 배양시간대별로 볏짚과 filter paper 의 건물분해율과 섬유소분해효소인 CMCase 와 xylanase 의효소활력을측정하였다 .
data-checked="false">따라서 본연구는 저질조사료 공급에도 적응력이 높은 국내의 재래반추동물인재래산양 의반추위에서식하는혐기성곰팡이와산성조 건에서 생존 가능한 곰팡이를 분리하기 data-checked="false">위해한우의십이지장내에 생존가능한강력한 섬유 소 분해력을 가진 혐기 곰팡이를 탐색 분리및 동정하였다 . 또한 선발된 혐기 data-checked="false">곰팡이들의 섬유소분해특성을 비교하고자저질조사료인 볏짚과 filterpaper 를 기질로건물분해율과섬유소분해효소의 활력을 측정하였다.
배양이 완료된 bottle 을 개봉하여 원심분리 (3000rpm, 20 분 ) 한후상층액 3ml 을회수하여 효소 분석용 시료로 보관한 다음 건물 분해율을 측정하였다 . Buchner 깔때기와 Whatman filter paper No.
1) 를첨가하고공시균주를 1ml 씩각각혐기적으로 접종한다음 , 72 시간동안 39 의 incubator 에서배양하였다 . 배양이 완료된 시료는 400~ 1,000 배율로 곰팡이와 유주자를 관찰하였다 . 광학현미경 관찰을 위하여 액체배양액 내에서 곰팡이 colony 의 형성과 유주자의 이동을 제한하기 위하여 Ho 등 (1993a , b) 이 이용한 glucose sloppy agar medium ( Table 1) 을 사용하였다.
분리된 곰팡이들 중에서 섬유소분해 곰팡이를 선발하기 위하여 medium B 중에 탄수화물 원을 filter paper strip(WhatmanNo.1, 20-10mm) 으로 대체하여 배양하였다 . 배양 tube 중 배양액에 탁도 (turbidity) 가 나타나는 것은 박테리아가 오염된 것으로 간주하였으며(Joblin, 1981) 탁도가 나타나지 않는 배양 tube 의 배양액만 사용하였다 .
분리된 균주들의 섬유소 분해력을 신속 간편하게 비교하기 위하여 섬유소분해효소인 B -D-endoglucanase(CMCase, carboxymethylcellulase) 의 활력을 측정하였다 . 본시험에서 분리된곰팡이들을 medium B 에서 3 일 동안 배양한 후각 균주들의 배양액으로부터 상층액을 채취하여 3, 000rpm 에서 20 분 동안 원심분리한 다음 조효소액으로 사용하였다 .
산양의 반추위로부터 분리된 NLRI-M003 혐기 곰팡이 배양액을 2% 첨가시 in vitro 건물분해율이 볏짚과 filter paper 를 기질로 한 모든 처리 구에서 24시간 배양 이전까지는 무 첨가 구와 첨가구간 차이가 없었지만 48 시간 배양 data-checked="false">이후부터 기질들의 건물분해율이유의적으로증 가하였다 . data-checked="false">볏짚을 기질로 하였을때 곰팡이 배양액무첨가구와 첨가구의 최종건물 분해율은 각각 54.
. 선발된 4 종의 혐기성 곰팡이에 대하여 광학현미경 하에서 형태특성을 관찰하여 동정 작업을 수행하였다 . 이들 4 종의 곰팡이의 미세구조에 대한 광학현미경을 통하여 관찰한 모습은 Fig.
50ml 의 분해율측정용배지에 곰팡이배양액을 2%수준으로 첨가하였다 . 섬유소 분해율과 효소활력을 측정하기 위하여 2mmscreensize 의 Wiley mill 로분쇄한볏짚과 WhatmanNo.1filterpaper 를 0.5g 씩각배지에첨가하였다 . data-checked="false">건물분해율을 측정하기위하여 곰팡이배양액을첨가하지 않은 대조구 즉 무첨가구와 첨가구로 data-checked="false">나누어 각기질에 대하여 각각 따로invitro실험을 수 행하였다.
