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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 수산식품의 대표적 식중독 세균이며, 현재 국내 상당한 수요를 차지하는 수산가공식품인 게맛살의 미생물학적 위해 요소로 정해져 있는 V parahaemolyticus에 대하여, 제품에 균의 오염 시 균의 성장변화를 정량적으로 예측하는 수학적 모델의 개발을 위한 기초 자료를 제공하고자, 온도, pH에 대한 V parahaemolyticus의 성장 예측모델을 개발하였다.
제안 방법
- 2차 모델식과 Gompertz 모델에 의한 V parahaemolyticus의 성장 예측: 서로 다른 초기 균수, 온도, pH 조건하에서 polynomial model과 square root model로 예측한 최대증식속도상수(k)를 균의 성장 곡선을 표현하는 Gompertz식에 적용함으로써, 각조건에서 Gompertz 식에 의한 균의 성장을 예측할 수 있게 되었다. 초기 균수 1.
- MIC broth상에서 의 V parahaemolyticus의 온도와 초기균수에 따른 최대 증식속도 상수의 정량 평가 모델을 square root model 과 polynomial model을 이용하여 개발하였으며, 개발된 정량 평가 모델에 의하여 예측된 최대 증식속도 상수를 이용하여 온도, pH, 초기균수에 따른 V parahaemolyticus의 성장을 Gompertz 모델로 예측, 증식 곡선으로 나타내었다. 결과 및 고찰 환경 조건에 따른 균의 생육 지표치의 변화 각 환경 요인에 따른 균의 증식을 예측하기 위하여 균의 증식과 polynomial model을 이용하여 개발하였으며, 개발된 정량 평가 모델에 의하여 예측된 최대 증식속도 상수를 이용하여 온도, pH, 초기균수에 따른 V parahaemolyticus의 성장을 Gomp- ertz 모델로 예측, 증식 곡선으로 나타내었다.
- MIC broth상에서 의 V parahaemolyticus의 온도와 초기균수에 따른 최대 증식속도 상수의 정량 평가 모델을 square root model 과 polynomial model을 이용하여 개발하였으며, 개발된 정량 평가 모델에 의하여 예측된 최대 증식속도 상수를 이용하여 온도, pH, 초기균수에 따른 V parahaemolyticus의 성장을 Gompertz 모델로 예측, 증식 곡선으로 나타내었다. 결과 및 고찰 환경 조건에 따른 균의 생육 지표치의 변화 각 환경 요인에 따른 균의 증식을 예측하기 위하여 균의 증식과 polynomial model을 이용하여 개발하였으며, 개발된 정량 평가 모델에 의하여 예측된 최대 증식속도 상수를 이용하여 온도, pH, 초기균수에 따른 V parahaemolyticus의 성장을 Gomp- ertz 모델로 예측, 증식 곡선으로 나타내었다.
- 공시균주의 배양은 향후, 균의 성장 모델을 포장연제품인 게맛실에적용하기 위해 게맛살 성분(조단백 7.8%, 조지방 0.2%, 탄수화물 16%, 회분 2.5%, 수분 73.5%)과 유사한 배지(MIC broth)를 제조하여 사용하였다 (Table 1).
- 균의 성장에 미치는 온도, pH 및 초기 균수 등 환경인자의 영향을 알아보기 위하여 동결 보존한 균주를 37oC water bath에서 급속 해동한 후, 미리 준비한 멸균 MIC broth 50mL에 접종하고 37oC incubator (Sanyo, Japan)에서 24시간 전배양 하였다. 전배양 한 균주를 18mL의 멸균 생리 식염수(3% NaCl)를 이용해 10배씩 희석하여 200 mL의 MIC broth에 초기 균수가 102, 103, 104 CFU/mL가 되도록 접종하고 온도 15, 20, 37, 40℃, pH 6, 7, 8에서 각각 배양하였다.
- 0)으로 검정하였다. 또한 k에 미치는 초기균수, 온도,pH의 복합적인 관계를 square root model과 polynomial model로 정량화 하였다.
