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문제 정의
- 배과피 추출 폴리페놀의 암세포에 대한 억제능을 살펴보았다. 추출물 중 폴리페놀 함량이 높았던 분획n, 이에서 암세포증식 억제능을 볼 수 있었다.
가설 설정
- 우리나라의 배 재배는 삼한시대와 신라의 문헌에서 배에 관한 기록이 있고 고려에서도 재배를 장려했다는 기록을 보아 역사는 매우 길다.')배에 함유된 영양성분은 먹을 수 있는 가식율이 80-82%, 수분함량이 85-88%에 이른다. 주성분은 탄수화물이며 당분은 10-13%로 품종에 따라 차이가 많고 단백질 함량은 0.
제안 방법
- Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입하였다. 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum과 penicillin G(25 unit/m/), streptomycin(25 를 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37℃, 5% Ct%의 환경에 적응시켜 배양하였다.
- 이러한 과정은 일반적인 약용식물에서 폴리페놀을 분획할 때 메탄올 10%까지는 그대로 용출시킨 후에 분획을 시작한 Nonaka의 방법#을 응용하여 실시하였다. 배 과피에는 다양한 폴리페놀을 함유하고 있으나 그 산화효소의 작용으로 정제과정을 거치는 동안 화합물이 불안정하여 복잡한 정제과정을 거치기 어려운 점이 있어 분획물 I, Ⅱ, Ⅲ를 얻어 각종 생리활성실험을 실시하였다. 전자공여능.
- 배로부터 박피된 과피 3kg에 80% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 추출한후 원심분리(l, 690Xg, 30 min)하여 상징액과 침전물을 얻었고이 침전물에 다시 80% 에탄올을 가하고 위와같은 추출 과정을 4회 반복하였다. 배추출물로부터 Sephadex LH-20에 의해 분획된 폴리페놀화합물군을 감압농축한 후 동결건조하여 본 실험에 사용하였다 (Fig.
- 여기에 5 mg/m/ 농도로 제조한 MTT 용액 20를 첨가하여 4시간 더 배양하였다. 배양종료 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 15이를 가하여 30분간 교반 한 후 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하여 암세포주의 성장억제효과를 측정하였다. 세포증식 억제효과는 다음과 같은 계산식으로 구하였다.
- 전자공여능. 생체막 구성성분을 파괴하며 각종 산화작용을 나타내는 활성산소를 소거하여 줄 수 있는 활성을 알아보기 위하여 배 과피로 부터 추출한 폴리페놀의 분획물을 50 ppm에서 1, 000 ppm으로 조제하여 전자공여능을 살펴보았다(Fig. 2). 분획물 n, Ⅲ는 50 ppm에서부터 80% 이상의 전자공여능을 보였으며, 분획물 I의 경우에는 1,000 ppm에서 약 40%의 전자공여능을 나타내었다.
- 암세포주를 96 well plate에 1><" cells/well이 되게 180(1/ 분주하고 시료를 일정농도로 제조하여 20B 첨가한 후 37℃, 5% CO2 항온기에서 48시간 배양하였고, 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/m/ 농도로 제조한 MTT 용액 20를 첨가하여 4시간 더 배양하였다.
- $ 그러나 우리 일상생활에서 오랫동안 식품으로 애용되어왔던 배의 생리활성 기능에 대한 연구는 매우 미비한 것이 사실이다. 우리는 배의 껍질부분에 상대적으로 많이 존재하는 폴리페놀류를 분획하고 배의 폴리페놀4)성분에 대한 생리활성 검증의 일환으로 전자공여능, 항산화, SOD 유사활성, 항암실험을 수행하였다.
- 위와 같이 배과피를 분획한 결과대체로 메탄올 함량이 낮은 농도에서 폴리페놀이 대부분 용출되는 것으로 보아 sephadex LH-20에 대해 흡착력이 약한 폴리페놀로 구성되어있다는 것을 추정할 수 있었다. 이러한 과정은 일반적인 약용식물에서 폴리페놀을 분획할 때 메탄올 10%까지는 그대로 용출시킨 후에 분획을 시작한 Nonaka의 방법#을 응용하여 실시하였다. 배 과피에는 다양한 폴리페놀을 함유하고 있으나 그 산화효소의 작용으로 정제과정을 거치는 동안 화합물이 불안정하여 복잡한 정제과정을 거치기 어려운 점이 있어 분획물 I, Ⅱ, Ⅲ를 얻어 각종 생리활성실험을 실시하였다.
-
전자공여능에 의한 항산화 측정.
- Stirpe와 Corte, )의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 xanthine 2mM을 녹인 기질액 0.4 m/에 xanthine oxidase(0.2 unit/m/)0.2 mZ와 시료액 0.2 ml를 가하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 0.2 rW 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시키고 20% trichloroacetic acid(TCA) 1 ml를 가하여 반응을 종료시키고 원심분리하여 단백질을 제거한 후 반응액 중에 생성된 uric acid 를 흡광도 292nm에서 측정하여, 다음 식으로 저해율(%)을 구하였다.
- 폴리페놀류의 암세포주에 대한 증식 억제효과는 Carmichael 등의 방법을 변형하여 MIT assay를 실시하였다. 암세포주를 96 well plate에 1><" cells/well이 되게 180(1/ 분주하고 시료를 일정농도로 제조하여 20B 첨가한 후 37℃, 5% CO2 항온기에서 48시간 배양하였고, 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다.
