대식세포는 IL-1, IL-6, $TNF-{\alpha},\;IFN-{\gamma}$의 중요한 근원이고, 전염성의 병원체와 종양 세포에 대해 저항하는 주요한 effector 세포이다. 이것은 cytokine signal에 의해 세포파괴가 되도록 활성화 된다. 이번 연구에서 우리는 산더덕의 물 추출물이 cytokine, nitric oxide와 같은 effector 분자를 유도하기 위해 대식세포를 활성화하는지를 알아보기 위하여 실험하였다. 산더덕 추출물에 의한 대식세포의 NO 생성은 농도 의존적이고, 시간 의존적이었다. iNOS는 시간이 지날수록 발현이 유도되었다. 산더덕 추출물에 의한 IL-1과 IL-6mRNA 유도는 시간 의존적으로 증가 되었고, 처리 후 24시간에 최고점에 도달하였다. 이것은 활성화된 대식세포가 종양세포를 죽일 수 있음을 말한다. $TNF-{\alpha}\;mRNA$의 양은 시간이 지나도 일정하였고, $IFN-{\gamma}\;mRNA$의 양은 산더덕 추출물의 처리 1시간 후에 빠르게 강화되었다. 이러한 결과로부터 산더덕은 효과적인 면역조절자이고 대식세포의 항종양활성을 강화함을 알 수 있다.
대식세포는 IL-1, IL-6, $TNF-{\alpha},\;IFN-{\gamma}$의 중요한 근원이고, 전염성의 병원체와 종양 세포에 대해 저항하는 주요한 effector 세포이다. 이것은 cytokine signal에 의해 세포파괴가 되도록 활성화 된다. 이번 연구에서 우리는 산더덕의 물 추출물이 cytokine, nitric oxide와 같은 effector 분자를 유도하기 위해 대식세포를 활성화하는지를 알아보기 위하여 실험하였다. 산더덕 추출물에 의한 대식세포의 NO 생성은 농도 의존적이고, 시간 의존적이었다. iNOS는 시간이 지날수록 발현이 유도되었다. 산더덕 추출물에 의한 IL-1과 IL-6 mRNA 유도는 시간 의존적으로 증가 되었고, 처리 후 24시간에 최고점에 도달하였다. 이것은 활성화된 대식세포가 종양세포를 죽일 수 있음을 말한다. $TNF-{\alpha}\;mRNA$의 양은 시간이 지나도 일정하였고, $IFN-{\gamma}\;mRNA$의 양은 산더덕 추출물의 처리 1시간 후에 빠르게 강화되었다. 이러한 결과로부터 산더덕은 효과적인 면역조절자이고 대식세포의 항종양활성을 강화함을 알 수 있다.
The immunomodulatory effect of Codonopsis lanceolata based on the production of cytokines and the activation of macrophage was studied. The mRNA expression of nitric oxide synthase (iNOS) was gradually induced after 24 hr treatment of Codonopsis lanceolata, and NO production was a maximum after 24 h...
The immunomodulatory effect of Codonopsis lanceolata based on the production of cytokines and the activation of macrophage was studied. The mRNA expression of nitric oxide synthase (iNOS) was gradually induced after 24 hr treatment of Codonopsis lanceolata, and NO production was a maximum after 24 hr treatment with 1 mg/mL. RAW 264.7 cell on in vitro treatment with Codonopsis lanceolata induced mRNA of cytokines such as interleukin-1(IL-1)${\beta}$, interleukin-6(IL-6), tumor necrosis $factor(TNF)-{\alpha}\;and\;interferon(IFN)-{\gamma}$; $IL-1{\beta}$ and IL-6 mRNA were gradually induced up to 24 hr, $TNF-{\alpha}\;mRNA$ was regularly induced up to 24 hr, and $IFN-{\gamma}\;mRNA$ level was a maximum within 1 hr. These results suggest that Codonopsis lanceolata exerts as an effective immunomodulator and enhances antitumor activity of macrophages.
The immunomodulatory effect of Codonopsis lanceolata based on the production of cytokines and the activation of macrophage was studied. The mRNA expression of nitric oxide synthase (iNOS) was gradually induced after 24 hr treatment of Codonopsis lanceolata, and NO production was a maximum after 24 hr treatment with 1 mg/mL. RAW 264.7 cell on in vitro treatment with Codonopsis lanceolata induced mRNA of cytokines such as interleukin-1(IL-1)${\beta}$, interleukin-6(IL-6), tumor necrosis $factor(TNF)-{\alpha}\;and\;interferon(IFN)-{\gamma}$; $IL-1{\beta}$ and IL-6 mRNA were gradually induced up to 24 hr, $TNF-{\alpha}\;mRNA$ was regularly induced up to 24 hr, and $IFN-{\gamma}\;mRNA$ level was a maximum within 1 hr. These results suggest that Codonopsis lanceolata exerts as an effective immunomodulator and enhances antitumor activity of macrophages.
