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문제 정의
- 즉, 콜라겐 및 콜라겐 가수분해물들이 손상된 피부 주변으로 섬유아세포들을 더 잘 끌어들이고 복구가 가능하도록 활성화 할 수 있다는 것으로서, 이는 본래 피부 손상으로 생긴 콜라겐 분해물들에 대한 피드백 작용으로 생각된다. 따라서, 콜라겐 펩타이드 혼합물이 피부 섬유아세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 섬유아세포주를 이용하여 procollagen의 발현에 미치는 영향을 평가하였다.
- 본 연구에서는 N-말단에 글라이신(Gly)을 갖는 트리펩타이드(Gly-X-Y) 함량이 높은 콜라겐 펩타이드 가수분해물(Jellice Co., Japan)을 이용하여 경구 섭취에 따른 피부 효능을 주름 정도, 탄력성, 수분량으로 평가하고, 엘라스틴 단백질과의 시너지 효능을 검증하여 자사의 신규한 혼합물인 AP-CPM01을 발견하고자 연구하였다(13,14). 이를 위하여 UV 스트레스를 이용하여 피부 손상을 유발한 동물 모델에서 콜라겐 펩타이드 혼합물의 경구 섭취에 의한 피부 보호 작용을 평가하였으며, 사람 섬유아세포(human fibroblast)를 이용하여 콜라겐 펩타이드 혼합물이 피부 조절인자에 미치는 영향을 탐색하여 보호 작용 기전을 규명함으로써 새로운 미용 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- NC군(normal control), UC군(UV control), UV/M군(UV 조사 및 AP-CPM01 333 mg/kg 투여) 등 3 개군으로 나누어 실험하였다(Table 1). NC군과 UC군은 일반 사료를 급여하고, 콜라겐 펩타이드 혼합물 처리군은 일반 사료에 혼합물의 농도가 0.
- NC군(normal control), UC군(UV control), UV/M군(UV 조사 및 AP-CPM01 333 mg/kg 투여) 등 3 개군으로 나누어 실험하였다(Table 1). NC군과 UC군은 일반 사료를 급여하고, 콜라겐 펩타이드 혼합물 처리군은 일반 사료에 혼합물의 농도가 0.33%(w/w) 되도록 배합한 고형 배합 사료(Feedlab Korea, Seoul, Korea)를 자유 급여하여 사육하였다.
- 광노화에 의한 주름을 유발하기 위해서 NC군을 제외한 UC군과 실험군에 매주 주 3회 동일한 시간(10:30-12:00)에 UV를 조사하였다. UV조사를 위해 태양광과 유사하게 UV를 방출하는 UVB 광원(Waldmann UV800, Germany) 10개를 부착하여 사용하였다.
- 주름개선 효과의 판정을 위해 실험 종료 후 피부를 육안 관찰하고 피부 주형을 채취하였다. 군별로 hairless mice의 등쪽을 디지털 카메라(Model C-700, Olympus, Japan)를 이용해 근접 촬영하고, 실리콘 폴리머(Silflo impression material, Flexico, England)를 이용하여 피부 주형(replica)을 채취하였다. 채취한 피부 주형은 빛의 입사각을 20도로 고정한 후, 주름 그림자 명암 영상을 CCD 카메라(Model SDC-45, Samsung, Seoul, Korea)로 찍어 이미지 파일화를 하고 컴퓨터 영상분석 시스템인 Skin Visiometer SV600 software(Courage&Khazaka, Köln, Germany)를 이용하여 R1-R5의 값을 측정하였다.
- 1, 1, 10 mg/L 농도의 엘라스틴 단백질 시료를 단독 혹은 병행 처리하여 CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 대조군은 상기와 동일한 배지에서 시험 물질을 첨가하지 않은 상태로 배양한 것을 이용하였다.
- 생후 8주령 된 25-30 g 정도의 SPF(specific pathogen free) 암컷 hairless mouse(Skh:HR-a)를 Charles River Laboratories(Wilmington, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 동물 입수 후 검역과 일주일간의 순화 기간을 거치도록 하였으며, 시험 실시 하루 전 각각 8마리 씩 3그룹으로 군 분리를 시행하였다. 군 분리 실시 후 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 Minitab을 이용해 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다.
