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문제 정의
- 강한 활성을 관찰하였다. 따라서 chloroform 분획을 각종 칼럼 크로마토그라피를 실시하여 3종의 collagen 합성 촉진 물질들을 분리하였으며, 각종 spectral 데이터를 바탕으로 각각의 구조를 동정하여 이를 보고하고자 한다.
- 001% 이하로 함유되어 있어 상업화가 힘든 것으로 확인되었다. 이에 이들 유효성분의 확보를 위한 유효성분의 상업화 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 38 ppm 의 singlete hydroxy peak에 해 당한다. Butenyl과 acrylic acid의 결합 위치는 HMBC를 이용하여, butenyl의 methylene proton(H-l")과 benzofuran4번 carbon, 그리고 acryl의 double bond proton(H-1' and H-2‘)과 benzofuran5 번 carbon peak 사이의 2J(C, H) 또는 3J couplings value로 각각 확인하였다.
- 09 ppm의 singlete methoxy peak 이 다. methoxy의 결합 위치는 HMBC를 이용하여, methoxy proton (H-2")과 benzofuran4번 carbon peak 사이의 3J(C, H) couplings value로 확인하였다,
- 콜라겐 생성 효능을 나타냄을 확인하였다. 또한 이들 유효성분을 백지로부터 높은 수율로 확보할 수 있는 반응 조건 및 정제방법을 선정하여 백지 약재로부터 0, 25%의 수율로 제조할 수 있는 제조법을 선정하였다.
- N- diethylanilin을 첨가하고 220℃에서 1시간 reflux시킨 후 실온으로 냉각하여 반응을 종료시킨다. 반응액 으로부터 유효성분을 얻기위해 chloroform을 가하고, 동량의 3 M 염산 용액으로 3회 분획하여 세척한 chloroform 분획을 4℃에서 24 시간 냉장방치하여 침전을 제조하고, 여과하여 얻은 침전을 n-hexanae으로 세척하여 유효성분인 prangenidin, 8-hydroxy- bergapten, xanthotoxol의 혼합물을 얻었다. 제조한 혼합물의 prangenidin과 8-hydroxybergapten의 비율은 약 3:1이고 이들의 함량은 97%이상이다.
- 분쇄한 백지의 80% Methanol추출물을 n-hexane, chloro-form, n-buthanol을 이용하여 순차적으로 용매분획하고, 각각의 분획에 대해 collagen 합성 촉진능을 평가한 결과, chloroform분획에서 강한 활성을 관찰하였다. 따라서 chloroform 분획을 각종 칼럼 크로마토그라피를 실시하여 3종의 collagen 합성 촉진 물질들을 분리하였으며, 각종 spectral 데이터를 바탕으로 각각의 구조를 동정하여 이를 보고하고자 한다.
- 시험물질조제 - 0.2% DMSO를 음성대조군으로, 0.3 mM ascorbic acid를 양성대조군으로 사용하였으며, 시험물 질의농도는 0.3 mM ascorbic acid와 유사한 정도의 콜라겐 합성촉진 효과를 보이는 농도인 2gg/ml, 1 (ig/ml, 0.5 μg/ml의 농도로 각각 조제하였다.
- 유효 분획은 combiHT SB-C18 column(2x25 cm)< 이용하여 Prep HPLC를 용리 액 40% Acetonitrilee 수행하여 BG-CH-R-SC-1 ~7의 성분 7종 및 BG-CH-R-P-1 ~10의 10개의 분획을 제조하였다. 얻은 성분 및 분획의 효능을 평가하여 유효성분 BG-CH-R-SC-2(Compound I, 200 mg), BG-CH-R-SC-4(Compound Ⅱ, 70 mg) 및 BG-CH-R-SC-5(Compound in, 12 mg)를 획인하였다 (Scheme 1).
- 8, 9, 10을 얻었다. 유효 분획은 combiHT SB-C18 column(2x25 cm)< 이용하여 Prep HPLC를 용리 액 40% Acetonitrilee 수행하여 BG-CH-R-SC-1 ~7의 성분 7종 및 BG-CH-R-P-1 ~10의 10개의 분획을 제조하였다. 얻은 성분 및 분획의 효능을 평가하여 유효성분 BG-CH-R-SC-2(Compound I, 200 mg), BG-CH-R-SC-4(Compound Ⅱ, 70 mg) 및 BG-CH-R-SC-5(Compound in, 12 mg)를 획인하였다 (Scheme 1).