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문제 정의
본 연구는 대식세포에 의해 유도되는 cytokine의 발현 양상과 NO 생산을 실험함으로써 활성화된 대식세포에서 산더덕의 효과를 살펴보고자 하였다.
제안 방법
100mm dish에 1X107개/mL(총 5X107개) RAW 264.7 세포를 성장배지로 심어 24시간 동안 배양 후, 산더덕 추출물을 처리하여 시간별로 incubation한 후 RNA를 분리하기 위해 상층액을 버리고 1mL의 TRIzol reagent(Invitrogen Life Technologies, USA)을 넣어 상온에서 3분간 반응시켜 1.5mL tube에 모았다. 여기에 chloroform 200㎕를 넣고 15초간 잘 흔들어 준 후, ice에서 10분간 보관하였다.
7 세포의 경우 56%까지 세포증식이 억제되었다. NO 생산의 측정을 위해 산더덕 추출물 1mg/mL의 농도로 자극을 주었으며 싸이토카인의 발현을 관찰하기 위해 80%의 세포 성장률을 갖는 농도인 0.1 mg/mL의 추출물을 사용하여 다음 실험을 하였다.
Louis, MO, USA)을 넣어, 상온의 어두운 곳에서 10분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 UV 550nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도는 sodium nitrite(NaNO2)를 사용하여 얻은 표준직선과 비교하여 산출하였다.
RAW 264.7 세포를 산더덕 추출물로 활성화시킨 후 세포 증식에 미치는 효과를 알아보았다. 자극되지 않은 배지에서 48시간 배양된 세포의 증식을 100으로 하고, 산더덕 추출물로 활성화된 시험군의 세포증식을 측정한 결과, 세포증식 억제율은 Fig.
RAW 264.7 세포에 산더덕 추출물 0.1mg/mL을 첨가하여 0, 1, 6, 12, 24시간 동안 배양한 후 세포의 RNA를 추출하였다. RT-PCR을 수행하여 cytokine의 mRNA 발현량을 분석한 결과 IL-Iβ와 IL-6 mRNA 발현은 24시간까지 점차적으로 유도되는것을 확인하였다(Fig.
다시 4℃에서 12,000Xg으로 5분간 원심분리를 하여 상층액을 제거하고 RNA pellet을 clean bench에서 약 30분간 건조시 킨 후, diethylpyrophosphate(DEPC) water 23㎕에 RNA pellet을 녹였다. RNA의 정량은 50배 희석한 후 UV/vis 분광광도계(SmartSpecTM3000, Bio-Rad, USA)를 이용하여 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
RT-PCR은 cDNA합성; 42℃, 60분, predenaturation; 95℃, 5분, denaturation; 95℃, 1 분, annealing; 55-65℃, 1분, elongation; 72℃, 1 분을 31 cycles한 다음, postelongation; 72℃, 5분간 수행하였다. RT-PCR의 생성물은 0.1% ethidium bromide(EtBr; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)가 포함된 1% agarose gel(Cambrex Bio Science Rock land Inc., Rockland, ME, USA)을 사용하여 75V에서 40분간 전기영동(MJ-105, Major Science Co., LD, Taiwan)하여 UV에서 관찰하였다. 각 primer의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.
RT/PCR Premix(Bioneer, Seoul, Korea)에 cytokine의 20pmole/㎕의 sense primer(Bioneer, Seoul, Korea) 1㎕와 20pmole/㎕의 antisense primer(Bioneer, Seoul, Korea) 1 ㎕, 1 ㎍의 RT 생성물, DEPC 처리된 증류수를 넣어 최종부피가 50㎕되도록 한 후 RT-PCR(PTC-0200 DNA Engine, MJ Research Inc., USA)를 수행하였다. RT-PCR은 cDNA합성; 42℃, 60분, predenaturation; 95℃, 5분, denaturation; 95℃, 1 분, annealing; 55-65℃, 1분, elongation; 72℃, 1 분을 31 cycles한 다음, postelongation; 72℃, 5분간 수행하였다.
산더덕 추출물 1mg/mL에서 NO production은 최대량에 도달하였다. 산더덕 추출물 농도에 따라 NO 생성이 증가됨을 보여 농도 의존적인 면역활성을 관찰하였다. 특히 산더덕 추출물 1mg/mL 처리 시 NO 생성량은 IFN-γ50ng/mL 처리 시 보다 증가하여 강한 면역반응을 보였다.