- (Hiroshima, Japan)에서 공급받아 사용하였다. 사용량은 시중에 판매되는 콜라겐 펩타이드의 1일 섭취량(2,000 mg/60 kg/day)을 기준으로 하여 설정하였으며, 새로운 조성 혼합물인 AP-CPM01은 콜라겐 펩타이드 및 엘라스틴 펩타이드의 비율을 500:1로 구성하여 임상사용 예정량의 10배 농도에서 효능을 평가하고자 하였다.
- 세포를 48 well-plate에 1×105개로 분주하고 약 60%의 confluency에 도달할 때까지 1일간 배양하고, FBS-free 배지에서 1일간 추가 배양하였다.
- 세포를 48 well-plate에 1×105개로 분주하고 약 60%의 confluency에 도달할 때까지 1일간 배양하고, FBS-free 배지에서 1일간 추가 배양하였다. 시료 처리 전에 배지를 제거한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 1, 10, 50 mg/L 농도의 콜라겐 펩타이드 시료와 0.1, 1, 10 mg/L 농도의 엘라스틴 단백질 시료를 단독 혹은 병행 처리하여 CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 대조군은 상기와 동일한 배지에서 시험 물질을 첨가하지 않은 상태로 배양한 것을 이용하였다.
- 지속적인 UVB의 조사는 피부 두께의 증가를 가져온다. 시험 물질 섭취에 의해 피부두께 변화가 감소하는지를 확인하기 위해 마이크로미터(Absolute, Mitutoyo, Japan)을 이용하여 피부를 겹쳐서 잡고 그 두께(viable folding skin thickness)를 측정하였다.
- 실험 동물의 사육 환경은 온도(23±2℃), 습도(55±10%), 그리고 12시간 light/dark cycle을 유지하도록 하였다.
- , Japan)을 이용하여 경구 섭취에 따른 피부 효능을 주름 정도, 탄력성, 수분량으로 평가하고, 엘라스틴 단백질과의 시너지 효능을 검증하여 자사의 신규한 혼합물인 AP-CPM01을 발견하고자 연구하였다(13,14). 이를 위하여 UV 스트레스를 이용하여 피부 손상을 유발한 동물 모델에서 콜라겐 펩타이드 혼합물의 경구 섭취에 의한 피부 보호 작용을 평가하였으며, 사람 섬유아세포(human fibroblast)를 이용하여 콜라겐 펩타이드 혼합물이 피부 조절인자에 미치는 영향을 탐색하여 보호 작용 기전을 규명함으로써 새로운 미용 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
- 첫째 주는 1 MED(minimal erythemal dose, 약 55-60 mJ/cm2)를, 둘째 주는 2 MED, 셋째 주는 3 MED, 넷째 주부터 실험 종료 시까지 4 MED를 조사하였다. 자외선의 조사는 hairless mice의 등에서부터 60 cm 되는 거리에 설치하였으며, 정확한 자외선량의 조사를 위하여 자외선 측정기(VLS-3W, VILBER LOURMAT, France)를 이용하여 광량을 측정하였다. 동물의 피부 채취 시 즉각적인 UV 손상에 의한 영향을 받지 않도록 피부 채취 3일 전부터는 UV 조사는 실시하지 않았다.
- 주름개선 효과의 판정을 위해 실험 종료 후 피부를 육안 관찰하고 피부 주형을 채취하였다. 군별로 hairless mice의 등쪽을 디지털 카메라(Model C-700, Olympus, Japan)를 이용해 근접 촬영하고, 실리콘 폴리머(Silflo impression material, Flexico, England)를 이용하여 피부 주형(replica)을 채취하였다.
- 채취한 피부 주형은 빛의 입사각을 20도로 고정한 후, 주름 그림자 명암 영상을 CCD 카메라(Model SDC-45, Samsung, Seoul, Korea)로 찍어 이미지 파일화를 하고 컴퓨터 영상분석 시스템인 Skin Visiometer SV600 software(Courage&Khazaka, Köln, Germany)를 이용하여 R1-R5의 값을 측정하였다.