- 폴리페놀류의 전자공여 작용(electron donating ability, EDA)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료 1.
대상 데이터
- 반복하였다. 배추출물로부터 Sephadex LH-20에 의해 분획된 폴리페놀화합물군을 감압농축한 후 동결건조하여 본 실험에 사용하였다 (Fig. 1).,
- 본 실험에 사용된 배과피는 신고 품종으로 과피만을 모아 공시재료로 사용하였다.
- 본 실험에 이용한 세포 PC-3, MDA-MB-231 은 Korean Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입하였다. 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum과 penicillin G(25 unit/m/), streptomycin(25 를 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37℃, 5% Ct%의 환경에 적응시켜 배양하였다.
데이터처리
- 통계처리. 본 연구의 통계처리는 SPSS 10.0 for windows program을 사용하여 실시하였으며, Student-Newman-Keuls multiple range test를 이용하여 평균값의 유의성을 5% 이내의 한계로 조사하였다.
이론/모형
- Superoxide dismutase 유사활성능은 Marklund의 방법에 따라 각 시료액 0.2 mH Tris-HCl의 완충용액 (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8.5) 3.0 mZ와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mZ를 가하여 25℃에서 10 분간 반응시킨 후, 1.0N HCl 0.1 mZ를 가하여 반응을, 정지시킨 후 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420nm에서 측정하였다. SOD 유사활성능은 시료 첨가구와 첨가하지 않은 경우의 흡광도 감소율로 나타내었다.
- Xanthine oxidase 활성 저해측정은 Stirpe와 Corte, )의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 반응구는 0.
성능/효과
- 배 과피로부터 폴리페놀 화합물군을 분획하기위해서 배과피를 80% 에탄올 #에 침지하여 추출하여 실온에서 4회 추출한 액을 여과한 후 농축하여 Fig. 1과 같이 sephadex LH-20을 통과시켜 분획한 결과 세부분으로 나눌수 있었으며, 폴리페놀 화합물군을 정량한 결과 각각 5.7, 55.8, 71.6%로 나타났다(Table 1). 위와 같이 배과피를 분획한 결과대체로 메탄올 함량이 낮은 농도에서 폴리페놀이 대부분 용출되는 것으로 보아 sephadex LH-20에 대해 흡착력이 약한 폴리페놀로 구성되어있다는 것을 추정할 수 있었다.
- 2). 분획물 n, Ⅲ는 50 ppm에서부터 80% 이상의 전자공여능을 보였으며, 분획물 I의 경우에는 1,000 ppm에서 약 40%의 전자공여능을 나타내었다. 이 등,)의 함초의 열수추출물의 경우 500ppm 에서 60% 정도의 전자공여능을 보인 것과 비교할 때 우수한 전자공여능을 나타냄을 알 수 있었다.
- 생체내에서 superoxide radical을 과산화수소로 전환시키는 SOD의 유사능은 Fig. 3 에서와 같이 분획물 Ie 그 활성이 미약하였으나, 분획물 n, Hi 의 경우 100 ppm에서 20%대, 500ppm에서 50-60%의 효과를 나타내었으며, 1,000ppm에서는 85.4%와 90.4%로 증가되는 것을 알 수 있었다. 분획물간에는 의 순서대로 그 활성이 큰 것을 알 수 있었다.
- 6%로 나타났다(Table 1). 위와 같이 배과피를 분획한 결과대체로 메탄올 함량이 낮은 농도에서 폴리페놀이 대부분 용출되는 것으로 보아 sephadex LH-20에 대해 흡착력이 약한 폴리페놀로 구성되어있다는 것을 추정할 수 있었다. 이러한 과정은 일반적인 약용식물에서 폴리페놀을 분획할 때 메탄올 10%까지는 그대로 용출시킨 후에 분획을 시작한 Nonaka의 방법#을 응용하여 실시하였다.
- Fe를 함유하는 flatoproteiri이다. 이러한 요산을 생성하는 xanthine oxidase에 대한 활성저해능을 측정한 결과 분획물 I의저해 효과는 매우 미미하였으나 나머지 분획폴리페놀류는 50 ppm에서도 80%에 이르는 높은 저해효과가 관찰되었다(Fig 4). 이러한 결과들은 Stripe 등(4)과 안 등#의 xanthin oxidase저해실험에서 폴리페놀류가 저해효과가 높다는 결과와도 일치하였으며, 김 등16)이 보고한 해조류 추출물 중 감태 메탄올 추출물이 400 ppm 농도에서 53.
- 우선 유선암세포에서는 분획물 Ⅱ는 2,000 ppm에서도 그 저해능이 20% 미만의 낮은 저해능을 나타내었으나, 분획물 Ⅲ의 경우에는 1, 000 ppm에서는 약 30% 그리고 2,000 ppm에서는 약 60%의 유선암세포에 대한 저해능을 나타내었다. 한편, 전립선암에 대해서는 앞선 유선암의 결과와는 반대로 폴리페놀 함량이 낮은 분획물 II의 저해능이 500ppm에서 20%를 상회호}는 저해능을 나타내어 폴리페놀 함량이 많은 분획물 m보다 오히려 높게 나타났다. 저령추출물의 인간유래 위암세포인 SNU668에 대하여 water fraction에서는 1000ppm에서 71%, ethylacetate fraction에서는 43.
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