고성능 박층 크로마토그래프를 이용한 실데나필과 그 유사 물질의 정량에 관한 연구 Determination of Sildenafil and Its Related Substances Using High Performance Thin Layer Chromatography원문보기
고성능박층크로마토그래프 (HPTLC : high performance thin layer chromatography)를 이용하여 실데나필과 그 유사체인 바데나필, 호모실데나필, 타다나필등을 신속하고 정확하게 분리정량하는 방법을 연구하였다. 실데나필 및 유사실데나필에 대한 최적의 분리조건과 각 성분의 고유한 UV스펙트럼을 얻었다. 각 성분의 검정선의 직선범위는 4성분에 대하여 약 $1.0{\sim}56.5{\mu}g/mL$이며, 상관계수($r^2$)은 모두 0.999이상 이었다. 정량한계는 약 $1.0{\sim}2.3{\mu}g/mL$, 검출한계는 약 $0.8{\sim}1.8{\mu}g/mL$이었으며, 정밀성을 시험한 결과 분산계수 (C.V.)가 2.5% 이하였다. 동 시험법으로 건강보조식품중 함유되어 있는 실데나필 및 그 유사체의 확인 및 함유량을 매우 신속하게 측정할 수 있었다.
고성능박층크로마토그래프 (HPTLC : high performance thin layer chromatography)를 이용하여 실데나필과 그 유사체인 바데나필, 호모실데나필, 타다나필등을 신속하고 정확하게 분리정량하는 방법을 연구하였다. 실데나필 및 유사실데나필에 대한 최적의 분리조건과 각 성분의 고유한 UV스펙트럼을 얻었다. 각 성분의 검정선의 직선범위는 4성분에 대하여 약 $1.0{\sim}56.5{\mu}g/mL$이며, 상관계수($r^2$)은 모두 0.999이상 이었다. 정량한계는 약 $1.0{\sim}2.3{\mu}g/mL$, 검출한계는 약 $0.8{\sim}1.8{\mu}g/mL$이었으며, 정밀성을 시험한 결과 분산계수 (C.V.)가 2.5% 이하였다. 동 시험법으로 건강보조식품중 함유되어 있는 실데나필 및 그 유사체의 확인 및 함유량을 매우 신속하게 측정할 수 있었다.
The rapid and sensitive determination method of sildenafil and its related compounds (Vardenafil, Homosildenafil, Tadanafil.) has been investigated using high performance thin layer choromatography (HPTLC). Optimizing separation conditions and simultaneous determination method of these compounds wer...
The rapid and sensitive determination method of sildenafil and its related compounds (Vardenafil, Homosildenafil, Tadanafil.) has been investigated using high performance thin layer choromatography (HPTLC). Optimizing separation conditions and simultaneous determination method of these compounds were studied. The calibration curves of those compounds at 254 nm was found to be linear in the range of $1.0{\sim}56.5{\mu}g/mL$, respectively. The detection limts (LOD) and quantification limits (LOQ) of these were found to be $0.8{\sim}1.8{\mu}g/mL$ and $1.0{\sim}2.3{\mu}g/mL$. The coefficient of variation (C.V.) were less than 2.5%. Finally, the present method was applied to determine sildenafil and its related substances in dietary supplement.
The rapid and sensitive determination method of sildenafil and its related compounds (Vardenafil, Homosildenafil, Tadanafil.) has been investigated using high performance thin layer choromatography (HPTLC). Optimizing separation conditions and simultaneous determination method of these compounds were studied. The calibration curves of those compounds at 254 nm was found to be linear in the range of $1.0{\sim}56.5{\mu}g/mL$, respectively. The detection limts (LOD) and quantification limits (LOQ) of these were found to be $0.8{\sim}1.8{\mu}g/mL$ and $1.0{\sim}2.3{\mu}g/mL$. The coefficient of variation (C.V.) were less than 2.5%. Finally, the present method was applied to determine sildenafil and its related substances in dietary supplement.
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문제 정의
지금까지 실데나필의 경우 LC/MS를 이용한 생체시료에서의 확인시험, HPLC법을 이용한 의약품에서의 함량시험등에 관하여 이미 많은 연구가 진행 되어왔다.6-10) 본 연구에서는 실데나필과 그 유사체들에 대하여 HPTLC법으로 신속하게 동시에 분리·정량하는 분석법을 개발하고자 하였다.
HPTLC을 이용하여 신테나필과 그의 유도체들을 신속하고 정확하게 분석하는 분석법을 연구하였다. 이때 HPTLC용 TLC 판은 고밀도의 실리콘이 피복된 HPTLC 용 판에서 4게의 유사신테나필 성분이 잘 분리되였고 이동상으로는 ethyacetate : acetonitrile : ammonia = 90 : 10 : 5인 비로 만든 이동상에서 가장 잘 분리가 이루어 젔다.
그러나 이는 점적되는 양에 따른 편차 및 점적부위의 퍼짐정도 등에 따라 재현성의 편차가 날 수 있다. 따라서 본 연구에서는 동일한 부피의 스프레이 방식으로 점적하여 이러한 단점을 없애고자 하였다. 혼합표준액을 메탄올로 적당한 농도로 희석하여 전개한 후 각 성분의 봉우리 면적을 254 nm에서 측정하여 검량선을 작성하여, 각 성분에 대한 직선범위와 직선성을 구하였다.