- 이 중 효과가 우수한 chloroform 분획을 대상으로 용리액Chloroform : Methanol(3:l)을 사용하는 Silica column chromatography를 수행하여 분리에 방해가 되는, 효능이 없으며 다량인 극성 물질을 컬럼에 흡착시켜 제거하고, 용리된 분획을 다시 Chloroform: Methanol(20: 1)을 사용하는 Silica column chromatography를 수행 하여 유효분획 BG- CH-R-7, 8, 9, 10을 얻었다. 유효 분획은 combiHT SB-C18 column(2x25 cm)< 이용하여 Prep HPLC를 용리 액 40% Acetonitrilee 수행하여 BG-CH-R-SC-1 ~7의 성분 7종 및 BG-CH-R-P-1 ~10의 10개의 분획을 제조하였다.
- 5 kg을 얻었다. 이 추출물에 정제수를 가하여 현탁 시킨 후 n-hexane, chloroform, n-buthan이을 순차적으로 가해 n-hexane, chloroform, n-buthanol, Water 분획을 얻어 감압농축하여 각각의 용매분획을 얻었다.
- 이상의 연구결과를 적용하여 백지로부터 유효성분을 제조하였다.
- xanthotoxole coumarin계통의 물질로써 백지 내 함량이 작아 상업화가 힘든 물질이다. 이에 백지에 다량 함유되어 있는 coumarin 계통의 물질들로부터 유효성분을 제조할 수 있는 방법을 연구한 결과 백지 내 함량이 0.24%인 imperatorin과 0.15%인 cnidilin으로부터 N, N- diethyanilin을 이용한 Claisen rearrangement 반응을 통해 유효성분을 제조하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- 세포배양 - 실험에 사용된 human dermal fibroblast는 피부과 의원에서 포경수술 후 얻어지는 포피를 이용하여 배양하였다. 1차 배양된 human Ubroblast를 10% FBS를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium에서 37℃, 5% COjS건에서 배양하였다.
- mass spectra는 AutoSpec mass spectrometer(Micromass, Manchester, UK)를, NMR spectra는 Broker DMX-600 FT- NMR spectrometere-, IR spectra는 Shimadzu I*4R35 를 사용하여 얻었다. 세포배양을 위해 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum), antibiotics 와 Trypsin(2.5%)을 Gibco에서 구입하였고, collagen 정 량은 emzyme-linked immunosorbent assay kit(TAKARA, Japan)를 사용하였다. 그외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 실험재료 - 본 실험에서 사용된 백지는 서울 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험은 각 농도에 대하여 triplicate로 수행하였으며 얻어진 data값은 평균과 표준 편차를 구하여 student's f-test를 이용, 음성 대조군과의 통계적 유의성을 검증하였다. 한편 대조군에 대한 콜라겐 합성 증가 %는 평균값을 이용하여 표기하였다.
이론/모형
- 24시간 후 세포들을 serum-free DMEM으로 3회 세척하고, 시료를 농도별로 녹인 serum-free DMEM 용액으로 교환하고 24시간 배양한다. 배양액으로부터 새로 생성된 procollagen type I C-peptide를 emzyme-linked immunosorbent assay kit(TAKARA, Japan)을 이용하여 정량하였다.
성능/효과
- Compound I의 구조분석 - 미황색의 침상 또는 무정형의 분말이며 high resolution electrospray ionization(ESI) mass spectnim에서 분자식이 C16H14O4(MW 270.28)임을 확인하였다.
- Compound Ⅱ의 구조분석 - 황색 무정형의 분말이며 high resolution electrospray ionization(ESI) mass spectrum에서 분자식이 C12H8O5(MW 232.19)임을 확인하였다.
- Compound Ⅲ의 구조분석 - 횐색 무정형의 분말이며 high resolution electrospray ionization(ESI) mass spectrum 에서 분자식이 CnH6O4(MW 202.16)임을 확인하였다.
- 각각의 1g의imperatorin 및 cnidilin에 3배의 N, N- diethyanilin을 첨가하고 220℃에서 1시간 반응시킨 결과 imperatorin으로부터 670 mg의 prangenidin과 26 mg의 xanthotoxol을 얻었고, cnidilin으로부터 510 mg의 8- hydroxybergapten과 42 mg의 xanthotoxol을 얻었다.