- UV조사를 위해 태양광과 유사하게 UV를 방출하는 UVB 광원(Waldmann UV800, Germany) 10개를 부착하여 사용하였다. 첫째 주는 1 MED(minimal erythemal dose, 약 55-60 mJ/cm2)를, 둘째 주는 2 MED, 셋째 주는 3 MED, 넷째 주부터 실험 종료 시까지 4 MED를 조사하였다. 자외선의 조사는 hairless mice의 등에서부터 60 cm 되는 거리에 설치하였으며, 정확한 자외선량의 조사를 위하여 자외선 측정기(VLS-3W, VILBER LOURMAT, France)를 이용하여 광량을 측정하였다.
- 콜라겐 펩타이드가 사람 섬유아세포(normal human fibroblast, NHF)에 미치는 영향을 알아보기 위해서 procollagen의 발현을 ELISA로 분석하였고 그 결과를 Fig. 3A에 나타내었다. 또한 엘라스틴 펩타이드 병행 처리 시의 procollagen 발현의 상승 효과를 확인하여 그 결과를 Fig.
- 탄력개선 효과의 판정을 위해 Cutometer SEM575(C&K, Köln, Germany)를 이용하여 피부 탄력을 측정하였다.
- 탄력개선 효과의 판정을 위해 Cutometer SEM575(C&K, Köln, Germany)를 이용하여 피부 탄력을 측정하였다. 피부의 보습 능력을 판정하기 위해 등 부위 피부에서 MoistureMeter(Delfin Technologies Ltd., Kuopio, Finland)를 이용하여 피부 수분함량을 측정하였다. 측정 환경 조건은 상대 습도 60±5%, 온도 25.
대상 데이터
- (Sendai, Japan) 및 Maruzen Pharmaceutical Co.(Hiroshima, Japan)에서 공급받아 사용하였다. 사용량은 시중에 판매되는 콜라겐 펩타이드의 1일 섭취량(2,000 mg/60 kg/day)을 기준으로 하여 설정하였으며, 새로운 조성 혼합물인 AP-CPM01은 콜라겐 펩타이드 및 엘라스틴 펩타이드의 비율을 500:1로 구성하여 임상사용 예정량의 10배 농도에서 효능을 평가하고자 하였다.
- 광노화에 의한 주름을 유발하기 위해서 NC군을 제외한 UC군과 실험군에 매주 주 3회 동일한 시간(10:30-12:00)에 UV를 조사하였다. UV조사를 위해 태양광과 유사하게 UV를 방출하는 UVB 광원(Waldmann UV800, Germany) 10개를 부착하여 사용하였다. 첫째 주는 1 MED(minimal erythemal dose, 약 55-60 mJ/cm2)를, 둘째 주는 2 MED, 셋째 주는 3 MED, 넷째 주부터 실험 종료 시까지 4 MED를 조사하였다.
- 실험에 사용한 사람 섬유아세포(Human dermal fibroblast)는 한국세포주은행(CCD986sk, KCLB, Korea)으로부터 구입하여 사용하였다. 분양 받은 세포주는 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS; Hyclone, Texas, USA), 1% penicillin-streptomy cin(Sigma Co.)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였으며, 계대수 4-7 사이의 세포주를 실험에 사용하였다. 세포를 48 well-plate에 1×105개로 분주하고 약 60%의 confluency에 도달할 때까지 1일간 배양하고, FBS-free 배지에서 1일간 추가 배양하였다.
- 실험 동물의 사육 환경은 온도(23±2℃), 습도(55±10%), 그리고 12시간 light/dark cycle을 유지하도록 하였다. 사료는 마우스 전용사료(Purina, St. Louis, MO, USA)를 자유 급여하였으며, 음수는 자외선 소독한 상수도수를 자유 급여하였다. 실험동물 사육관리는 “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”를 기준으로 하였으며, 실험은 Amorepacific Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인 하에 진행되었다.
