[논문]들깨 메탄올 추출물의 acetylcholinesterase 억제활성 및 세포독성 보호효과

최원희; 엄민영; 안지윤; 김성란; 강명화; 하태열

들깨 메탄올 추출물의 acetylcholinesterase 억제활성 및 세포독성 보호효과
Acetylcholinesterase Inhibitory Activity and Protective Effect against Cytotoxicity of Perilla Seed Methanol Extract 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.36 no.6 = no.178, 2004년, pp.1026 - 1031

최원희 (한국식품연구원 식품기능연구본부) , 엄민영 (한국식품연구원 식품기능연구본부) , 안지윤 (한국식품연구원 식품기능연구본부) , 김성란 (한국식품연구원 식품기능연구본부) , 강명화 (호서대학교 식품영양학과) , 하태열 (한국식품연구원 식품기능연구본부)

초록
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들깨 메탄올 추출물이 acetylcholinesterase(AChE)의 활성 및 PC 12 cell 세포사멸에 미치는 영향을 검토하였다. AChE에 대한 억제환성은 들깨 메탄을 추출물의 농도가 높을수록 유의적으로 높았으며 추출물의 분획물 중에서는 n-butanol층이 가장 높은 억제율을 나타내었다. L-glutamate 또는 ${\beta}-amyloid$ protein $(A{\beta})$으로 유도된 PC 12 cell에 대한 세포사멸 억제효과도 추출물의 농도가 높을수록 유의적으로 증가하였다. 또한 rat brain에 $FeSO_{4^-}H_2O_2$로 산화적 스트레스를 유발시켜 추출물의 TBARS 생성 억제활성을 조사한 결과 들깨 메탄을 추출물은 농도가 높아질수록 산화적 스트레스에 대한 억제활성이 증가하였으며 분획물 중에서는 n-butanol층에서 가장 높은 억제활성을 나타내었다. 이상의 결과들로 미루어 볼 때 들깨 메탄을 추출물은 AChE 활성을 억제하고 glutamate 또는 $A{\beta}$에 의하여 유도된 PC12 cell의 세포사멸을 억제하며 이러한 효과는 들깨 메탄을 추출물의 항산화력에 기인할 수도 있을 것으로 사료되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Acetylcholinesterase inhibitory activity and protective effect against cytotoxicity of PC 12 cell induced by beta-amyloid protein and glutamate were examined in perilla seed methanol extract and its solvent fractions. Methanol extract of perilla seed showed dose-dependent acetylcholinesterase inhibitory activity, with n-butanol fraction showing strongest activity. Perilla seed methanol extract also decreased glutamate- and ${\beta}-amyloid$ protein $(A{\beta})-induced$ cytotoxicities of PC 12 cells dose-dependently. Formation of TBARS induced by $FeSO_{4^-}H_2O_2$ in rat brain was significantly reduced by perilla seed methanol extract, with strongest protective activity formation of TBARS shown in n-butanol fraction. Results suggest perilla seed methanol extract may attenuate actylcholinesterase activity and cytotoxicity induced by glutamate and ${\beta}-amyloid$ protein through suppression of oxidative stress.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

