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문제 정의
- 본 연구에서는 능소화의 EtOAc 분획으로부터 column chromatography를 수행하여 4종의 화합물을 분리 동정하였고, 각 화합물에 대한 fanesyl-protein transferase(FPTase) 저해 활성을 측정하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- EtOAc 추출물(CGE>을 silica gel column(9X 20 cm) chromatography (n-hexane-CHCl3-MeOH = 30 : 10 : 1 t CHCl3-MeOH = 50:1 t 30 : 1 — 10 : 1 — 5 :1 t 3 : 1)를 실시하여 15개의 분획물 (CGE1~CGE15)을 얻었다.
- 기기 및 시약. NMR 스펙트럼은 Xerian Inova AS 400 (Varian, US A)으로, IR 스펙트럼은 Spectrum One(Perkin-Elmer, USA)으로, Polarimeter는 P-1010(JASCO, Japan)으로, EI/MS와 FAB/MS는 JMSAX 505-WA(JEOL, Japan)로 측정하였다. GC 는 GC-14B(Shimadzu, Japan)로, GC/MS는 JMS-700(JEOL, Japan)으로 측정하였으며, 녹는점은 Fisher-John's Meting Point Apparatus(Fisher Scientific, US A)를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다.
- NMR 스펙트럼은 Xerian Inova AS 400 (Varian, US A)으로, IR 스펙트럼은 Spectrum One(Perkin-Elmer, USA)으로, Polarimeter는 P-1010(JASCO, Japan)으로, EI/MS와 FAB/MS는 JMSAX 505-WA(JEOL, Japan)로 측정하였다. GC 는 GC-14B(Shimadzu, Japan)로, GC/MS는 JMS-700(JEOL, Japan)으로 측정하였으며, 녹는점은 Fisher-John's Meting Point Apparatus(Fisher Scientific, US A)를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다. Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60(Merck, Germany)을 octadecylsilica gel(ODS)은 LiChroprep RP-18(Merck, Germany)을 사용하였다.
- 얻었다. 그 중 CGE2(l.lg) 분획을 silica gel c.c.(n-heptane-n-hexane-EtOAc = 35:20:1, 05.5 X 11 cm)를이용하여 12개의 분획물(CGE2-1~CGE2-12)을 얻었고, CGE2-2 (539mg)> 다시 ODS c.c.(MeOH-H2O = 6:1^ acetone-CH3CN, <D3.8X9cm)로 정제하여 화합물 l(CGE2-2-3, 46 mg)과 화합물 2(CGE2-2-6, 155 mg)를 분리하였다.
- CGE7(26g) 분획 을 siUca gel c.c.(CHCl3-EtOH = 35 : 1 25: It 15 ;1, 0>7X 14 cm> 이용하여 18개의 분획물 (CGE7-1 ~CGE7-18)을 얻었다. 그- 중에서 CGE7-l(4.
- 화합물 1 및 2의 GC/MS 분석. 각 시료 CGE2-2-3(화합물 1, Img/lm/), CGE2-2-6(화합물 2, 1 mg/1 m/)로부터 각 3μl 를 취하여, FID가 설치된 GC(GC-14B, Shimadzu, Japan)의 주입구에 넣고, 탈착시켜 분석하였다.
- 화합물 1 및 2의 GC/MS 분석. 각 시료 CGE2-2-3(화합물 1, Img/lm/), CGE2-2-6(화합물 2, 1 mg/1 m/)로부터 각 3μl 를 취하여, FID가 설치된 GC(GC-14B, Shimadzu, Japan)의 주입구에 넣고, 탈착시켜 분석하였다. 분석용 컬럼은 DB-5(30m X 0.
- 각 시료 CGE2-2-3(화합물 1, Img/lm/), CGE2-2-6(화합물 2, 1 mg/1 m/)로부터 각 3μl 를 취하여, FID가 설치된 GC(GC-14B, Shimadzu, Japan)의 주입구에 넣고, 탈착시켜 분석하였다. 분석용 컬럼은 DB-5(30m X 0.32 mm IDX0.25gm, J&W, Folsom, CA, USA)를 사용하였으며, GC의 injector 온도는 320℃, oven 온도는 처음 5분 동안 200℃로 유지하였고, 승온 속도를 15P/mio으로 하여 최종온도가 320℃가 되도록 한 후 10분간 32CTC를 유지하도록 하였다. 분석한 화합물을 동정하기 위하여, GC(Agilent technologies, USA)와 연결된 mass spectrometer(JMS-700, JEOL, Japan)를 사용하였고, 분석용으로 사용한 컬럼 (HP-5, 30 mX 0.
- 25gm, J&W, Folsom, CA, USA)를 사용하였으며, GC의 injector 온도는 320℃, oven 온도는 처음 5분 동안 200℃로 유지하였고, 승온 속도를 15P/mio으로 하여 최종온도가 320℃가 되도록 한 후 10분간 32CTC를 유지하도록 하였다. 분석한 화합물을 동정하기 위하여, GC(Agilent technologies, USA)와 연결된 mass spectrometer(JMS-700, JEOL, Japan)를 사용하였고, 분석용으로 사용한 컬럼 (HP-5, 30 mX 0.32 mm IDX0.25 μm, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. GC로 분석한 각 peak의 최종적인 확인은 GC-MS의 library 분석을 바탕으로 확인하였다.