- 본 연구에서는 human fibroblast를 이용하여 콜라겐 생합성 증가를 확인할 수 있는 procollagen type I C-peptide (PICP) enzyme immunoassay를 이용하여 주름 개선에 효능이 있다고 언급된 120종의 생약을 대상으로 효능을 검색하였고, 이 중 백지 추출물이 우수한 활성을 나태냄을 알 수 있었다. 백지는 미나리과(Umbelliferae)의 구릿대(Angelica dahurica)의 뿌리를 약재로 사용하며, 한방에서 감기, 두통, 치통등에 사용하며 특히 하혈, 통경과 같은 부인과 질환에 사용되는 약재로써 20여종의 coumarin성분들이 알려져 있다.
- 본 연구의 유효성분 3종은 HPLC를 통한 정 량분석 결과 백지 내 함량이 0.001% 이하로 함유되어 있어 상업화가 힘든 것으로 확인되었다. 이에 이들 유효성분의 확보를 위한 유효성분의 상업화 연구를 수행하였다.
- 3 mM ascorbic acid와 비슷한 정도로 콜라겐 합성촉진 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이들 3종compound의 human fibroblast에 대한 procollagen type I C-peptide (PICP) enzyme immunoassay에 의한 콜라겐 생합성 촉진효능은 비타민 C의 20배, 기존에 콜라겐 합성능이 알려진 retinoic acid의 40배 이상의 우수한 효능을 보였다(Table 2).분리된 화합물들이 어떠한 메커니즘에 의하여 콜라겐 합성을 촉진시키는 지에 대해서는 향후 지속적인 연구를 통한 규명작업이 필요하다고 사료된다.
- 이상의 실험결과를 종합해 보면 콜라겐 생합성 유효성분5-benzofuranacrylie acid, 6, 7-dihydroxy-4-(3-methyl-2- butenyl)-8-lactone(prangenidin), 5-benzofuranacrylic acid, 6, 7-dihydroxy-4-methoxy-5-lactone (8-hydroxybergapten) and 5-benzofuranacrylie acid, 8-hydroxypsoralen(xantho- toxol) 3종을 백지 major coumarin 성분인 imperatorin, cnidilin을 claisen rearrangement 반응을 통해 제조하였으며 수율은 약재에 대해 0.25%로 비교적 높았다.
- 콜라겐합성촉진 효과(Procollagen type I C-peptide enzyme immunoassay) - Compound I, n, HI의 농도가 각각 0.5 (ig/ml, 1 |4, g/ml, 2 에서 positive control로 용 된 0.3 mM ascorbic acid와 비슷한 정도로 콜라겐 합성촉진 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이들 3종compound의 human fibroblast에 대한 procollagen type I C-peptide (PICP) enzyme immunoassay에 의한 콜라겐 생합성 촉진효능은 비타민 C의 20배, 기존에 콜라겐 합성능이 알려진 retinoic acid의 40배 이상의 우수한 효능을 보였다(Table 2).
- 피부의 주름개선제를 개발하고자 한방에서 피부미용에 사용한 것으로 알려진 120종의 약재들을 대상으로 콜라겐 합성 증가를 확인할 수 있는 procollagen type I C-peptide (PICP) enzyme immunoassay를 human fibroblast에 대해 실험한 결과, 백지 추출물이 콜라겐 합능 효과가 우수함을 알 수 있었으며, 이로부터 5-benzofuranacrylie acid, 6, 7- dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-8~lactone(prangenidin), 5- benzofuranacrylic acid, 6, 7-dihydroxy-4-methoxy-8-lactone (8-hydroxybergapten) and 5-benzofuranacrylic acid, 8- hydroxypsoralen(xanthotoxol)이 콜라겐 생성 효능을 나타냄을 확인하였다. 또한 이들 유효성분을 백지로부터 높은 수율로 확보할 수 있는 반응 조건 및 정제방법을 선정하여 백지 약재로부터 0, 25%의 수율로 제조할 수 있는 제조법을 선정하였다.
후속연구
- 이들 3종compound의 human fibroblast에 대한 procollagen type I C-peptide (PICP) enzyme immunoassay에 의한 콜라겐 생합성 촉진효능은 비타민 C의 20배, 기존에 콜라겐 합성능이 알려진 retinoic acid의 40배 이상의 우수한 효능을 보였다(Table 2).분리된 화합물들이 어떠한 메커니즘에 의하여 콜라겐 합성을 촉진시키는 지에 대해서는 향후 지속적인 연구를 통한 규명작업이 필요하다고 사료된다.
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