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문제 정의
- 본 연구에서는 한국에 분포하는 옻나무속을 대상으로 속 내의 계통유연관계를 정확히 파악하기 위하여 현재 널리 이용되고 있는 nrDNA의 ITS 구간과 cpDNA의 rbcL 염기서열을 이용하여 한국산 옻나무속의 종들 사이의 계통 유연관계를 밝히 고, 차후 옻나무속을 신속히 분류할 수 있는 marker의 탐색을 연구목적으로 하였다.
- 본 연구는 경기도 가평군과 가평축협의 옻을 활용한 기능성 축산물 생산사업 연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사를 표하며, 익명의 심사위원 두 분에게도 감사한다.
제안 방법
- 수행하였다. DNA 농도는 EtBr (ethidium bromide) 들어있는 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 lamda DNA의 강도를 상대 비교하여 농도를 확인하였다. DNA는 25 ng으로 정량하여 사용하였다.
- (1977) 에 의 충H 고안된 방법에 의해 결정하였다. 이중가닥 PCR product를 PCR Purification Kit (QIAGEN)로 정제하였다. Cycle sequencing 반응은 BuDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems) 를 사용하여 수행하였다.
- , 1997)을 이용하여 염기서열을 정렬하였다. ITS1, 5.8S, ITS2 구간 및 rbcL 구간의 염기서열은 이전 연구자들에 의해 연구된 염기서열과 비교하여 결정하였다 (Yokota et al., 1989; Baldwin, 1995; Kass & Wink, 1996; Hoot, 1995). 염기서 열간의 divergence 계산은 Kimura two parameter 방법을 이용하였다 (Kimura, 1980).
- 계통학적 분석은 조사된 모든 종에서 염기서열의 5.8S부분을 제외하고 ITS 1과 ITS 2 구간의 염기서열만을 사용하여 수행하였다. 본 연구에서 Cotinus coggygria를 외군으로 사용하여 얻은 PAUP 분석결과, tree length는 183 step이 었고, consistency index (CD 는 0.
대상 데이터
- 대상 분류군은 국내에 자생하는 종을 대상으로 분류군을 한정하였다. 계통분석을 위한 외군 (outgroup)으로는 옻 나무속에 가장 근연식물인 안개나무 (Cotinus coggygria) 를 사용하였다.
- 계통분석을 위한 외군 (outgroup)으로는 옻 나무속에 가장 근연식물인 안개나무 (Cotinus coggygria) 를 사용하였다. 옻나무 (R verniciflua) 종은 지역적 변이 여부를 확인하기 위하여 3개 지역에서 채집하였다.
- 계통분석을 위한 외군 (outgroup)으로는 옻 나무속에 가장 근연식물인 안개나무 (Cotinus coggygria) 를 사용하였다. 옻나무 (R verniciflua) 종은 지역적 변이 여부를 확인하기 위하여 3개 지역에서 채집하였다. 실험에 사용된 분류군은 Table 1에 나타내었다.
데이터처리
- Sequencing 후 얻어진 DNA 염기서열은 Sequencher (version 4.1; Gene Codes, Ann Arbor, Michigan, USA)를 사용하여 일치되는 sequence를 전부 모은 후, CLUSTAL X program (Thompson et al., 1997)을 이용하여 염기서열을 정렬하였다. ITS1, 5.
이론/모형
- 5 mM dNTP 4 µℓ, 5 µM primer 2 µℓ 를 혼합하여 전체 부피가 48 µℓ가 되도록 증류수를 채웠다. PCR primer는 ITS 염기서열을 증폭시키는데 White et al. (1990)에 의하여 고안된 ITS1과 ITS4를 이용하였고,ITS에서는 rbcL N과 rbcL R을 이용하였다. 증폭은 Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, USA) 으로 수행하였다.
- Sequencinge Sanger et al. (1977) 에 의 충H 고안된 방법에 의해 결정하였다. 이중가닥 PCR product를 PCR Purification Kit (QIAGEN)로 정제하였다.