- 60분 동안 37℃에서 반응시킨 후 150의 STOP/bead 시약을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 시료를 잘 섞은 후 실온에서 30분 동안 방치한 후 1450 Microbeta Counter (WallacX 이용하여, Biotin-KKKSKTKCVIM에 transfer된 [3H] farnesyl의 양을 측정함에 의해 FPTase 활성을 측정하였다. 효소 억제활성은 vehicle만 넣은 시료에서의 효소 활성도에 대한 퍼센트(%)로 나타내었으며, 각 실험은 3반복 하였다.
- 시료를 잘 섞은 후 실온에서 30분 동안 방치한 후 1450 Microbeta Counter (WallacX 이용하여, Biotin-KKKSKTKCVIM에 transfer된 [3H] farnesyl의 양을 측정함에 의해 FPTase 활성을 측정하였다. 효소 억제활성은 vehicle만 넣은 시료에서의 효소 활성도에 대한 퍼센트(%)로 나타내었으며, 각 실험은 3반복 하였다.
- 능소화로부터 얻어진 MeOH 추출물에 대하여 용매의 극성에 따라 EtOAc, m-BuOH 및 HQ로 순차 분획하고 각 분획은 감압 농축하여 3개의 분획을 얻었다. EtOAc 분획을 silica gel column chromatography와 ODS column chromatography로 정제하여 4개의 화합물 1(46 mg), 2(155 mg), 3(152 mg) 및 4(28 mg)를 분리하였다.
- 3개의 분획을 얻었다. EtOAc 분획을 silica gel column chromatography와 ODS column chromatography로 정제하여 4개의 화합물 1(46 mg), 2(155 mg), 3(152 mg) 및 4(28 mg)를 분리하였다.
- 25 μm, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. GC로 분석한 각 peak의 최종적인 확인은 GC-MS의 library 분석을 바탕으로 확인하였다.
대상 데이터
- Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60(Merck, Germany)을 octadecylsilica gel(ODS)은 LiChroprep RP-18(Merck, Germany)을 사용하였다. TLC는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254들 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 식물시료. 경동시장에서 능소화(중국산)를 구입하였고, 표본 시료(KHU03027)는 경희대학교 생명공학원 천연물화학실 시료 실에 보관되어 있다.
이론/모형
- FPIhse(Famesyl-Protein Transferase) 억제활성. FPIase 활성은『Hj-sciiitniation proximity assay(SPA) 방"법을 이용하여 실시하였다. FPTase 활성은 Biotin-KKKSKTKCVIM(FPTase 의 기질로서 Ki-Ras C-terminal sequence)에 [3H] fomesyl pyrophosphate로부터 [3H] famesyl group의 전이를 측정함에 의해 결정된다, 반응용액(최종 부피: 100μl)은 50 mM HEPES, pH 7.
성능/효과
- 화합물 1은 노란 oil상 물질로서 1H-NMR 스펙트럼에서 6 5.33(6H, m)의 signal로부터 olefinic methine proton 6개가 존재함을 확인하였고, 62.79 에서 81.28 사이에서 10개의 methylene proton signal과 S0.95(3H, t, J =7.6 Hz)에서 triplet 의 말단 methyl proton signal0] 관측되었다. 13C-NMR 스펙트럼에서 19개의 탄소 signal이 확인되었으며, 617407에서 esteric carbon과 5131.
- 6 Hz)에서 triplet 의 말단 methyl proton signal0] 관측되었다. 13C-NMR 스펙트럼에서 19개의 탄소 signal이 확인되었으며, 617407에서 esteric carbon과 5131.81, 5130.12, 8128.15, 5128.12, 5127.61 및 6126.99에서 6개의 olefinic carbon, 그리고 65L41 에서 methoxy 기가 관즉되었다. 따라서 화합물 1은 octadecatrienoic acid methyl ester로 구조 규명되었다.
- 따라서 화합물 1은 octadecatrienoic acid methyl ester로 구조 규명되었다. 또한 GC/MS를 이용하여 재료 및 방법에서 제시한 조건으로 분석한 결과 5분 18초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 M+ 이온 peak가 m/z 292에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 library를 검색한 결과 화합물 1을 linolenic acid의 methyl ester 로 동정하였다.
- 또한 GC/MS를 이용하여 재료 및 방법에서 제시한 조건으로 분석한 결과 5분 18초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 M+ 이온 peak가 m/z 292에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 library를 검색한 결과 화합물 1을 linolenic acid의 methyl ester 로 동정하였다.