- 수산식품에서 문제가 되는 식중독 균인 V parahaemolyticus를 대상으로 온도, pH 및 초기균수에 따른 균의 성장 실험 결과를 데이터베이스화하여 이를 바탕으로 균의 성장을 정량적으로 평가할 수 있는 수학적 모델을 개발하였다. 1.
- 전배양 한 균주를 18mL의 멸균 생리 식염수(3% NaCl)를 이용해 10배씩 희석하여 200 mL의 MIC broth에 초기 균수가 102, 103, 104 CFU/mL가 되도록 접종하고 온도 15, 20, 37, 40℃, pH 6, 7, 8에서 각각 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 균주는 Vibrio parahaemolyticus ATCC 2210001로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)으로부터 분양 받아 3% NaCl을 첨가한 brain heart infusion(BHI, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) broth에 15%의 glycer이를 첨가하여 -80oC에 동결보관하면서 실험전 modified imitation crab(MIC) broth에서 37oC, 24시간 전배양하여 사용하였다.
데이터처리
- 균의 증식을 대표하는 균의 생육 지표로써, 최대 증식속도상수(k)와 유도기(LT), 세대시간(GT)을 실험을 통한 Gompertz모델에 의하여 도출하였으며, 최대 증식속도 상수, 유도기, 세대시간에 미치는 초기 균수, 온도, pH의 영향을 각각 One-wayANOVA-test를 실시하여 Duncan's multiple range test(9)로 처리평균간의 유의성(P<0.05)을 SPSS (SPSS Inc., 2000) program(Ver. 10.0)으로 검정하였다. 또한 k에 미치는 초기균수, 온도,pH의 복합적인 관계를 square root model과 polynomial model로 정량화 하였다.
- 온도 15, 20, 37, 40oC, pH 6, 7, 8 및 초기균수 102, 103, 104 CFU/mL의 조건하에서 Gompertz model로부터 구한 최대 증식속도 상수(k)와 환경 조건과의 관계를 규명하기 위하여square root model과 polynomial model에 각각 적용하여 SPSS(SPSS Inc., 2000) program(Ver. 10.0)을 이용하여 각 식의 parameter를 결정하고 Sigma Plot(SPSS Inc., version 7.0)으로도식화 하였으며, 각 배양 조건을 대입하여 실제 실험으로부터 구한 최대 증식속도상수와 모델식으로부터 구한 최대 증식속도 상수와의 상관관계를 비교하였다.
이론/모형
- 각 실험구별 시간의 경과에 따른 균의 성장은 일정시간 간격 AS plate count agar(PCA, Difco Laboratories, Detroit, MI,USA)를 사용하여 표준 평판 배양법(7)으로 생균수를 측정하여 나타내었다.
- 초기 균수에 따른 V parahaemolyticus의 성장을 정량적으로 예즉하기 위하여 square root model과 polynomial model을이용하였다. 각 초기균수 조건에서 온도와 pH의 복합적인 영향을 표현하기 위해서 sigmaplot 7.0(SPSS Inc.)의 Gauss-Newton 알고리즘을 사용하여 식 (2)와 같은 비선형 회귀분석식을 통하여 모델화하였다.
- 각 환경 요인에 따른 균의 증식을 예측하기 위하여 균의 증식을 대표하는 생육지표로써, 최대 증식속도 상수(k), 유도기(LT), 세대시간(GT)을 Gompertz 모델로부터 구하였다. 균의 성장을 표현하는 식으로는 지금까지 여러가지의 형태로 보고되어 있으나, 그 중에서 특히 Gompertz model에 관한 연구가 가장 많으며 영국과 미국에서 각각 개발된 food micromodel(FMM) and Pathogen Modeling program(PMP) 경우에도 Gompertz model을 사용하고 있다.
- 균의 sigmoid 한 형태의 성장을 표현하기 위해 사용하는 연속함수의 식은 Gompertz가 1825년에 인구동태의 조사결과를 경험식으로서 제시한 Gompertz function (식 1)(8)을 사용하였으며, 1회의 배양실험에서 시간의 경과에 따른 12-16개의 생균 수 값을 얻었으며, 15반복을 통한 실험 결과값을 Gompertz model 에 대입하여 균의 생육지표치인 최대증식속도 상수(k= BC/e)를 구하였다.