- 생후 8주령 된 25-30 g 정도의 SPF(specific pathogen free) 암컷 hairless mouse(Skh:HR-a)를 Charles River Laboratories(Wilmington, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 동물 입수 후 검역과 일주일간의 순화 기간을 거치도록 하였으며, 시험 실시 하루 전 각각 8마리 씩 3그룹으로 군 분리를 시행하였다.
- 실험에 사용한 사람 섬유아세포(Human dermal fibroblast)는 한국세포주은행(CCD986sk, KCLB, Korea)으로부터 구입하여 사용하였다. 분양 받은 세포주는 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS; Hyclone, Texas, USA), 1% penicillin-streptomy cin(Sigma Co.
데이터처리
- 주름 정도를 객관적으로 비교하기 위하여, 본 시험기간 종료 후 군별로 제작된 레플리카에 대해 image analyzer 분석을 실시하여, 주름 정도를 나타내는 지표 R1-R5들의 분석치를 통계 처리하였다(Fig. 2).
- In vivo 실험 결과에 대한 통계 분석은 MINITAB 14 Korea를 이용하여 one-way ANOVA를 실시하고, Student t-test를 이용하여 UC군과 UV/M군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다. In vitro 실험의 통계 분석은 SPSS(statistical package social science, version 12.0, SPSS Inc, Chicago, USA)를 이용하여 one-way ANOVA와 LSD test에 의해 검정하였다. 모든 결과는 각 실험군의 평균±표준오차로 표시하였으며, 각 군의 유의성은 p<0.
- In vivo 실험 결과에 대한 통계 분석은 MINITAB 14 Korea를 이용하여 one-way ANOVA를 실시하고, Student t-test를 이용하여 UC군과 UV/M군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다. In vitro 실험의 통계 분석은 SPSS(statistical package social science, version 12.
- Procollagen의 발현을 평가하기 위하여 상기의 배양 방법으로 배양하여 얻은 배양액을 ELISA(Takara, Shiga, Japan) kit를 이용하여 정량분석 하였다. 세부적인 분석 방법은 공급사에서 제공되는 방법에 준하여 시행하였다.
- 동물 입수 후 검역과 일주일간의 순화 기간을 거치도록 하였으며, 시험 실시 하루 전 각각 8마리 씩 3그룹으로 군 분리를 시행하였다. 군 분리 실시 후 각 군의 평균체중에 대한 군간 차이는 Minitab을 이용해 ANOVA 검정으로 통계학적 검증을 실시하여 확인하였다. 실험 동물의 사육 환경은 온도(23±2℃), 습도(55±10%), 그리고 12시간 light/dark cycle을 유지하도록 하였다.
- 모든 결과는 각 실험군의 평균±표준오차로 표시하였으며, 각 군의 유의성은 p<0.05 수준으로 검정하였다.
이론/모형
- Procollagen의 발현을 평가하기 위하여 상기의 배양 방법으로 배양하여 얻은 배양액을 ELISA(Takara, Shiga, Japan) kit를 이용하여 정량분석 하였다. 세부적인 분석 방법은 공급사에서 제공되는 방법에 준하여 시행하였다.
성능/효과
- In vivo에서 10주간의 UV처리에 의해 유발되는 피부 손상에 대한 콜라겐 펩타이드 혼합물(AP-CPM01)의 보호 효능을 관찰한 결과, UV에 의해 유도되는 주름의 증가와 탄력 저하 및 비정상적인 각질 세포의 증식에 의한 피부 두께의 증가가 혼합물의 섭취에 의해 개선됨을 확인하여, 콜라겐 펩타이드 혼합물이 UV에 의한 피부 손상을 방어하고, 피부 기능이 정상적으로 작용할 수 있도록 도움을 주는 것을 알 수 있었다. 콜라겐 펩타이드 혼합물의 피부 보호 작용 기전을 살펴보기 위하여 사람 섬유아세포를 이용하여 콜라겐 펩타이드 혼합물의 작용을 평가한 결과, 콜라겐 펩타이드와 엘라스틴 단백질은 procollagen 발현을 농도 의존적으로 증가시키고 시너지 효과가 있음을 확인하였으며, 이를 통하여 콜라겐 펩타이드 혼합물이 광노화에 의해 유발되는 피부 진피층의 손상을 회복 혹은 보호하는 효능이 있음을 알 수 있었다.