들깨 메탄올 주줄물의 glutamate 또는 AR25-35에 의하여 유도된 세포사멸을 억제하는 효과가 항산화 효과에 의한 것인지의 여부를 검토하기 위하여 rat brain homogenate에 FeSO₄-H₂O₂S 산화적 스트레스를 유발시켜 메탄올 추출물 및 분획물이 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances)의 생성에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 그 결과 0.
들깨 메탄올 추출물이 acetylcholinesterase(AChE)의 활성 및 PC 12 cell의 세포사멸에 미치는 영향을 검토하였다. AChE에대한 억제활성은 들깨 메탄올 추출물의 농도가 높을수록 유의적으로 높았으며 추출물의 분획물 중에서는 "-butan이층이 가장 높은 억제율을 나타내었다.
또한 볶은 들깨의 용매 분획물로부터 토코페롤을 비롯하여 여러 가지의 항산화성분과 스테롤, monoterpene류 등의 특수성분들이 분리됨으로써 이들이 생체내에서 여러 가지 생리활성을 나타낸다고 보고되고 있다(18, 19). 따라서 본 실험에서는 들깨의 이러한 항산화효과에 주목하여, 들깨 추출물에 대하여 뇌속의 콜린성 신경전달물질인 acetylchloine의 수준을 조절하는 AChE 활성 억제효과를 검토하고 L-glutamate 및 Ap으로 유도된 PC₁₂의 세포사멸 억제효과를 검토하고자 하였다.
사멸과 변성을 초래하고 인지기능을 손상시키는 것으로 보고되어 있다(25). 본 실험에서는 PC₁₂ cell에서 glutamate로 유도된 세포독성에 미치는 들깨 메탄올 추출물 및 분획물의 영향을 검토하였다. 우선, glutamate를 첨가하지 않은 경우의 세포생존율을 100%로 보았을 때, glutamate를 10, 20 및 30 mM 수준으로 첨가했을 때의 생존율은 각각 70.

가설 설정

1) Values are mean standard errors.
2) Values with different superscripts within same column are significantly different (p < 0.05).

제안 방법

여액은 모아서 40oC 이하의 감압농축기를 사용하여 농축한 뒤 동결건조하여 메탄올 추출물로 사용하였다. 또한 메탄올 주출액을 silica gel(Merk)을 중진한 open column에 loading하여 극성이 다른 각 용매로 순차적으로 분획하여 감압 농죽하여 hexane 획분, chloroform 획분, ethyl acetate 획분, "-butanol 획분, methanol 획분을 각각 조제하였다. 추출물과 각 분획물은 dimethylsulfbxide(DMSO)로 일정 농도가 되게 녹인 후 분석에 사용하였다.
cell에 있어서 AP?%에 유도된 세포사멸에 대하여 들깨추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. Ap25-35를 첨가하지 않은 경우의 세포생존율을 100%로 보았을 때, 25 μM 의 Ap25-35을 첨가하였을 때에는 64.
3). 들깨 메탄올 추출물이 glutamate 에 의하여 유도된 PC₁₂의 사멸을 억제하는지의 여부를 검토하기 위하여 PC₁₂ 세포에 약 50% 전후의 세포생존율을 나타내는 20mM의 glutamate와 추출물 시료를 동시에 첨가하여 48시간 배양한 후 세포생존율을 측정하여 그 결과를 나타내었다 (Fig. 4). 50卩g/mL의 들깨 메탄올 추출물은 53.
들깨는 정선, 세정하여 건조, 볶음 처리한 다음 착유법으로 탈지하여 시료로 사용하였다. 탈지된 들깨는 분쇄하여 10배(则 v)의 80% 메탄올을 첨가하여 실온에서 150rpm으로 16시간 shaking하여 추출한 뒤 여과지 (Toyo No.
배양 세포들을 96 well plate에 2.5X 104 cell/well 수준으로 접종하여 24시간 후 각각 20mM의 L-glutamate오+ 25 卩M의 Ap25-35를 첨가하여 세포독성을 유발시켰고 각 실험시료를 농도별로 첨가하여 48시간 배양을 시켰다. 배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay에 의하여 측정하였다(21).
즉, 3 mL용 cuvett에 37oC로 보온한 0.1 M phosphate buffer(pH 8.0) 3.0 mL 가하고, 기질용액 0.075 M acetylcholin iodide 20 卩L, 0.01 M dithiobisnitrobenzonic acid (DTNB)/phos-phate buffer(pH 7.0) 100 卩L를 각각 가하여 잘 혼합한 다음 적정농도의 시료를 첨가하고 acetylcholinesterase(Sigma, USA)를 첨가하여 효소반응을 시작하였으며 효소활성도는 412nm에서 효소반응 초기부터 5분간의 흡광도 변화를 측정하여 산출하였다. 시료의 AChE 억제활성도는 시료를 가하지 않은 상태의 효소 활성도에 대한 시료 첨가후의 효소활성도로부터 환산하였다.
배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay에 의하여 측정하였다(21). 즉, 각 well에 0.1 mg의 MTT를 가해주고 다시 37oC에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원 시켜 생성된 formazan을 DMSO를 이용하여 용해시킨 후 micro plate reader(Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540nm에서의 흡광도를 측정하였다. Glutamate 또는 Ap25-35 유래 세포독성에 대한 각 시료의 세포독성 보호능은 대조군의 생존율에 대한 백분율(%)로 나타내었다.
사용하였다. 즉, 뇌조직 균질액에 FeSO₄-H₂O₂와 각 시료를 농도별로 첨가한 후에 37oC에서 20분 incubation한 후, 20% acetic acid 1.5 mL과 8.1% SDS 0.2 mL 그리고 0.8% TBA 1.5 mL을 첨가한 후 100oC에서 20분간 가열하였다. 냉각 후 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리 한 뒤 상층액을 535 nm에서 흡광도를 측정하여 산화적 스트레스 억제활성을 환산하였다.