- 이중가닥 PCR product를 PCR Purification Kit (QIAGEN)로 정제하였다. Cycle sequencing 반응은 BuDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems) 를 사용하여 수행하였다. Automated sequencinge ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (PE Applied BiosystemsX 사용하였다.
- , 1989; Baldwin, 1995; Kass & Wink, 1996; Hoot, 1995). 염기서 열간의 divergence 계산은 Kimura two parameter 방법을 이용하였다 (Kimura, 1980). 계통학적 분석은 PAUP을 사용하여 수행하였고, gape 분석에서 제외하였다 (Swofford, 1998).
- 염기서 열간의 divergence 계산은 Kimura two parameter 방법을 이용하였다 (Kimura, 1980). 계통학적 분석은 PAUP을 사용하여 수행하였고, gape 분석에서 제외하였다 (Swofford, 1998). 분석 조건은 Heuristic search, TBR swapping을 적용하여 수행하였고, bootstrap value는 100회 반복하여 얻었다 (Felsensin, 1985).
- 계통학적 분석은 PAUP을 사용하여 수행하였고, gape 분석에서 제외하였다 (Swofford, 1998). 분석 조건은 Heuristic search, TBR swapping을 적용하여 수행하였고, bootstrap value는 100회 반복하여 얻었다 (Felsensin, 1985).
- Total DNA의 주줄은 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 의 방법으로 수행하였다. DNA 농도는 EtBr (ethidium bromide) 들어있는 1.
성능/효과
- 46%로 나타나 두 구간이 비슷한 비율을 보이고 있었다. ITS 1에서의 G+C content는 R. sylvestris가 58.0%로 가장 낮았으며, 가장 높은 값은 R. ambigua가 68.13%로 확인되었다. ITS 2에서는 외군인 Cotinus coggygriaA 59.
- 46%로 가장 높게 나타났다. 한국산 옻 나무속에서 ITS 염기서열은 일반적으로 피자식물이 갖는 G+C content 범위 안에 포함되는 것으로 확인되었다. 한편, rbcL의 길이는 1, 428 bp로 모든 종에서 동일하였다.
- 증폭은 Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, USA) 으로 수행하였다. ITS 증폭에서 PCRe 95℃ 에서 3분 동안 predenaturation 시킨 후, 95℃ 에서 30초의 denaturation, 48℃에서 30초의 annealing, 72℃에서 1분의 extension 으로 이루어지는 thermal cycle을 35회 반복하였으며, 72℃ 에서 10분간 final extension 과정을 거쳐 PCR을 완료하였고, rbcL 에서는 94℃ 에서 3분 동안 pre-denaturation 시킨 후, 94℃에서 1분 denaturation, 48℃에서 1분 annealing, 72℃ 에서 2분의 extension으로 이루어지는 thermal cycle을 30회 반복하였으며, 72℃에서 10분간 final extension 과정 후 PCR 증폭을 완료하였다.
- 국내에서 자생하는 옻나무 종을 대상으로 ITS 및 rbcL 유전자를 이용하여 분석한 결과, ITS 1과 ITS 2 구간 및 rbcL 구간의 염기서열이 확인되었다 (Table 4). 전체 2속 7종 9 개체의 ITS 1의 길이는 246~253 bp이고, ITS 2는 234-244 bp 범위로 나타났다.
- 구간의 염기서열이 확인되었다 (Table 4). 전체 2속 7종 9 개체의 ITS 1의 길이는 246~253 bp이고, ITS 2는 234-244 bp 범위로 나타났다. ITS 1의 길이는 Rhus syivestris와 R.
- 전체 2속 7종 9 개체의 ITS 1의 길이는 246~253 bp이고, ITS 2는 234-244 bp 범위로 나타났다. ITS 1의 길이는 Rhus syivestris와 R. succedanea에서 246 bp로 가장 작았으며, R. vernicua에서 253 bp로 가장 긴 것으로 나타났다. ITS 2의 길이는 R.
- vernicua에서 253 bp로 가장 긴 것으로 나타났다. ITS 2의 길이는 R. vernicua가 234 bp로 가장 짧았으며, R. trichocarpa가 244 bp로 가장 길게 나타났다.