- NC군을 포함한 모든 시험군에서 시험기간 동안 사망한 동물은 관찰되지 않았으며, 전 동물에서 실험 물질로 인한 특이한 임상증상은 관찰되지 않았다. 투여 전 각 동물은 군별로 26.
- UV 조사 기간 중 육안으로 관찰 시, NC군에 비해 UC군의 피부 주름 증가가 뚜렷하였으며, 실험물질 투여군은 UC군에 비해 주름 증가가 적고 피부주름 상태가 양호함을 확인하였다(Fig. 1). 주름 정도를 객관적으로 비교하기 위하여, 본 시험기간 종료 후 군별로 제작된 레플리카에 대해 image analyzer 분석을 실시하여, 주름 정도를 나타내는 지표 R1-R5들의 분석치를 통계 처리하였다(Fig.
- UV/M군은 UC군에 비해 전체적으로 주름지표가 유의적으로 감소함을 관찰할 수 있었다(p<0.05).
- 5℃ 이었다. 각 개체별 측정 부위는 동일한 곳으로 하였으며, 측정면은 항상 평행하게 하고, 탐침의 측정면에 대한 압력은 일정하게 유지하였다. 지속적인 UVB의 조사는 피부 두께의 증가를 가져온다.
- 따라서, 소량의 엘라스틴 펩타이드가 함유된 콜라겐 펩타이드 혼합물을 장기간 경구 섭취할 경우, 진피층 섬유아세포에서 프로콜라겐의 합성이 유의적으로 증가하여, UV에 의해 발생된 진피층의 구조 손상에 따른 주름 발생과 탄력 저하를 완화시키고, 피부의 수분 함유 능력 증강, 피부 건조의 방지 등의 피부 보호 효능을 가질 수 있음을 의미한다. 또한, 진피층 그물망 구조 개선에 대해서는 콜라겐 생성 및 엘라스틴 단백질 이외에도 다양한 영향 인자가 존재하므로, 이에 대한 세부적인 메커니즘에 대해서는 앞으로도 추가적인 연구가 요구된다(19,20).
- 05). 또한, 피부의 탄력성 측정에 있어서도 UV/M군은 UC군에 비해 탄력성이 유의적으로 높은 것을 관찰할 수 있었으며, 피부 보습력 측정결과 UC군에 비해 NC군과 UV/M군은 모두 유의적으로 수분 함유량이 높게 관찰되어 UV군에 의해 보습력이 떨어지지 않음을 알 수 있었다 (Tables 2,3). 이로부터 콜라겐 펩타이드 혼합물의 경구 섭취가 자외선에 의해 유발되는 피부 수분 손실 및 피부 손상을 방지 혹은 개선하여, 피부 고유의 주름, 탄력 및 보습 능력을 향상시켜 피부가 정상적으로 작용하도록 도와줄 수 있다고 판단할 수 있다.
- 5배 정도 procollagen의 발현량을 증가시킴을 확인하였다. 엘라스틴 펩타이드를 병행처리 했을 경우, 콜라겐 펩타이드 50 mg/L 처리와 함께 엘라스틴 펩타이드 0.1 mg/L 이상 처리하면 procollagen 발현량이 약 15% 정도 증가되었으나, 이 양은 10 mg/L 처리시에도 크게 증가되지는 않음을 관찰할 수 있었다(Fig. 3B). 이와 같은 in vitro 실험을 통하여 콜라겐 펩타이드 혼합물의 최적 조성(500:1, AP-CPM01)을 결정할 수 있었고, 주된 효능 기전을 확인할 수 있었다.