이용하여 관찰하였다. 산더덕 추출물(0.1mg/mL)과 함께 시간별로 배양한 RAW 264.7 세포주에서 total RNA를 추출하여 RT-PCR법으로 iNOS의 mRNA을 증폭시켜 비교하였다. 그 결과, 무처리군에서는 iNOS가 유도되지 않았고, 산더덕 추출물을 처리한 군에서는 시간이 지날수록 iNOS의 발현이 유도되었다(Fig.
대상 데이터
마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 배양은 10% fetal bovine serum(FBS, GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA)과 1%의 antibiotic antimycotic(GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) 이 포함된 RPMI 1640(GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 계대배양하였다.
이론/모형
Cytokine에 의하여 RAW 264.7 세포가 발생하는 nitrite를 측정하기 위하여 griess 반응을 이용하였다. 이 방법은 griess 시약의 diazo기가 nitrite를 만나면 분홍색으로 변하게 되는 색깔반응을 이용한 것이다.
Cytokine에 의하여 생성되는 nitrite가 RAW 264.7 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 방법을 실시하였다. 이 방법은 세포의 미토콘드리아 내 효소인 succinate-dehydrogenase에 의해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)가 formazan으로 전환되는데 세포의 성장이 멈추거나 세포가 죽으면 formazan의 생성이 줄어들게 되는 것을 이용한 것이다.
NO를 생산하는 효소인 iNOS의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR법을 이용하여 관찰하였다. 산더덕 추출물(0.
성능/효과
RAW 264.7 세포의 NO production에 대한 산더덕 추출물의 효과를 실험한 결과 RAW 264.7 세포의 배양액에 추출물의 농도를 달리 하였을 때, Fig. 2와 같이 NO의 생성이 농도 의존적이었다. 산더덕 추출물의 투여 24시간 후, 농도 0.
1mg/mL을 첨가하여 0, 1, 6, 12, 24시간 동안 배양한 후 세포의 RNA를 추출하였다. RT-PCR을 수행하여 cytokine의 mRNA 발현량을 분석한 결과 IL-Iβ와 IL-6 mRNA 발현은 24시간까지 점차적으로 유도되는것을 확인하였다(Fig. 4). 이것은 산더덕 주출물이 proinflammatory cytokine의 중요한 inducer임을 보여준다.
1mg/mL을 첨가하여 0, 1, 6, 12, 24시간 동안 배양한 후 세포의 RNA를 추출하였다. RT-PCR을 수행하여 cytokine의 mRNA 발현량을 분석한 결과 TNF-α의 양은 시간이 지나도 일정함을 알 수 있었다(Fig. 5). 산더덕에 의해 세포 내 일정한 농도를 유지하여 다른 싸이토카인류와 같이 긍정적인 영향을 줄 것으로 예측된다.
7 세포주에서 total RNA를 추출하여 RT-PCR법으로 iNOS의 mRNA을 증폭시켜 비교하였다. 그 결과, 무처리군에서는 iNOS가 유도되지 않았고, 산더덕 추출물을 처리한 군에서는 시간이 지날수록 iNOS의 발현이 유도되었다(Fig. 3). 이 결과로 NO의 생성은 iNOS의 유전자의 발현에 의한 직접적인 생성이라 판단하였다.
산더덕 추출물에 의한 IFN-γ mRNA의 유도를 확인한 결과 IFN-γ mRNA의 발현량은 산더덕 추출물 처리 후 증가하였으며 1시간일 때 가장 높은 발현을 관찰하였다(Fig. 6). 이 결과로 산더덕은 IFN-γ의 즉각적인 발현으로 바이러스에 대한 예방 및 치료기능을 예측할 수 있다.
1과 같다. 산더덕 추출물의 농도의 증가에 따라 세포의 증식의 억제률은 증가하였으며 1mg/mL로 활성화 된 RAW 264.7 세포의 경우 56%까지 세포증식이 억제되었다. NO 생산의 측정을 위해 산더덕 추출물 1mg/mL의 농도로 자극을 주었으며 싸이토카인의 발현을 관찰하기 위해 80%의 세포 성장률을 갖는 농도인 0.
3). 이 결과로 NO의 생성은 iNOS의 유전자의 발현에 의한 직접적인 생성이라 판단하였다.
산더덕 추출물 농도에 따라 NO 생성이 증가됨을 보여 농도 의존적인 면역활성을 관찰하였다. 특히 산더덕 추출물 1mg/mL 처리 시 NO 생성량은 IFN-γ50ng/mL 처리 시 보다 증가하여 강한 면역반응을 보였다.
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