양의반추위로부터 16 종과한 우의십이지장소화물로부터 5 종의 혐기 곰팡이를 분리하여 총 21 종의 혐기성 곰팡이가 분리되었다 . 섬유소분해효소의 활력을 측정하여 그 중 섬유소 분해력이 높은 4 종의 곰팡이에 대하여 광학현미경에 의한 형태학적 관찰을 기초로 동정 작업을 수행하였다 . NLRI-M003은 monocentric 성장형태 , 구형의 포자낭 , filamentous rhizoid 및 유주자의 flagella 가 다수인 Neocallimastix sp.
배양 tube 중 배양액에 탁도 (turbidity) 가 나타나는 것은 박테리아가 오염된 것으로 간주하였으며(Joblin, 1981) 탁도가 나타나지 않는 배양 tube 의 배양액만 사용하였다 . 순수성을 확보하기 위해 복합 항생제를 사용하여 위와 같은 과정을 반복하며 곰팡이를 순수분리하였다( 이등 , 1995).
혐기상태에서 30 분간 39 를 유지하며 위액을 정치시킨 후 위액의 상층에 부유하는 data-checked="false">사료입자를 진공펌프를 이용하여 제거한 후남아 있는 잔류 위액을 혼합 반추위 미생물 접종액으로 이용하였다 . 접종은 100ml serum bottle 에 각각 10ml 의 위액을 접종하고 첨가구에는 2% 의 곰팡이 배양액을 첨가하고 무첨가구에는 동등량의 medium B 배지를 첨가한 후 buttly rubber stopper 와 aluminiumseal cap 을이 용하여 밀봉하여 bottle 내혐기가유지되도록하였다 .
전 시험과정동안 혐기 곰팡이의 분리 및 계대를 위해서 혐기 가스 분주 장치 (anaerobic gassing system) 를 이용한 Hungate (1966) 와 Holdeman(1977) 의 방법을 이용하였다 . 채취한소화물들은 섬유소분해혐기곰팡이를 분리하기위하여 Lowe 등 (1985) 이사용한배지 (mediumB;Table1) 중의탄수화물원을 분쇄한 (ball-milled) filterpaper 로대체하였다 . 항생제인 benzyl penicillin, streptomycin sulfate 및 chloram phenicol 을 각각 1.
채취한소화물들은 섬유소분해혐기곰팡이를 분리하기위하여 Lowe 등 (1985) 이사용한배지 (mediumB;Table1) 중의탄수화물원을 분쇄한 (ball-milled) filterpaper 로대체하였다 . 항생제인 benzyl penicillin, streptomycin sulfate 및 chloram phenicol 을 각각 1.212, 0.264 및 0.06g/100ml 로 혼합한 복합 항생제를 채취한 소화물에 투여하여 박테리아의 성장을 억제하였다 . 위와 같이 준비된 섬유소 분해 곰팡이 대량배양용 enrichment 배지액속에서 3 일간 혐기배양 시켰다 .
혐기 곰팡이 배양액의 첨가에 의한 in vitro 건물 분해율 측정을 위하여 혼합 반추위 미생물의 배양시간을 균주를 접종한 후 0, 6, 12, 24, 48, 72 및 96 시간동안 39 항온기에서 교반 없이 배양하였으며 , 3 반복으로 실험을 수행하였다 . 각 배양시간대별로 볏짚과 filter paper 의 건물분해율과 섬유소분해효소인 CMCase 와 xylanase 의효소활력을측정하였다 .