- 46%로 나타나 두 구간이 비슷한 경향을 보였다. ITS 1에서의 G+C content는 R. sylvestrise 58.0%로 가장 낮았으며, 가장 높은 값은 R. ambiguae 68.13%로 확인되었다, ITS 2에서는 outgroup (외군)인 Cotinus coggygriae} 59.75%로 가장 낮았으며, R. ambiguaA 68.46%로 가장 높게 나타났다. R.
- 46%로 가장 높게 나타났다. R. ambigua는 ITS 1과 ITS 2 모두에서 G+C content가 가장 높은 것으로 나타났고, 옻나무속에서 ITS 염기서열은 일반적으로 피자식물이 갖는 G+C content 범위 안에 포함되는 것으로 확인되었다 (Table 4).
- 본 연구에서 조사된 ITS 염기서열의 nucleotide divergence는 0.2~15.5%로 최소값은 한 개의 염기 차이를 갖는 R. succedaneae]- R. sylvestris 사이 였으며 , 최대값은 R. sylvestris 와 R. javanica 사이로 염기 차이는 74 개인 것으로 밝혀졌다, 또한 outgroup인 Cotinus coggygria 와의 nucleotide divergencee 7.3~14.6%인 것으로 나타나 옻나무속내 nucleotide divergence 변화 폭에 포함되는 것으로 나타났다. ITS 염기서열 분석 결과, 옻나무속내에서 Continus속과 가장 가까운 종은 R.
- 6%인 것으로 나타나 옻나무속내 nucleotide divergence 변화 폭에 포함되는 것으로 나타났다. ITS 염기서열 분석 결과, 옻나무속내에서 Continus속과 가장 가까운 종은 R. javanica로 nucleotide divergence가 7.3% 이었고, 염기 차이는 35 bp 이었다. 가장 유연관계가 먼 종은 R.
- 3% 이었고, 염기 차이는 35 bp 이었다. 가장 유연관계가 먼 종은 R. sylvestris로 14.6% 이었으며, 염기는 70 bp의 차이가 있음이 밝혀졌다 (Table 5).
- (Table 4). 또한 rbcL의 G+C content는 43.56%~43.77%로 나타나 종간에 거의 차이가 없음을 나타냈고, nucleotide divergencee 0.1-1.0% 범위로 나타나 종간 염기서열의 차이가 거의 없었다 (Table 6). 최소값은 ITS 와 마찬가지로 R.
- 0% 범위로 나타나 종간 염기서열의 차이가 거의 없었다 (Table 6). 최소값은 ITS 와 마찬가지로 R. succedaneae- R. sylvestris 사이 였고, 염기의 차이도 한 개뿐이었다. 최대값은 14개의 염기 차이가 나는 R.
- sylvestris 사이 였고, 염기의 차이도 한 개뿐이었다. 최대값은 14개의 염기 차이가 나는 R. javanica와 R. ambigua의 1.0%로 확인되 었다. 외군인 Cotinus coggygria와는 0.
- 이러한 결과는 rbcL gene이 종 단위 이하의 계통유연관계를 해석하는 데는 유용하지 못하다는 기존의 결과와 일치하였다 (Olmstead & Reeves, 1995). 한편, ITS sequence variatione 15% 범위내로서 종간 계통 유연관계를 해석하는데 좋은 해상력을 제공하였다.
- 8S부분을 제외하고 ITS 1과 ITS 2 구간의 염기서열만을 사용하여 수행하였다. 본 연구에서 Cotinus coggygria를 외군으로 사용하여 얻은 PAUP 분석결과, tree length는 183 step이 었고, consistency index (CD 는 0.863이 었으며 , retention index (RD 는 0.848로 나타났다 (Fig. 1A). 먼저 계통수의 기부에서 R, javanicae outgroup과 같은 clade (분지군)에 위치하였고, 다른 종들의 sister group (자매군)이 되었다.
- sylvestris 군이 분지하여 이 두 종은 매우 근연인 것으로 나타났다. 마지막으로 R, trichocag와 R. vemiciflua가 분지 해 나왔다. 각기 다른 지방 (서우 횡성, 완도)에서 채집된 R.
