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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에 도입되어 재배되거나 국내외에서 육성된 고추냉이 7품종과 울릉도에 자생하는 개체를 포함한 총 11개체를 대상으로 RAPD분석을 실시하여 품종 간 유연 관계를 밝히고 이 방법이 품종구별에 유용한지를 알아보고, 나아가서 는 우리나라 환경 에 맞는 품종육성을 위한 기초자료로 활용하게 하고자 한다.
제안 방법
- PCR 조건은 94℃에서 1 분, 35℃에서 1분, 72℃에서 2분을 하나의 cycle로 하여 45회 반복한 후 72℃에서 10분간 더 유지 시 켜 주었다. Primer는 Operon사의 random decamer 50종류를 사용하였으며 증폭된 DNA는 1.5% agarose gel에 전기영동한 후 UV하에서 Polaroid camera로 촬영하였다. 분자량 비교를 위한 marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다.
- 시마네재래 (SIM)는 영양번식용 품종으로 일본의 시마네현 (島根縣) 에서 주로 재배되던 종류이며 신미와 점도가 강하고 특히 단맛이 강한 품종으로 알려져 있으며, 시마네3호 (SIM3) 는 시마네재래 (SIM)와 반원 (半原)의 자연교배로 생긴실생고추냉이에서 선발 육성된 품종으로 영양번식 뿐만 아니라 실생번식용으로도 재배되는 품종으로 근경의 색깔이나 맛 등은 시마네재래 (SIM)와 비슷한 특징을 가지고 있으나 (이와 안, 1995) RAPD에 의한 유집결과는 두 품종이 각각 달마A (DMA) 와 달마 (DRU) 에 유집 되어 나타났다. 울릉도의 계곡 습지에 군락을 이루고 있는 국내 자생종은 1920년대에 일본인에 의해 시험재배 되었다가 해방과 더불어 재배가 중단 된 후 자연상태로 방치되어 현재의 군락을 이루고 있다고 인정되고 있는데, 본 연구에서 울릉도에 자생하는 개체와는 뚜렷하게 유집되는 품종 없이 사야토리 (SAY)와 히메니시키 (HIM)를 제외한 나머지 8개체들을 위한 자매군 (sister group) 을 형성하였다. 따라서 울릉도 개체는 국내에 재배되고 있는 근연 품종들과 형태적으로도 차이가 없고 RAPD에 의한 결과에서도 뚜렷하게 유집되는 품종이 없어 예전부터 재배되던 종류의 일부가 현재까지 남아있는 것으로 추측된다.
- 촬영 된 gel 사진을 근거 로 증폭된 밴드를 각각 하나의 운영분류단위 (OTU, operational taxonomic unit) 로 보아 data matrix를 작성하였다. 유연관계 분석을 위한 유사도 지수는 Nei & Li (1979)의 방법을 따랐으며, 유집분석은 NTSYS-pc (version 2.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 재료는 국내에 도입되거나 품종으로 육성되어 재배되고 있는 고추냉이 7품종 10개체 (Daruma 품종 4개체, Himenisiki, Hujidaruma, Sayatori, Simanesairai, Simane 3 go, Sawa 품종 각각 1 개체) 와울릉도에 자생하는 1개체 등 총 11개체를 대상으로 하였다 (Table 1).
- 5% agarose gel에 전기영동한 후 UV하에서 Polaroid camera로 촬영하였다. 분자량 비교를 위한 marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다.
이론/모형
- DNA 추출은 Doyle & Doyle ( 1987) 법을 따랐으며, 추줄한 DNA는 Beckman spectrophotometer로 정 량한 후 5 ng/ul로 희석하여 사용하였다. PCRe Williams et al.
- ng/ul로 희석하여 사용하였다. PCRe Williams et al. (1990)의 방법을 따랐으며 DNA 증폭은 DNA Thermal Cycler (Biometra, Whatman Co.)로 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 1 분, 35℃에서 1분, 72℃에서 2분을 하나의 cycle로 하여 45회 반복한 후 72℃에서 10분간 더 유지 시 켜 주었다.