대상 데이터

Rat(Sprague-Dawley, 웅성, 6주령)의 whole brain을 적출하여 균질화 하여 사용하였고 산화적 스트레스 원으로서는 FeSO₄-H₂O₂ 를 사용하였다. 즉, 뇌조직 균질액에 FeSO₄-H₂O₂와 각 시료를 농도별로 첨가한 후에 37oC에서 20분 incubation한 후, 20% acetic acid 1.
본 실험에서 사용한 들깨(2002년산)는 경상남도 산청군으로부터 구입하였고, P-amyloid protein(Ag25_35), L-glutamate, MTT [3-(4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide] 및 acetylcholinesterase 등은 Sigma(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
본 실험에서 사용한 세포주는 rat pheochromocytoma PC 12로서 ATCC에서 분양받아 사용하였다. 분양받은 세포는 10%의 horse serum(Gibco, NY, USA) 과 5%의 FBS(Gibco, NY, USA), 100 unit/mL penicillin, 100 unit/mL streptomycin이 첨가된 RPMI 1640(Gibco, NY USA)배지를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 포화습도 상의 37oC의 배양기에서 2-3일 마다 medium change를 하고 1주일마다 계대배양을 통하여 실험 사용 시까지 배양하였다.
본 실험에서 사용한 세포주는 rat pheochromocytoma PC 12로서 ATCC에서 분양받아 사용하였다. 분양받은 세포는 10%의 horse serum(Gibco, NY, USA) 과 5%의 FBS(Gibco, NY, USA), 100 unit/mL penicillin, 100 unit/mL streptomycin이 첨가된 RPMI 1640(Gibco, NY USA)배지를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 포화습도 상의 37oC의 배양기에서 2-3일 마다 medium change를 하고 1주일마다 계대배양을 통하여 실험 사용 시까지 배양하였다.

이론/모형

Acetylcholinesterase(AChE)의 활성은 Ellman 등의 방법(20)을 응용하였다. 즉, 3 mL용 cuvett에 37oC로 보온한 0.
5X 104 cell/well 수준으로 접종하여 24시간 후 각각 20mM의 L-glutamate오+ 25 卩M의 Ap25-35를 첨가하여 세포독성을 유발시켰고 각 실험시료를 농도별로 첨가하여 48시간 배양을 시켰다. 배양이 끝난 세포의 생존율은 MTT assay에 의하여 측정하였다(21). 즉, 각 well에 0.