와유사한것으로 추측되나 지금까지 밝혀진 곰팡이 이외에 다른 밝혀지지 않은 곰팡이가 존재할 가능성이 있을 data-checked="false">것으로 평가되어 더욱더 세부적인 조사가필요하다고 사료되었다 . 혐기 곰팡이의 섬유소 분해 data-checked="false">특성을 조사하기 위해 산양의반추위로부터 분리된 NLRI-M003 혐기 곰팡이 배양액을 2% 첨가하여 혼합반추위미생물의in vitro 건물분해율을 볏짚과 filter paper 를 기질로 하여 조사하였다 . data-checked="false">모든처리구에서 혐기곰팡이배양액을첨가한첨가구가무첨가구에 비하여볏짚의경우 약 4% 이상 (p 0.
위와 같이 준비된 섬유소 분해 곰팡이 대량배양용 enrichment 배지액속에서 3 일간 혐기배양 시켰다 . 혐기곰팡이만대량으로 배양된 배양액을혐기 희석액 (Bryant 와 Burkey, 1953) 에서 10-1 10-9 까지희석하여 순수분리를 위한접종액으로 이용하였다 . 섬유소 분해 곰팡이의 분리는 rolltube 법을 이용하여 희석된 접종액 1ml 을 2% agar 가 함유된 9ml 의 medium B 에 접종한 후 , 시험관을 얼음물 위에서 회전시켜 agar 를 굳혔다 .
채취한위액 및고형물을 4 겹의가제로거른후 O2-free-CO2가스가 충진된 보온병에 넣어 실험실로 운반하였다 . 혐기상태에서 30 분간 39 를 유지하며 위액을 정치시킨 후 위액의 상층에 부유하는 data-checked="false">사료입자를 진공펌프를 이용하여 제거한 후남아 있는 잔류 위액을 혼합 반추위 미생물 접종액으로 이용하였다 . 접종은 100ml serum bottle 에 각각 10ml 의 위액을 접종하고 첨가구에는 2% 의 곰팡이 배양액을 첨가하고 무첨가구에는 동등량의 medium B 배지를 첨가한 후 buttly rubber stopper 와 aluminiumseal cap 을이 용하여 밀봉하여 bottle 내혐기가유지되도록하였다 .
혐기생태계로부터섬유소분해력이우수한곰팡이들을 분리하기 위해서 한우의 data-checked="false">십이지장 그리고 볏짚만을 급여 한재래산양의 반추위내 용물을 수거하여 총 21 종의 혐기 곰팡이를 분리하였다 . 산양의반추위로부터 16 종 (NLRI-M001 ~ M0016) 과한우의십이지장소화물로부터 5 종 (NLRI-T001~ T005) 의 혐기 곰팡이를 분리하였다 .
대상 데이터
볏짚과 농후사료를 7:3 으로 급여 받은 반추위 캐뉼라가 장착된 거세 한우 1 두로 부터 사료급여 3 시간 후에 500ml 의 위액과 500g 의 반추위고형물을 채취하였다 . 채취한위액 및고형물을 4 겹의가제로거른후 O2-free-CO2가스가 충진된 보온병에 넣어 실험실로 운반하였다 .
본시험에서 분리된곰팡이들을 medium B 에서 3 일 동안 배양한 후각 균주들의 배양액으로부터 상층액을 채취하여 3, 000rpm 에서 20 분 동안 원심분리한 다음 조효소액으로 사용하였다 . CMCase 의 활력측정은 조효소액 0.
본실험에서는앞실험에서직접분리 data-checked="false">동정된혐기곰팡이 중섬유소분해율이 가장 높고 대량배양이용이한 산양의 반추위로부터 분리 된 혐기 곰팡이 NLRI-M003 을 첨가용 균주로 사용하였다 . 첨가용곰팡이배양액은 mediumB 에서3 일 동안 배양된 것을 이용하였다 .
. 산양의반추위로부터 16 종 (NLRI-M001 ~ M0016) 과한우의십이지장소화물로부터 5 종 (NLRI-T001~ T005) 의 혐기 곰팡이를 분리하였다 . 곰팡이의 분리하는 과정 중에서 나타난 colony 의특성과성장특성은 Table2 에나타내었다.