- vemiciflua가 분지 해 나왔다. 각기 다른 지방 (서우 횡성, 완도)에서 채집된 R. verniciflua 는 지역적 차이에 의한 변이가 거의 없음을 확인할 수 있었다 (Fig. 1A, B & Tables 5, 6). Bootstrap 분석 결과, 50~100%의 bootstrap value/} 나타나 비교.
- 적 안정성이 있는 것으로 밝혀졌다. Rhus trichocarpa 와 R. ambigua R. verniciflua, R. succedanea 및 R. sylvestrise sister group임을 나타내는 clade에서의 bootstrap value 는 100%임을 나타내었다. 또한 R.
- sylvestrise sister group임을 나타내는 clade에서의 bootstrap value 는 100%임을 나타내었다. 또한 R. succedaneae R. sylvestris로 구성된 clade 역시 100%로 매우 강한 지지를 보여주어 상당히 근연종임을 나타내고 있다. (Fig.
- 계통수 분석 결과, 우리나라에 자생하는 종들 중 붉나무를 제외한 5개종이 단계통을 나타냈으며, 이것은 Miller et al. (2001)의 연구와 일치하는 결과를 보여주었다. Miller et al.
- 만일 Barkley (1937)의 기준에 따른다면, 우리나라에 분포하는 옻나무 속중에서 붉나무는 Rhus속으로, 그 외 옻나무, 개옻나무, 검양옻나무, 산검양옻나무, 덩굴옻나무는 Toxicodendron속으로 처리하여야 할 것이다. 본 연구에서 얻어진 계통수에서도 붉나무 (R. javanica)만을 제외하고 나머지 종들은 단계통을 구성하는 것으로 보아 Barkley의 분류기준을 지지하는 것으로 판단된다.
- 한국산 옻나무속 6종에 대하여 분자식물학적 방법으로 계통 유연관계를 확인하기 위하여, nrDNA의 ITS 구간과 cpDNA rbcL 염기서열을 사용하여 계통분석한 결과 ITS 1의 길이는 246-253 bp이었고, ITS 2는 234-244 bp이었다. ITS 1의 길이는 Rhus sylvestrise]- R.
- ITS 1의 길이는 Rhus sylvestrise]- R. succedanea 에서 246 bp로 가장 작았으며, R. vernicija에서 253 bp 로 가장 긴 것으로 나타났다. ITS 2의 길이는 R.
- vernicija에서 253 bp 로 가장 긴 것으로 나타났다. ITS 2의 길이는 R. verniciflua가 234 bp로 가장 짧았으며, R. trichocarpa가 244 bp로 가장 길게 나타났다. 이들 분류군의 G + C content는 ITS 1에서는 58.
- 13%로 확인되었다. ITS 2에서는 외군인 Cotinus coggygriaA 59.75%로 가장 낮았으며, R. ambigua가 68.46%로 가장 높게 나타났다. 한국산 옻 나무속에서 ITS 염기서열은 일반적으로 피자식물이 갖는 G+C content 범위 안에 포함되는 것으로 확인되었다.
- 한편, rbcL의 길이는 1, 428 bp로 모든 종에서 동일하였다. 또한 rbcL의 G+C content는 43.56%~43.77%로 나타나 종간에 거의 차이가 없음을 확인하였다. 연구결과 rbcL genee 옻나무속의 종간 계통유연관계를 해석하는데 유용하지 않았으며, ITS 1 구간의 염기서열 변이는 향후 옻 나무속을 분류할 때 신속하게 분류할 수 있는 분류 marker로 이용할 수 있다고 판단되었다.
- 77%로 나타나 종간에 거의 차이가 없음을 확인하였다. 연구결과 rbcL genee 옻나무속의 종간 계통유연관계를 해석하는데 유용하지 않았으며, ITS 1 구간의 염기서열 변이는 향후 옻 나무속을 분류할 때 신속하게 분류할 수 있는 분류 marker로 이용할 수 있다고 판단되었다.
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