제안 방법
TLC 판은 Precoated 50 HPTLC plates silicagel 60 F254(Merck), 점적은 ATS4(CAMAG)의 스프레이방식 노즐을 사용하였고, 전개는 Camag Twin-trough chamber(for 10 cm x 10 cm plates)에서 하였으며, Densitometric scanner는 Camag TLC Scanner Ⅲ로 검출파장 200 〜400 nm 에서 absorbance-reflectance mode로 스캔하여 측정하였다. 스캐너는 bandwidth 6 nm, slit width 4.
이때 HPTLC용 TLC 판은 고밀도의 실리콘이 피복된 HPTLC 용 판에서 4게의 유사신테나필 성분이 잘 분리되였고 이동상으로는 ethyacetate : acetonitrile : ammonia = 90 : 10 : 5인 비로 만든 이동상에서 가장 잘 분리가 이루어 젔다. 이 분석법을 이용하여 시중에 유통되는 건강보조식품에서 이들을 분석하였다.
일발적으로 TLC법에서는 검정선을 작성할 때 점적하는 양(μm)에 대하여 봉우리면적으로 검량선을 작성한다. 즉, 동일한 농도의 시료를 가지고 점적하는 부피를 달리하여 검량선을 그렸다. 그러나 이는 점적되는 양에 따른 편차 및 점적부위의 퍼짐정도 등에 따라 재현성의 편차가 날 수 있다.
표준혼합액을 희석하여 봉우리면적의신호대 잡음(S/N) 비가 3배 이상이 되는 농도를 검출한계(LOD)로 측정하고, 검정선에서 직선성이 있는 최저농도를 정량 한계(LOD)로 측정한 결과를 Table 2에 나타냈다. 각 시료의 LOD는 0.
6mg. 호모실데나필 19.6mg, 타다나필 22.6mg 및 바데나필 10.4mg을 각각 취하여 100mL 용량플라스크에 넣고 메탄올로 녹인 후 100 mL로 묽혀 저장용액을 제조한 후 적당한 양을 취하여 혼합하여 최종농도가 실데나필 44.05μm/mL, 호모실데나필 49.04μm/mL, 타다나필 56.52μm/mL 및 바데용하였다.
혼합표준액을 메탄올로 여러 농도로 희석하여 10μL로 일정하게 점적하여 파장 254nm에서 각 성분의 피크 면적을 계산하여 검출한계 및 정량한계를 구하였다.
따라서 본 연구에서는 동일한 부피의 스프레이 방식으로 점적하여 이러한 단점을 없애고자 하였다. 혼합표준액을 메탄올로 적당한 농도로 희석하여 전개한 후 각 성분의 봉우리 면적을 254 nm에서 측정하여 검량선을 작성하여, 각 성분에 대한 직선범위와 직선성을 구하였다.
대상 데이터
TLC 판은 HPTLC 용 Plate (CAMAG, 10 X 10 cm) 로 고밀도판을 사용하였다.
구연산실데나필(97.5%), 호모실데나필(100%), 타다나필(99.9%), 바데나필(99.8%)의 각 표준물질은 식품의 약품안전청 정량용원료(의약원료제조회사제공)를 사용하였으며, 표준용액 제조 및 이동상 제조에 사용된 시약은 HPLC급 메탄올 및 탈이온수를 사용하였다.
전개용매를 Table 1과 같이 제조하여 여러 가지 HPTLC에서 각 성분의 최적 분리조건을 나타내는 전개용매 조긴과 분리능이 우수한 TLC판을 선택하였다.
데이터처리
45μm, scanning speed 20mm/s 이다. 계산프로그램은 winCATS version 1.1.3.0(CAMAG)으로 하였다.
성능/효과
2a와 같이 양호한 분리가 이루어 젔다. 또한 헬륨기체를 이용한 분사방식의 점적을 사용함으로 일반 TLC판의 경우 점적 부위에 실리카판의 손상이 생겨 정밀한 시험에 영향이 미치는 것으로 나타났다.
실데나필을 포함한 4성분의 표준혼합액을 가지고 여러 가지 HPTLC용 전개판과 Table 1과 같은 다양한 전개용매 조건으로 전개시킨 결과 고밀도로 코팅된 실리카의 HPTLC용 전개판에서 ethyacetate : acetonitrile : ammonia(25%)의 비가 90 : 10 : 5로 혼합한 용리액에서 가장 양호한 분리가 이루어졌으며, 기타 전개용 매에서는 실데나필 및 바데나필이 구조적으로 매우 유사하여 동성분의 분리가 잘 이루어지지 않았다. 위 전개용매 조건에서 일반적으로 사용되고 있는 실리카판과, 고밀도로 코팅된 HPTLC용 실리카판을 비교한 결과 HPTLC 판에서 Fig.
위에서 얻은 최적조건에서 표준혼합액(Fig. 2a)으로 검정선을 작성한 결과 Fig. 3과 같이 각 성분의 직선범위는 실데나필 1.8-44.1, 바데나필 1.0〜26.1, 호모실데나필 2.0 〜 49.0 및 타다나필 2.3 〜 56.5 μg/mL이었으며, 이때 직선성은 각 성분 모두 0.999이상으로 매우 양호하였다.
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