십이지장 캐뉼라가장 착된볏짚과비육기배합사료를 3: 7 로급여받는한우 1 data-checked="false">두로부터 십이지장액을 채취하였고 볏짚만급여받는 반추 위 캐뉼라가 장착된 재래산양 1 두로부터 반추 위액을 채취하였다 . 전 시험과정동안 혐기 곰팡이의 분리 및 계대를 위해서 혐기 가스 분주 장치 (anaerobic gassing system) 를 이용한 Hungate (1966) 와 Holdeman(1977) 의 방법을 이용하였다 .
총 21 종의 순수 분리된 혐기 곰팡이들에 대한 섬유소 분해효소 (CMCase) 의 활력을 측정하여 그 중 섬유소 분해력이 우수한 4 종을 최종선발하였다 . 선발된 4 종의 혐기성 곰팡이에 대하여 광학현미경 하에서 형태특성을 관찰하여 동정 작업을 수행하였다 .
데이터처리
In vitro 건물 분해율 및 효소활력에 대한 무 첨가구와 첨가구간의 결과분석은 SAS package program(1996)을 이용하여 분산분석을 실시하 였다
이론/모형
본시험에서 분리된곰팡이들을 medium B 에서 3 일 동안 배양한 후각 균주들의 배양액으로부터 상층액을 채취하여 3, 000rpm 에서 20 분 동안 원심분리한 다음 조효소액으로 사용하였다 . CMCase 의 활력측정은 조효소액 0.5ml 를 각각 취한 후 0.05M citrate buffer(pH 5.5) 로 부유시킨 1% carboxymethylcellulose (w/v; CMC, Sig ma C4888) 를 0.5ml 넣고 50 에서 1시간 반응시킨 후 CMC 로부터 유리된 환원당의 양을 dinitrosalicylic acid(DNS, Sig ma D0550) 을 이용하여 비색법으로 측정하였다 (Miller 등 , 1960). 효소의 1 IU (international unit) 은 1 분당 생성된 1 u mol 의 glucose 의양으로 cellulase 의활력을표시하였다.
배양이 완료된 시료는 400~ 1,000 배율로 곰팡이와 유주자를 관찰하였다 . 광학현미경 관찰을 위하여 액체배양액 내에서 곰팡이 colony 의 형성과 유주자의 이동을 제한하기 위하여 Ho 등 (1993a , b) 이 이용한 glucose sloppy agar medium ( Table 1) 을 사용하였다.data-checked="false">앞에서 분리된 혐기곰팡이 배양액의 첨가가 혼합반추미생물의 섬유소분해에미치는 영향 을 조사하기 위하여 filter paper 와 볏짚의 in vitro 건물분해율과 섬유소 분해효소의 활력을 측정하였다.
선발된 곰팡이를 동정하기 위하여 광학현미경 (Nikon, Japan) 하에서 형태를 관찰하여 Barr (1980) 의방법에따라동정을실시하였다 . 광학현미경 관찰을 위하여 medium B 에 filter paper disc(WhatmanNo.
채취하였다 . 전 시험과정동안 혐기 곰팡이의 분리 및 계대를 위해서 혐기 가스 분주 장치 (anaerobic gassing system) 를 이용한 Hungate (1966) 와 Holdeman(1977) 의 방법을 이용하였다 . 채취한소화물들은 섬유소분해혐기곰팡이를 분리하기위하여 Lowe 등 (1985) 이사용한배지 (mediumB;Table1) 중의탄수화물원을 분쇄한 (ball-milled) filterpaper 로대체하였다 .
성능/효과
21 종 중 재래산양으로부터 분리된 곰팡이 중 10 종과 한우로부터 분리한 곰팡이 중 3 종은 CMCase 에 대한 활력이 아주 미약하거나 활력을 보이지 않았다 . 전반적인섬유소분해효 소의 활력은 약 30 u mol/min/ml 정도 이었으며 그중한우로부터 분리된 혐기곰팡이NLRI-M003 이 CMCase activity 가 75.