- 화합물 2는 무색의 oil상 물질로서 1H-NMR 스펙트럼에서 85.30(4H, m)의 signal로부터 olefinic methine proton 4개가 존재함을 확인하였고, 62.73-51.22 사이에서 12개의 methylene proton signal과 50.84(3H, t, J = 1 Hz) 에서 triplet의 말단 methyl proton signal이 관측되었다. 13C-NMR 스펙트럼에서 19 개의 탄소 signal이 확인되었으며, 6173.
- 84(3H, t, J = 1 Hz) 에서 triplet의 말단 methyl proton signal이 관측되었다. 13C-NMR 스펙트럼에서 19 개의 탄소 signal이 확인되었으며, 6173.94에서 esteric carbon과 5129.94, 5129.78, 5127.85 및 6127.기에서 4개의 olefinic carbon, 그리고 651.29에서 methoxy 기가 관측되었다. 따라서 화합물 2는 octadecadienoic acid methyl ester로 구조 규명되었다.
- 따라서 화합물 2는 octadecadienoic acid methyl ester로 구조 규명되었다. 또한 GC/MS를 이용하여 화합물 1과 동일한 조건으로 분석한 결과 5분 12초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectnm에서 M* 이온 peak가 m/z 294에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 library를 검색한 결과 화합물 2를 linoleic acid 의 methyl ester로 동정하였다.
- 또한 GC/MS를 이용하여 화합물 1과 동일한 조건으로 분석한 결과 5분 12초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectnm에서 M* 이온 peak가 m/z 294에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 library를 검색한 결과 화합물 2를 linoleic acid 의 methyl ester로 동정하였다.
- 2 Hz) 에서 1개의 triplet methyl proton signal을 확인하였다. , 3C-NMR 스펙트럼에서 탄소수 29개의 탄소 signal이 확인되었으며, 6141.34와 6120.63에서 1개의 이중결합, 670.74에서 1개의 oxygenated methine signal을 확인하였다. 또한 519.
- 화합물 4는 무색의 결정 물질로서 1H-NMR 스펙트럼과 13C- NMR 스펙트럼에서 화합물 3과 거의 유사하였고, 비당부 이외에 당 한 분자의 signal을 확인할 수 있었다. 이러한 당 signal 은 ec-NMR의 당부의 chemical shift를 검토한 결과 D- glucopyranose로 판명되었다/ 또한 B-NMR에 있어서 55.
- 당 한 분자의 signal을 확인할 수 있었다. 이러한 당 signal 은 ec-NMR의 당부의 chemical shift를 검토한 결과 D- glucopyranose로 판명되었다/ 또한 B-NMR에 있어서 55.04 (1H, d, 7=7.6 Hz)에서 관측되는 anomeric proton의 coupling constant 값이 7.6 Hz인 것으로 보아 P 결합하고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 화합물 4는 |3-sitosterol의 3번 hydroxyl기에 D-이ucopyranose가 p- 결합한 daucosteroL로 동정히였다.
- 화합물 1, 2, 3 및 4에 대하여 FPTase 저해 활성을 측정한 결과 화합물 4(daucosterol)는 14土O.O4|1M의 IC50 값으로 FPTase의 활성을 저해하였다. 알려진 FPTase 저해물질인 Stachybotrys kampalensis에서 분리된 kampanol A의 IC50 값 13μM보다는 다소 활성이 낮으나 Artemisia sylvatica에서 분리된 artanomaloide의 IC50 값 22 μM보다는 솧은 활성을 보였다.
- O4|1M의 IC50 값으로 FPTase의 활성을 저해하였다. 알려진 FPTase 저해물질인 Stachybotrys kampalensis에서 분리된 kampanol A의 IC50 값 13μM보다는 다소 활성이 낮으나 Artemisia sylvatica에서 분리된 artanomaloide의 IC50 값 22 μM보다는 솧은 활성을 보였다. 특히 daucosteroL ^-sitosterol과 마찬가지로 식물체에 다수존재 하는 물질이면서 지금까지는 보고된 생리 활성이 거의 없었으나 본 실험 결과 FPTase 저해 활성을 보이고 있어 향후 daucosterol에 대한 항암 효능에 대한 체계적인 연구가 필요하다고 사료된다.
- 59에서 6개의 methyl signal이 관측되었다. 이를 종합하여 NMR spectrum을 비교한 결과2) 화합물 3은 여러가지 식물에 널리 함유되어있는 sterol인 stigmast-5-en-3-&-ol(§-sitosterol)로 동정하였다.
후속연구
- 알려진 FPTase 저해물질인 Stachybotrys kampalensis에서 분리된 kampanol A의 IC50 값 13μM보다는 다소 활성이 낮으나 Artemisia sylvatica에서 분리된 artanomaloide의 IC50 값 22 μM보다는 솧은 활성을 보였다. 특히 daucosteroL ^-sitosterol과 마찬가지로 식물체에 다수존재 하는 물질이면서 지금까지는 보고된 생리 활성이 거의 없었으나 본 실험 결과 FPTase 저해 활성을 보이고 있어 향후 daucosterol에 대한 항암 효능에 대한 체계적인 연구가 필요하다고 사료된다.
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