성능/효과

5). 25 卩M의 Ap25-35과 들깨 메탄올 추출물을 첨 가하여 48시간 배양한 후 세포생존율을 조사한 결과(Fig. 6) 주줄물의 첨가농도가 증가할수록 세포생존율이 증가하여 들깨 메탄올 추출물은 AR25-35에 의하여 유도된 세포사멸을 억제하는 것으로 나타났다. 즉, AR(25-35)에 의하여 감소된 세포 생존율은 추출물을 125 卩g/mL 또는 250 卩g/mL 농도로 처 리 함으로써 생존율이 각각 71.
4). 50卩g/mL의 들깨 메탄올 추출물은 53.1%의 생존율을 나타내어 glutamate에 유도된 세포사멸 억제효과가 관찰되지 않았으나 100, 250 및 500卩g/mL 농도의 추출물은 농도가 증가 할수록 생존율이 각각 61.4, 62.8, 69.3%를 나타내어 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 각 용매 분획물을 100 卩g/mL 농도로 첨가하여 glutamate에 의하여 유도되는 세포사멸 억제효과를 조사한 결과(Table 1), glutamate만 처리한 대조군에 비하여 각 분획물 첨가시에는 유의적으로 높은 생존율을 나타내었고 (p <0.
본 실험에서는 PC₁₂ cell에 있어서 AP?%에 유도된 세포사멸에 대하여 들깨추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. Ap25-35를 첨가하지 않은 경우의 세포생존율을 100%로 보았을 때, 25 μM 의 Ap25-35을 첨가하였을 때에는 64.1%의 생존율을 나타냈으며 100 卩M의 농도에서는 50.6%의 생존율을 나타내어 Ap25-35의 농도가 증가할수록 PC₁₂의 생존율이 유의적으로 감소하였다(Fig. 5). 25 卩M의 Ap25-35과 들깨 메탄올 추출물을 첨 가하여 48시간 배양한 후 세포생존율을 조사한 결과(Fig.
S 산화적 스트레스를 유발시켜 메탄올 추출물 및 분획물이 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances)의 생성에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 그 결과 0.5, 1.0, 및 1.5 mg의 들깨 메탄올 추출물을 첨가했을 때의 TBARS 생성 억제활성은 각각 49.0, 66.6 그리고 71.0%로 추출물의 첨가농도가 증가함에 따라서 억제활성이 증가하였다(Fig. 7). 또한 분획물에 대한 TBARS 생성 억제활성을 조사한 결과 chloroform층과 methanol 층에서는 각각 18.
들깨 메탄올 추출물 및 각 용매별 분획물이 AChE 활성에 미치는 영향을 분석한 결과, 추출물의 첨가농도가 높을수록 AChE 억제활성이 유의적으로 증가하였으며 용량 의존적 반응을 나타내었다(Fig. 1). AChE는 acetylcholine을 분해하는 효소로서 뇌중 AChE의 농도가 증가할수록 acetylcholine 함량이 감소하고 amyloid 화합물의 신경독성이 증가하여 치매가 유발될 가능성이 높다고 보고되어 있다(13, 14).
이러한 점에서 볼 때 들깨 메탄올 추출물도 in 切如에서 AChE 활성을 억제하는 작용이 있는 것으로 나타났으며 이는 들깨 메탄올 추출물이 인지기능 개선에 효과적일 가능성을 시사하고 있다. 들깨 메탄올 추출물의 각 용매분획물에 대한 AChE 저해활성을 AChE inhib- itor(22)인 tacrine과 비교한 결과(Fig. 2), 100 nM의 tacrine은 46%의 AChE 억제효과를 나타내었고 전반적으로 메탄올 추출물에서보다 분획물에서 높은 억제 활성을 나타내었다. 분획물 중에서는 n-butan이층에서 59.