7 일동안성장시킨 colony 의색은주로흰색 , 노란색 및 황색이었는데 colony 의 중앙에는 진한황색 , 가운데부분은노란색그리고가장자리로 갈수록 옅어지는 colony 와 colony 전체가 흰색인 것이 가장 많았다 . 그러나 성장 시기에 따라 colony 의 색은 많은 변화를 일으켜 초기에는 흰색의 점으로 성장을 시작하여 3~4 일경부터 중앙부분이 황색으로 변하며 5~6 일 data-checked="false">이후부터는 급속히성장하여 가장자리에흰색의환 을형성하기시작하는데 이는 곰팡이의가근의 성장에 따른 영향인 것으로 생각되었다 .
혐기 곰팡이의 섬유소 분해 data-checked="false">특성을 조사하기 위해 산양의반추위로부터 분리된 NLRI-M003 혐기 곰팡이 배양액을 2% 첨가하여 혼합반추위미생물의in vitro 건물분해율을 볏짚과 filter paper 를 기질로 하여 조사하였다 . data-checked="false">모든처리구에서 혐기곰팡이배양액을첨가한첨가구가무첨가구에 비하여볏짚의경우 약 4% 이상 (p 0.05) 그리고 filtre paper 를 기질로 사용시 11% 이상 (p 0.001) 의 분해율이 증가하였다 . 또한 CMCase 와 xylanase 효소의 data-checked="false">활력도첨가구에서 증가하였으며 특히반추위곰 팡이는 강력한 xylanase 효소활력이 높음을 보여주었다.
data-checked="false">볏짚을 기질로 하였을때 곰팡이 배양액무첨가구와 첨가구의 최종건물 분해율은 각각 54.4와 58.6% 로 나타났으며 filter paper 를 기질로 하였을 때 건물 분해율은 무첨가구와 첨가구각각 47.3 및 58.3% 로측정되어 볏짚의경우 약 4% 이상 (p 0.05) 그리고 filter paper 를기질로 사용 시 11% 이상 (p 0.001) 의 in vitro 건물분해율증가를볼수있었다 (Fig.5). 일반적으로 볏짚과 filter paper 간의 혼합 반추위 미생물에 의한 in vitro분해율을보면filter paper 가 분해율이 높은데 이러한 것은 filter paper 가 순수 cellulose 로구성이 되어있고 그 반면 볏짚은 다양한 구조탄수화물들(lignin, hemicellulose, cel lulose 및 pectin 등) 과볏짚의외피가 silica 와 큐틴 등으로 덮여있기 때문에 filter paper 에 data-checked="false">비하여 반추위미생물들이 분해가용이 하지못하 다 .
결론적으로 비록 한우 십이지장에서 분리된혐기 곰팡이의 섬유소 분해력은 낮은 편이었지만 Davies 등 (1993a) 이 언급하였듯이 반추동물의 십이지장내에 혐기 곰팡이가 분리된다는 것이 증명되었고 완벽한 동정은 이루어지지 않았지만 지금까지는 밝혀지지 않은 곰팡이가 존재할 가능성이 있을 것으로 평가되었다 . 또한 혼합 반추위 미생물의 in vitro 배양에 혐기 곰팡이 배양액을 첨가하였을 때 섬유소 분해율이 증가되며 이러한 것은 주로 섬유소 분해 효소의 역할이 컸음을 알 수 있었다 .
001) 의 분해율이 증가하였다 . 또한 CMCase 와 xylanase 효소의 data-checked="false">활력도첨가구에서 증가하였으며 특히반추위곰 팡이는 강력한 xylanase 효소활력이 높음을 보여주었다.