- 3A에서 알 수 있는 바와 같이, 콜라겐 펩타이드를 1, 10, 50 mg/L 농도로 처리했을 때 농도 의존적으로 procollagen의 발현량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 콜라겐 펩타이드는 1-50 mg/L의 농도로 처리하였을 때에 유의적인 효능을 나타내며 50 mg/L의 처리 농도에서는 음성대조군인 무처리군과 비교하였을 때 약 1.5배 정도 procollagen의 발현량을 증가시킴을 확인하였다. 엘라스틴 펩타이드를 병행처리 했을 경우, 콜라겐 펩타이드 50 mg/L 처리와 함께 엘라스틴 펩타이드 0.
- 콜라겐 펩타이드 혼합물의 피부 보호 작용 기전을 살펴보기 위하여 사람 섬유아세포를 이용하여 콜라겐 펩타이드 혼합물의 작용을 평가한 결과, 콜라겐 펩타이드와 엘라스틴 단백질은 procollagen 발현을 농도 의존적으로 증가시키고 시너지 효과가 있음을 확인하였으며, 이를 통하여 콜라겐 펩타이드 혼합물이 광노화에 의해 유발되는 피부 진피층의 손상을 회복 혹은 보호하는 효능이 있음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 콜라겐 펩타이드 혼합물(AP-CPM01)이 광노화 보호 또는 피부 개선 효능을 갖는 새로운 미용 식품 소재로써 이용 가능성이 높음을 알 수 있다.
- 3B). 이와 같은 in vitro 실험을 통하여 콜라겐 펩타이드 혼합물의 최적 조성(500:1, AP-CPM01)을 결정할 수 있었고, 주된 효능 기전을 확인할 수 있었다.
- In vivo에서 10주간의 UV처리에 의해 유발되는 피부 손상에 대한 콜라겐 펩타이드 혼합물(AP-CPM01)의 보호 효능을 관찰한 결과, UV에 의해 유도되는 주름의 증가와 탄력 저하 및 비정상적인 각질 세포의 증식에 의한 피부 두께의 증가가 혼합물의 섭취에 의해 개선됨을 확인하여, 콜라겐 펩타이드 혼합물이 UV에 의한 피부 손상을 방어하고, 피부 기능이 정상적으로 작용할 수 있도록 도움을 주는 것을 알 수 있었다. 콜라겐 펩타이드 혼합물의 피부 보호 작용 기전을 살펴보기 위하여 사람 섬유아세포를 이용하여 콜라겐 펩타이드 혼합물의 작용을 평가한 결과, 콜라겐 펩타이드와 엘라스틴 단백질은 procollagen 발현을 농도 의존적으로 증가시키고 시너지 효과가 있음을 확인하였으며, 이를 통하여 콜라겐 펩타이드 혼합물이 광노화에 의해 유발되는 피부 진피층의 손상을 회복 혹은 보호하는 효능이 있음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 콜라겐 펩타이드 혼합물(AP-CPM01)이 광노화 보호 또는 피부 개선 효능을 갖는 새로운 미용 식품 소재로써 이용 가능성이 높음을 알 수 있다.
- 투여 전 각 동물은 군별로 26.19±1.84-27.27±2.26 g으로 고른 체중범위를 나타내었으며, 투여 기간 중 모든 실험군에서 체중 증가를 나타내었다.
후속연구
- 따라서, 소량의 엘라스틴 펩타이드가 함유된 콜라겐 펩타이드 혼합물을 장기간 경구 섭취할 경우, 진피층 섬유아세포에서 프로콜라겐의 합성이 유의적으로 증가하여, UV에 의해 발생된 진피층의 구조 손상에 따른 주름 발생과 탄력 저하를 완화시키고, 피부의 수분 함유 능력 증강, 피부 건조의 방지 등의 피부 보호 효능을 가질 수 있음을 의미한다. 또한, 진피층 그물망 구조 개선에 대해서는 콜라겐 생성 및 엘라스틴 단백질 이외에도 다양한 영향 인자가 존재하므로, 이에 대한 세부적인 메커니즘에 대해서는 앞으로도 추가적인 연구가 요구된다(19,20).
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