3%를 나타내어 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 각 용매 분획물을 100 卩g/mL 농도로 첨가하여 glutamate에 의하여 유도되는 세포사멸 억제효과를 조사한 결과(Table 1), glutamate만 처리한 대조군에 비하여 각 분획물 첨가시에는 유의적으로 높은 생존율을 나타내었고 (p <0.05), 분획물간에는 통계적 유의차는 없었으나 ethyl acetate 및 n- butanol 획분에서 약간 높은 경향을 나타내었다. Probucol, flu- pirtine, retigabine, vitamin E 등의 항산화제는 glutamate에 의해 유도된 PC₁₂ 세포의 세포독성을 완화시킬 수 있다는 연구가 많이 보고 되어 있으며(25-27) 이러한 항산화제들은 glutamate 등에 의한 지질과산화물, fee radical의 생성 등으로 인한 oxi dative stress로부터 세포를 보호하는 작용을 한다고 알려져 있다 (28, 29).
2), 100 nM의 tacrine은 46%의 AChE 억제효과를 나타내었고 전반적으로 메탄올 추출물에서보다 분획물에서 높은 억제 활성을 나타내었다. 분획물 중에서는 n-butan이층에서 59.8%但 가장 높은 억제율을 보였고 다음으로 ethyl acetate, chloroform의 순으로 나타났으나 metha- no회분은 약 10%로서 가장 낮은 AChE 억제효과를 나타내었 匸+. 들깨에는 phenolic compound, 스테롤, monoterpene류 등의 특수성분이 함유되어 있다고 보고되어 있으나(18, 19) AChE 억제효과와의 연관성에 대해서는 향후 높은 활성을 보였던 n- butanol 획분을 중심으로 AChE 억제활성을 나타내는 물질의 확인, 구조 등에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
본 실험에서는 PC₁₂ cell에서 glutamate로 유도된 세포독성에 미치는 들깨 메탄올 추출물 및 분획물의 영향을 검토하였다. 우선, glutamate를 첨가하지 않은 경우의 세포생존율을 100%로 보았을 때, glutamate를 10, 20 및 30 mM 수준으로 첨가했을 때의 생존율은 각각 70.3%, 52.5% 그리고 17.6%로 감소하여 glutamate의 농도가 증가할수록 PC₁₂ 의 생존율이 감소하였다(Fig. 3). 들깨 메탄올 추출물이 glutamate 에 의하여 유도된 PC₁₂의 사멸을 억제하는지의 여부를 검토하기 위하여 PC₁₂ 세포에 약 50% 전후의 세포생존율을 나타내는 20mM의 glutamate와 추출물 시료를 동시에 첨가하여 48시간 배양한 후 세포생존율을 측정하여 그 결과를 나타내었다 (Fig.
한편, Yan 등(36)의 연구에서는 PC 12 cell을 AR에 노출시켰을 때 reactive oxygen species(ROS) 형성이 증가하는 것으로 나타났으며, Choi 등(35)은 rat의 hippocampal neuron에AR을 처리함으로서 지질 과산화물이 증가한다고 보고하였다. 이러한 점들로 미루어 볼 때, 들깨 메탄올 추출물은 PC12 cell 에서 glutamate 또는 A§에 의하여 유도된 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 작용에 의하여 세포사멸을 억제하는 것으로 사료되었다.
Tacrine, donepezil, rivastigmine 등의 AChE inhibitor를 인지기능이 손상된 환자에게 투여함으로서 뇌중의 acetylcholine 함량을 증가시켰고 이는 곧 알츠하이머병 환자들에게서 인지기능과 학습기능의 개선이 있었다는 많은 연구보고(22-24)가 있다. 이러한 점에서 볼 때 들깨 메탄올 추출물도 in 切如에서 AChE 활성을 억제하는 작용이 있는 것으로 나타났으며 이는 들깨 메탄올 추출물이 인지기능 개선에 효과적일 가능성을 시사하고 있다. 들깨 메탄올 추출물의 각 용매분획물에 대한 AChE 저해활성을 AChE inhib- itor(22)인 tacrine과 비교한 결과(Fig.