인지 만 구분되었다 . 본 시험에서 분리된 곰팡이 중 3 종(NLRI-M001, NLRI-M003 및 NLRI-T004) 의유주자는 모두구형의 형태로복수의 flagella 형태였으며 , NLRI-M014 만이 구형이며 단수의 flagellum 형태였다 . 유주자의 flagella 수는 Neocallimastix sp.
를 제외한 다른 혐기 곰팡이는 filamentous 형태의가근을가지고있다 . 본 연구에서 분리된 곰팡이의 rhizoid 는 모두가 filament 형태로 나타났다.
분리된 곰팡이 4 종의포자낭형태는분리번호 NLRI-M001 이끝이두개이상의갈라진방추형 (fusiform), NLRI-M003은 구형 (globose), NLRI-M014 는 난형에 가까운 구형 (oval, globose and variab le) 및 NLRI-T004 는난형 (Oval) 으로나타났다 . 가근의형태를비교하였을때 NLRI- M001 data-checked="false">은얇은수많은 가근을 가지고있으며NLRI-M003 과 -M004 은 굵은 몇 개의 가근으로부터 많은 수의 가근들이 세분되어 있었다 .
산. 양의반추위로부터 16 종과한 우의십이지장소화물로부터 5 종의 혐기 곰팡이를 분리하여 총 21 종의 혐기성 곰팡이가 분리되었다 . 섬유소분해효소의 활력을 측정하여 그 중 섬유소 분해력이 높은 4 종의 곰팡이에 대하여 광학현미경에 의한 형태학적 관찰을 기초로 동정 작업을 수행하였다 .
유주자의 미세구조 즉 , flagella 의 수와 data-checked="false">크기는종을 동정하는 필수적인요소로서Piromyces, Caecomyces및 uminomyces속은 단지한개의 flagellum 이 붙어 있는 형태를 취하고 나머지속들은 유주자에 여러 개의 flagella 가 붙어 data-checked="false">있는 형태를취하며 그길이는 종을구명하는단 서로이용되지만본 연구에서는 flagella 의길이는 측정되지 않았고 복수 flagella 인지 단수의 flagellum 인지 만 구분되었다 . 본 시험에서 분리된 곰팡이 중 3 종(NLRI-M001, NLRI-M003 및 NLRI-T004) 의유주자는 모두구형의 형태로복수의 flagella 형태였으며 , NLRI-M014 만이 구형이며 단수의 flagellum 형태였다 .
후속연구
그러나 NLRI-M001은 복수의 포자낭을 가지고있는Orpinomyces sp. data-checked="false">와유사한것으로 추측되나지금까지 밝혀진 곰팡이이외 에 다른 밝혀지지 않은 곰팡이가 존재할 가능성이 있을 것으로 평가되어 더욱 더 세부적인조사가필요하다고생각된다.
또한 혼합 반추위 미생물의 in vitro 배양에 혐기 곰팡이 배양액을 첨가하였을 때 섬유소 분해율이 증가되며 이러한 것은 주로 섬유소 분해 효소의 역할이 컸음을 알 수 있었다 . 앞으로 이러한 혐기 곰팡이의 대량 배양 및 보존 방법을 개발한다면 반추 동물의 발효 조건을 개선하고 섬유소 분해력을 증가시킴으로써 결국 저질조사료의 활용도를 높이며 반추 동물의 생산성을 향상시킬 수 있 으리라 기대된다.
NLRI-M001 은 Orpinomyces sp. 와유사한것으로 추측되나 지금까지 밝혀진 곰팡이 이외에 다른 밝혀지지 않은 곰팡이가 존재할 가능성이 있을 data-checked="false">것으로 평가되어 더욱더 세부적인 조사가필요하다고 사료되었다 . 혐기 곰팡이의 섬유소 분해 data-checked="false">특성을 조사하기 위해 산양의반추위로부터 분리된 NLRI-M003 혐기 곰팡이 배양액을 2% 첨가하여 혼합반추위미생물의in vitro 건물분해율을 볏짚과 filter paper 를 기질로 하여 조사하였다 .
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