- 균의 증식 지표치인 최대증식속도상수 k는 온도에 지배적인 영향을 받았으며, pH 및 초기균수에 따른 유의적인 차이는 없었으므로 (P>0.05), k와 온도와의 관계식인 square root model로나타내었다.
- 온도와 pH의 변화에 따른 초기균수별 정량평가 모델: 온도, pH, 초기 균수에 따른 V parahaemolyticus의 성장을 정량적으로 예즉하기 위하여 square root model과 polynomial model을이용하였다. 각 초기균수 조건에서 온도와 pH의 복합적인 영향을 표현하기 위해서 sigmaplot 7.
- 9 범위에서 비교적 일정하다고 보고하였다. 이 같은 pH 범위는 대부분의 수산 식품의 어류나 게, 새우 등의 갑각류, 패류 등의 해양 생물의 pH 범위와 일치하기 때문에, 수산 식품의 원료 또는 가공식품의 병원성 인자인 V parahaemolyticus의 성장 예측모델에서 pH를 변수에서 제외하고, Ratkowsky 등(11), Zwietering 등(12, 13)이 정의한 초기균수를 고려하지 않은 온도와 최대증식속도상수(k)간의 상호작용을 표현하는 2차 모델인 square root model의 확장된 형태를 사용하여 Jk =b(T-Tmin)[1-exp(c(T - Tmax))]로 통합하여 식 (4)과 같이 정량화 하였으며, 통계적 분석치를 Table 4에 나타내었다.
성능/효과
- 2에 곡면 응답 모델로 나타내었다. 1.0X102, 1.0X103, 1.0X104 CFU/mL의 각 초기균수 조건에서 실험치와 예측치의 상관계수는 각각 0.966, 0.979, 0.965이며, 초기균수를 고려하지 않은 모델식은 상관계수가 0.966으로 나타났다. 한편, square root model의 확장된 형태인 식 (4)로부터 예측한 최대증식속도상수와 실험치를 비교한 결과는 Fig.
- 평가할 수 있는 수학적 모델을 개발하였다. 1.0X102, 1.0×103, 1.0X104 CFU/mL의 각 초기균수 조건에서 실험치와 예측치의 상관계수는 각각 0.966, 0.979, 0.965으로 나타났다. 또한, 초기균수를 고려하지 않은 모델식은 상관계수가 0.
- 4과 같다. 실험을 통해 관찰된 균의 성장과 예측 정량평가 모델을 이용한 균의 성장은 잘 일치하는 것으로 나타났다. 이러한 최대증식속도상수에 관한 정량적인 모델은 V.
- 1에 나타내었다. 온도가 높아질수록 최대증식 속도상수는 증가하여 37oC에서 가장 높은 값을 나타내었으며, 40oC에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 한편, 37℃, pH 7, 초기균수 1.
- 041 hr)을 나타내었고, 40oC에서는 다시 길어졌다. 유도기, 세대시간도 최대 증식속도와 같이 pH와 초기균수보다 온도의 영향을 더 받는 것으로 나타났다.
후속연구
- 실험을 통해 관찰된 균의 성장과 예측 정량평가 모델을 이용한 균의 성장은 잘 일치하는 것으로 나타났다. 이러한 최대증식속도상수에 관한 정량적인 모델은 V. parahaemolyticus의 환경 요인에 대한 성장을 손쉽게 모니터링 할 수 있으며, 수분활성이나 좀 더 넓은 pH 범위, 여러 첨가물의 농도, 포장시 충진하는 N2 또는 CO2 농도나 이러한 조건들 간의 상호작용 등 물리 화학적인 요인에 관한 추가적인 연구를 계속한다면 보다 다양한 환경 조건하에서 보다 정확하게 V parahaemolyticus의 성장을 정량적으로 예즉할 수 있을 것으로 기대된다.
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