- matrix를 작성하였다. 유연관계 분석을 위한 유사도 지수는 Nei & Li (1979)의 방법을 따랐으며, 유집분석은 NTSYS-pc (version 2.02j, Applied Biostatistics, Setauket, New York, USA)를 이용하였고, 비가중산술법 (UPGMA, unweighted pair-group method using arithmatic average) 으로 유집 하였다.
성능/효과
- 고추냉이의 유연관계 분석을 위해서 Operon사의random primer (10-mer) 50종류를 이용한 스크린 결과 30종류에서 DNA 증폭 반응을 보였으며, 이 중 21 primer 만이 조사된 11개체 전체에서 증폭되었다 (Table 2).
- 83이하에서 유집되어 유연관계가 가장 멀게 나타났으며 , 사와 (SAW) 품종은 시 마네재 래 (SIM) 와 달마 (DRU) 와 함께 유집되어 나타났다. 국내에서 선발된 달마 계통의 재배종들은 서로 유집되지 않고 오히려 다른 품종들과 유집되는 경향을 보였으며 일본에서 재배되는 후지 달마 (HUJ) 역시 달마 품종의 4개체, 시마네 재 래 (SIM), 시마네3호 (SIM3), 사와 (SAW) 품종들을 위한 자매 군으로 유집되었다. 달마 계통들은 일본에서 약 40여년간 재배된 대표적인 고추냉이로 1967년경부터는 급속히 퇴화되어 현재에는 원종에 가까운 계통들도 거의 없어진 종류로 현재에는 일부 품종의 계통으로 추측되는 개체들이 많이 알려져 있는데 (이와 안, 1995) 본 연구에서 사용한 4개체들도 품종내 유연관계가 명확하지 않았다.
- 유사도값을 이용한 phenogram 작성 결과 본연구에서 사용한 고추냉이 11종류는 단계통군 (monophyly)으로 나타났다. 달마 (DRU) 와 시마네재래 (SIM) 는 조사된 11분류군 중 유사도 0.96에서 유집되어 유연관계 가 가장 높게 나타났다. 일본에서 재배되고 있는 사야토리 (SAY)와 히메니시키 (HIM)는 다른 9개체와는 유사도 0.
- 울릉도의 계곡 습지에 군락을 이루고 있는 국내 자생종은 1920년대에 일본인에 의해 시험재배 되었다가 해방과 더불어 재배가 중단 된 후 자연상태로 방치되어 현재의 군락을 이루고 있다고 인정되고 있는데, 본 연구에서 울릉도에 자생하는 개체와는 뚜렷하게 유집되는 품종 없이 사야토리 (SAY)와 히메니시키 (HIM)를 제외한 나머지 8개체들을 위한 자매군 (sister group) 을 형성하였다. 따라서 울릉도 개체는 국내에 재배되고 있는 근연 품종들과 형태적으로도 차이가 없고 RAPD에 의한 결과에서도 뚜렷하게 유집되는 품종이 없어 예전부터 재배되던 종류의 일부가 현재까지 남아있는 것으로 추측된다.
- 일반적으로 고추냉이는 잡종 성이 강하여 채종한 후 실생묘를 육성하면 여러가지 형질이 다른 변이체가 나타나므로 교잡종의 우량한 성질을 유지할 수 없는 것으로 알려져 있는데 (Nakamura & Sathiyamoorthy, 1990), 본 연구에 사용된 재료 역시 재배 기간 동안 많은 교잡과정이 있었던 것으로 추측된다. 또한 형태적으로는 근경이나 잎의 특징에 의해 품종간 구별이 명확하나 DNA분석에 의해서는 뚜렷한 경향을 찾을 수가 없어 RAPD법은 고추냉이의 품종 유연관계분석을 위한 방법으로 유용하지 않은 것으로 나타났다. 따라서 보다 정확한 품종별 계통유연관계 분석을 위해서는 AFLP분석이나진화속도가 빠르고 계통분석에 용이한 유전자로 알려져있는 핵DNA의 ITS region이나 엽록체 DNA의 ndhF, matK coding gene의 sequence를 비교하는 등 보다 정밀한 분자 계통학적 연구가 수행되어져야 할 것으로 판단된다.