또한 rat brain 에 FeSO₄-H₂O₂로 산화적 스트레스를 유발시켜 추출물의 TBARS 생성 억제활성을 조사한 결과 들깨 메탄올 추출물은 농도가 높아질수록 산화적 스트레스에 대한 억제활성이 증가하였으며 분획물 중에서는 "butan이층에서 가장 높은 억제활성을 나타내었다. 이상의 결과들로 미루어 볼 때 들깨 메탄올 추출물은 AChE 활성을 억제하고 glutamate 또는 A§에 의하여 유도된 PC₁₂ cell의 세포사멸을 억제하며 이러한 효과는 들깨 메탄올 추출물의 항산화력에 기인할 수도 있을 것으로 사료되었다.
6) 주줄물의 첨가농도가 증가할수록 세포생존율이 증가하여 들깨 메탄올 추출물은 AR25-35에 의하여 유도된 세포사멸을 억제하는 것으로 나타났다. 즉, AR(25-35)에 의하여 감소된 세포 생존율은 추출물을 125 卩g/mL 또는 250 卩g/mL 농도로 처 리 함으로써 생존율이 각각 71.3, 79.1%로 증가하였다(p <0.05, p <0.01). AR에 의한 신경세포의 사멸에 대한 기전은 1) Ca2+4 心 세포내 항상성의 파괴 (30-31) 2) 산화적 stress(8-9) 3) proapoptotic bax의 upreg ulation 및 neuroprotective Bcl의 downregulation(32-33) 등이 제안되고 있으며 resveratrol(34), green tea catechin(35), ferulicacid(36)와 같은 천연 항산화제 등은 AR에 의한 세포사멸을 억제한다고 알려져 있다.
AR에 의한 신경세포의 사멸에 대한 기전은 1) Ca2+4 心 세포내 항상성의 파괴 (30-31) 2) 산화적 stress(8-9) 3) proapoptotic bax의 upreg ulation 및 neuroprotective Bcl의 downregulation(32-33) 등이 제안되고 있으며 resveratrol(34), green tea catechin(35), ferulicacid(36)와 같은 천연 항산화제 등은 AR에 의한 세포사멸을 억제한다고 알려져 있다. 한편, 들깨 메탄올 추출물의 각 용매 분획 물 100 卩g/mL을 AR25-35 25 |1M과 동시 에 첨 가하여 세 포 생존율을 조사한 결과(Table 1) 각 분획물들은 AR25-35에 의하여 유도된 세포사멸에 대하여 뚜렷한 억제효과가 §锂나지 않았다. 이는 들깨 메탄올 추출물의 효과가 어떤 단일 성분에 의한 것이 아니라 여러 성분의 상승효과에 의할 가능성도 배제할 수 없으며 이에 대한 향후의 심도 있는 연구가 요구된다.

후속연구

8%但 가장 높은 억제율을 보였고 다음으로 ethyl acetate, chloroform의 순으로 나타났으나 metha- no회분은 약 10%로서 가장 낮은 AChE 억제효과를 나타내었 匸+. 들깨에는 phenolic compound, 스테롤, monoterpene류 등의 특수성분이 함유되어 있다고 보고되어 있으나(18, 19) AChE 억제효과와의 연관성에 대해서는 향후 높은 활성을 보였던 n- butanol 획분을 중심으로 AChE 억제활성을 나타내는 물질의 확인, 구조 등에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
한편, 들깨 메탄올 추출물의 각 용매 분획 물 100 卩g/mL을 AR25-35 25 |1M과 동시 에 첨 가하여 세 포 생존율을 조사한 결과(Table 1) 각 분획물들은 AR25-35에 의하여 유도된 세포사멸에 대하여 뚜렷한 억제효과가 §锂나지 않았다. 이는 들깨 메탄올 추출물의 효과가 어떤 단일 성분에 의한 것이 아니라 여러 성분의 상승효과에 의할 가능성도 배제할 수 없으며 이에 대한 향후의 심도 있는 연구가 요구된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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