- 분류군 전체에서 반응이 일어난 21 종류의 primer로부터 총 144개의 밴드가 관찰되었으며, 이 중 다형화 (polymorphism)를 보이는 밴드는 68개 (47.2%)로 primer당 평균 3.2개의 다형화 밴드를 보이는 것으로 나타났으며, 나머지 76개 (52.8%)는 동일한 밴드패턴을 보였다. Primer별 밴드 수는 2개 (OPA-16과 OPD-15) 에서 13개 (OPC-20과 OPD-03)로 다양하였으며 평균 밴드의 수는 6.
- 96의 범위로 높은 유연관계를 보였다. 유사도값을 이용한 phenogram 작성 결과 본연구에서 사용한 고추냉이 11종류는 단계통군 (monophyly)으로 나타났다. 달마 (DRU) 와 시마네재래 (SIM) 는 조사된 11분류군 중 유사도 0.
- 이상의 결과에서 고추냉이 11 종류는 단계통군 (monophyly) 을 형성하는 것으로 보아 유전적으로는 매우 가깝게 나타났지만 품종간/내 형태적으로 유사한 종류들은 서로 유집되지 않는 것으로 나타났다. 일반적으로 고추냉이는 잡종 성이 강하여 채종한 후 실생묘를 육성하면 여러가지 형질이 다른 변이체가 나타나므로 교잡종의 우량한 성질을 유지할 수 없는 것으로 알려져 있는데 (Nakamura & Sathiyamoorthy, 1990), 본 연구에 사용된 재료 역시 재배 기간 동안 많은 교잡과정이 있었던 것으로 추측된다.
- 96에서 유집되어 유연관계 가 가장 높게 나타났다. 일본에서 재배되고 있는 사야토리 (SAY)와 히메니시키 (HIM)는 다른 9개체와는 유사도 0.83이하에서 유집되어 유연관계가 가장 멀게 나타났으며 , 사와 (SAW) 품종은 시 마네재 래 (SIM) 와 달마 (DRU) 와 함께 유집되어 나타났다. 국내에서 선발된 달마 계통의 재배종들은 서로 유집되지 않고 오히려 다른 품종들과 유집되는 경향을 보였으며 일본에서 재배되는 후지 달마 (HUJ) 역시 달마 품종의 4개체, 시마네 재 래 (SIM), 시마네3호 (SIM3), 사와 (SAW) 품종들을 위한 자매 군으로 유집되었다.
- 8개로 나타났다 (Table 3). 한편 OPD-3은관찰된 13개 밴드 중 12개 (92.3%)가 다형화 현상을 보여 가장 높은 polymorphism을 보이는 반면, OPA-4, OPD-2, 10, 15, 18 등 5개 primer는 11품종 모두가 monomorphic하게 나타났다.
후속연구
- 또한 형태적으로는 근경이나 잎의 특징에 의해 품종간 구별이 명확하나 DNA분석에 의해서는 뚜렷한 경향을 찾을 수가 없어 RAPD법은 고추냉이의 품종 유연관계분석을 위한 방법으로 유용하지 않은 것으로 나타났다. 따라서 보다 정확한 품종별 계통유연관계 분석을 위해서는 AFLP분석이나진화속도가 빠르고 계통분석에 용이한 유전자로 알려져있는 핵DNA의 ITS region이나 엽록체 DNA의 ndhF, matK coding gene의 sequence를 비교하는 등 보다 정밀한 분자 계통학적 연구가 수행되어져야 할 것으로 판단된다.
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